頂空氣相色譜法測定阿米舒必利中有機溶劑殘留量

1、Application Note: CM0029頂空氣相色譜法測定阿米舒必利中有機溶劑殘留量朱曼潔賽默飛世爾科技（中國）有限公司趙政華東師范大學腦功能研究所1. 前言3. 結(jié)果與討論人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調(diào)會議( International3.1系統(tǒng)適應性Conference of Harmonizition ICH)對藥品殘留溶劑有明確的因待測藥品的殘留溶劑主要是甲醇和丙酮，因此選擇定義以及相關的指導原則。ICH 將藥品生產(chǎn)及純化過上述 2種有機溶劑，溶解在DMF中考察系統(tǒng)適用性，典程中常用的 69 種有機溶劑按照對人體和環(huán)境的危害程型色譜圖見圖 1。結(jié)果顯示，在上述色譜條件下，各度分為

2、 4類。第 I類溶劑是指已知可以致癌并被強烈懷溶劑分離完全。疑對人和環(huán)境有害的溶劑, 其殘留量必須控制在規(guī)定的范圍內(nèi)；第II類溶劑是指無基因毒性但有動物致癌性的溶劑；第3類溶劑是指對人體低毒的溶劑；第4類是尚無足夠毒理學資料的溶劑（1-3）。阿米舒必利在提取過程中使用了有機溶劑甲醇和丙酮，按照上述指導原則，甲醇為第二類溶劑，其含量不能超過 0.3%；丙酮為第三類溶劑，其含量不能超過0.5%。本文介紹了用賽默飛世爾氣相色譜儀(帶 FID檢測器 )和Triplus頂空自動進樣器分析阿米舒必利中這兩種有機溶劑殘留的分析方法，方法學的驗證表明，該方法準確有效。2. 實驗方法2.1 儀器和試劑Trace

3、 GC氣相色譜儀（賽默飛世爾科技Thermo FisherScientific公司），帶 FID檢測器；色譜柱為TR-V1 (30m x.25 mm x 3 ；Triplusm) HS自動進樣器（賽默飛世爾科技 Thermo Fisher Scientific公司）甲醇和丙酮 (色譜純 )購置于 sigma公司； N， N-二甲基甲酰胺 (DMF，分析純 )。2.2 色譜條件程序升溫：初始溫度:40 (60 min), 升溫速率 :30 /min至200 （ 3min）載氣：恒流模式，流速為 3ml/min進樣口： 150，分流進樣，分流比為10： 1檢測器溫度： 250頂空參數(shù)設置：孵化器溫

4、度：75孵化時間： 30min進樣量： 1ml圖13.2 頂空參數(shù)優(yōu)化孵化器溫度分別取 5mg甲醇和丙酮，溶于一定量的 DMF中，使溶液的最終體積為 5ml。平行制備 4份相同濃度的待測樣品，將孵化器的溫度分別設置為65， 75，85和 95，以此判斷不同孵化時間對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果（如圖2）表明，隨著孵化溫度的升高，丙酮的峰面積也在增加，但是甲醇的響應卻是在75時為最高，這與國家藥典中推薦的孵化溫度相一致（ 75 85）。并且，由于阿米舒必利的化學名為4-氨基 -N-(1-乙基 -2-吡咯 )甲基 -5-已砜基 -2-甲氧基苯甲酰胺，黃仕璋等(4) 通過研究表明，含甲氧基的樣品在較高頂空溫

5、度下降解產(chǎn)生甲醇，而裂解速率主要受溫度影響，隨著樣品孵化溫度的增高，甲醇的含量也會顯著的增高，因而影響了真實的檢測結(jié)果。因此在檢測時，我們將孵化器的溫度設為75。圖 2孵化時間分別取 5mg甲醇和丙酮，溶于一定量的DMF中，使溶液的最終體積為5ml。平行制備4份相同濃度的待測樣品，將孵化器的溫度分別設置為10min，20min， 30min和 40min，以此判斷不同孵化時間對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果（如圖 3）表明，隨著孵化時間的升高，丙酮和甲醇的峰面積均變化不大，考慮到樣品中的有機溶劑可能需要較長的時間才有利于其揮發(fā)，因此我們將孵化時間設為 20min。圖 33.3標準曲線、檢出限和精密度本方

6、法采用外標法定量，由于做頂空進樣，考慮到不同樣品體積對氣體的膨脹有影響，所以這里以目標組分的峰面積Y對相應組分的絕對重量做標準曲線（ 5mg、 1mg、 500ug、 100ug和50ug），圖 4A和B顯示，在這個儀器方法上甲醇和丙酮都有非常好的線性關系。以 500ug為例，按信噪比為 3計算得到甲醇的檢出限為 1.5ug, 丙酮的檢出限 1ug。配置甲醇和丙酮均為500ug平行的標樣 5個，計算方法的重現(xiàn)性，得到甲醇的RSD值為 3.76%，丙酮的 RSD值為 1.39。3.4樣品檢測精密稱取 1g樣品，用 10ml容量瓶定容，取5ml放入頂空瓶中，按照上述方法進行樣品檢測，每個樣品平行進

7、四次（譜圖如圖5所示），結(jié)果如下表所示。按照ICH的標準，甲醇的為第二類溶劑，含量不能超過0.3%，丙酮屬于第三類溶劑，含量不能超過0.5%，待測樣品中的溶劑殘留經(jīng)檢測分別為甲醇0.004%和丙酮 0.05%，符合 ICH的標準。圖 53.5 回收率實驗精密稱取上述樣品粉末0.5g，準確加入500ug甲醇和丙酮，最后用DMF定容到 5ml，之后進行樣品檢測，每個樣品測定三次(樣品加標如圖6所示 )，最終測得甲醇和丙酮的平均回收率分別為98.4%和 101.7%。圖 63.6 注意事項所有樣品溶解以及標樣配置的過程需在冰上進行操作，防止有機溶劑揮發(fā)所引起的結(jié)果誤差。參考文獻：1. 周海鈞主譯 1 藥品注冊的國際技術要求 ? 質(zhì)量部分M 北京：人民衛(wèi)生出版社 , 2000： 82 2. 中國藥典 S . 二部 , 2000：附錄 543. Residual Solvent Testing: A Review of Gas-Chromatographic and Alternative Techniques. Pharmaceutical Research, 2003, 20(3):