HBVDNA檢測(cè)在乙肝治療中的應(yīng)用

1、為什么進(jìn)行為什么進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)檢測(cè)HBV DNA檢測(cè)帶給我們的益處檢測(cè)帶給我們的益處目前目前HBV DNA的檢測(cè)方法的檢測(cè)方法羅氏羅氏COBAS Amplicor系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)新一代技術(shù)新一代技術(shù)COBAS TaqMan主要內(nèi)容主要內(nèi)容乙型肝炎：全球性的健康問題乙型肝炎：全球性的健康問題 目前HBV攜帶者超過 350 million 2540% HBsAg 陽性人群會(huì)死于肝硬化或肝癌 全球350 million HBV 攜帶者, 75% 在亞洲中表面抗原中表面抗原（S+preS2）核蛋白殼核蛋白殼HBcAg (HBeAg)DNA聚合酶聚合酶膜蛋白膜蛋白基因組基因組 DNA小表面抗

2、原小表面抗原HBsAg (S)RNA 引物引物大表面抗原大表面抗原（S+preS2+preS1)乙肝病毒顆粒示意圖乙肝病毒顆粒示意圖慢性乙肝檢測(cè)指標(biāo)慢性乙肝檢測(cè)指標(biāo) HBsAg 確定慢性乙肝 HBeAg/ anti-HBe 區(qū)分感染的不同時(shí)期 HBV 聚合酶 檢測(cè)病毒的酶活性 HBV DNA 檢測(cè)病毒載量 (病毒轉(zhuǎn)錄活性) HBcAg 檢測(cè)病毒蛋白 (病毒翻譯活性) HBV HBV 病毒基因病毒基因慢性乙型肝炎慢性乙型肝炎暴露后時(shí)間暴露后時(shí)間滴度滴度ALTAnti-HBcSymptoms 5 601234 6 71 2 345 8 9 10HBsAgHBeAg月月年年HBV DNAAnti-H

3、Be慢性乙肝的三種臨床表現(xiàn)慢性乙肝的三種臨床表現(xiàn)HBeAg 陽性慢性乙肝 HBeAg, ALT升高, HBV-DNA 107 to 1011 拷貝每毫升 ， 病理切片指征明顯HBeAg 陰性慢性乙肝 Anti-HBe, ALT升高 ， HBV-DNA 104 to 108拷貝每毫升 ,病理切片指征明顯HBsAg 陰性攜帶期 Anti-HBe, ALT正常, HBV-DNA 2ULN, 要考慮治療要考慮治療 治療期間，治療期間， ALT、 e抗原和抗原和HBV-DNA至少每至少每3個(gè)月檢測(cè)一次個(gè)月檢測(cè)一次 亞太乙肝防治共識(shí)亞太乙肝防治共識(shí)20032003Journal of Gastroente

4、rology and Hepatology (2003) 18, 239245 抗病毒一般適應(yīng)癥主要指標(biāo)：抗病毒一般適應(yīng)癥主要指標(biāo)：HBV DNA 105 拷貝拷貝/mL 病毒學(xué)應(yīng)答重要指標(biāo)包括血清病毒學(xué)應(yīng)答重要指標(biāo)包括血清HBV，DNA 檢測(cè)不到檢測(cè)不到 (PCR 法法)或低于檢測(cè)下限，或較基線下降或低于檢測(cè)下限，或較基線下降2log10中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)/ /中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì)中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì)慢性乙肝防治指南慢性乙肝防治指南http:/ DNA檢測(cè)檢測(cè)HBV DNA檢測(cè)帶給我們的益處檢測(cè)帶給我們的益處目前目前HBV DNA的檢測(cè)方法的檢測(cè)方法羅氏羅氏COBAS

5、Amplicor系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)新一代技術(shù)新一代技術(shù)COBAS TaqMan主要內(nèi)容主要內(nèi)容HBV DNA檢測(cè)帶給我們的益處檢測(cè)帶給我們的益處 監(jiān)測(cè)抗病毒治療效果 早期確定病毒學(xué)應(yīng)答預(yù)測(cè)治療后反應(yīng) (HBsAg 消失) 預(yù)測(cè)耐藥突變 預(yù)測(cè)肝移植后復(fù)發(fā) 檢測(cè)HBsAg 攜帶者的病毒的活動(dòng)情況指標(biāo)正常指標(biāo)正常/ HBeAg 陽性陽性 (n.31) anti-HBe 陽性陽性 (n. 15)轉(zhuǎn)陰轉(zhuǎn)陰ALT 12 7HBeAg 12 NDdot-blot hybridization. 12 7IgM anti-HBc ND 5Amplicor HBV Monitor 5 2HBsAg 3 2經(jīng)治療

6、生化指標(biāo)正常病人中病毒清除率經(jīng)治療生化指標(biāo)正常病人中病毒清除率治療中治療中/后，應(yīng)答者與不應(yīng)答者后，應(yīng)答者與不應(yīng)答者HBV DNA水平的比較水平的比較baseline1-3wks4-7wks8-11wks12-15wks16-24wks0-5mths6-11mths12-18mths1x1021x1041x1061x1081x1010HBV DNA levelscopies /mlmean SEMp=0.07p=0.2p0.01p0.001p0.001p0.001p0.001p0.001p0.001-不應(yīng)答者-應(yīng)答者-治療中治療后監(jiān)測(cè)抗病毒治療，預(yù)測(cè)耐藥監(jiān)測(cè)抗病毒治療，預(yù)測(cè)耐藥Puchhamm

7、er-Stockl E. at al. J Infect Dis 181:2063, 2000HBV DNA 載量顯示攜帶者處于活動(dòng)或非活載量顯示攜帶者處于活動(dòng)或非活動(dòng)狀態(tài)動(dòng)狀態(tài)HBV DNA copies/mlManesis K. et al.Gastroenterology 122 (7): 2092-3, 2002.1.E+021.E+031.E+041.E+051.E+061.E+071.E+081.E+09非活動(dòng)狀態(tài)非活動(dòng)狀態(tài)活動(dòng)狀態(tài)活動(dòng)狀態(tài)HBV DNA載量在肝移植中的應(yīng)用載量在肝移植中的應(yīng)用 在肝移植中在肝移植中 (Liver Transplantation)為防治肝移植后的復(fù)發(fā)

8、所采取的預(yù)防性治療需要達(dá)到HBV DNA 95% 檢出率 線性范圍 300- 200,000 copies/mL 同等定量亞型 A-F 血清或血漿 100 ul 樣本 6 小時(shí)檢測(cè)時(shí)間, 30 分鐘手工準(zhǔn)備 內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn) 防污染系統(tǒng)COBAS Amplicor VS bDNACOBAS Amplicor vs bDNACOBAS Amplicor vs bDNACOBAS Amplicor vs bDNACobas AmplicorbDNA標(biāo)本準(zhǔn)備乙醇沉淀磁珠吸附擴(kuò)增靶序列光信號(hào)線性范圍300200,0002000-100,000,000 特異性100%99.2%（96-98%)亞

9、型AFAF污染控制有無定量方案內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品外部標(biāo)準(zhǔn)曲線Control數(shù)量3個(gè)12個(gè)報(bào)告時(shí)間8小時(shí)24小時(shí)COBAS Amplicor HBV 靈敏度靈敏度vs 其它測(cè)試其它測(cè)試?- 預(yù)測(cè)反跳？預(yù)測(cè)反跳？- 預(yù)測(cè)突變？預(yù)測(cè)突變？- 預(yù)測(cè)肝移植復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)？預(yù)測(cè)肝移植復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)？其他測(cè)試的靈敏度其他測(cè)試的靈敏度COBAS Amplicor HBV 靈敏度靈敏度1101001,00010,000100,0001,000,00010,000,000100,000,000048122024Weeks of therapyHBVDNA copies/mL為什么進(jìn)行為什么進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)檢測(cè)HBV DNA檢測(cè)

10、帶給我們的益處檢測(cè)帶給我們的益處目前目前HBV DNA的檢測(cè)方法的檢測(cè)方法羅氏羅氏COBAS Amplicor系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)新一代技術(shù)新一代技術(shù)COBAS TaqMan主要內(nèi)容主要內(nèi)容COBAS TaqMan 實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)熒光檢測(cè)系統(tǒng)COBAS TaqMan特點(diǎn)及益處特點(diǎn)及益處 動(dòng)態(tài)動(dòng)態(tài) PCR 整合定量標(biāo)準(zhǔn)，不需外標(biāo)準(zhǔn)曲線整合定量標(biāo)準(zhǔn)，不需外標(biāo)準(zhǔn)曲線 檢測(cè)管封閉，無需開蓋檢測(cè)管封閉，無需開蓋 四色熒光通道四色熒光通道 (計(jì)劃升級(jí)到六色計(jì)劃升級(jí)到六色) 檢測(cè)管檢測(cè)管: k-tube or k-plate 寬廣的動(dòng)力學(xué)范圍寬廣的動(dòng)力學(xué)范圍 連續(xù)檢測(cè)連續(xù)檢測(cè) 檢測(cè)時(shí)間從檢測(cè)時(shí)間從6小

11、時(shí)減少到小時(shí)減少到23小時(shí)小時(shí) 增加通量增加通量 提供內(nèi)質(zhì)控提供內(nèi)質(zhì)控 減少污染風(fēng)險(xiǎn)減少污染風(fēng)險(xiǎn) 允許多重允許多重PCR靶標(biāo)檢測(cè)靶標(biāo)檢測(cè) 可用于其他檢測(cè)模式可用于其他檢測(cè)模式 (雜交探針雜交探針) 處理過程簡(jiǎn)單處理過程簡(jiǎn)單 可與可與AmpliPrep聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化益益 處處特特 點(diǎn)點(diǎn)COBAS TaqMan定量原理定量原理0510152025300102030405060相對(duì)熒光強(qiáng)度相對(duì)熒光強(qiáng)度None1ThresholdCycle Threshold (Ct)for 108 C/PCRHBV DNALog C/PCR2876543循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)COBAS TaqMan HBV

12、檢測(cè)線性范圍檢測(cè)線性范圍COBAS TaqMan HBV檢測(cè)各亞型表檢測(cè)各亞型表現(xiàn)現(xiàn)COBAS TaqMan HBV Test vs CA HBMCOBAS TaqMan HBV TestCOBAS AMPLICOR HBV Monitor TestReporting UnitIU/mL(5.82 copies/IU)Copies/mLLinearity6 1.10E8300 2.00E5Sample Volume500 uL100 uLTargetPre-core/CoreSameSample TypeEDTA Plasma & SerumSameGenotypesA G, pre-core

13、 mutantA - E, limited F, GRun Size48 tests24 testsSerial DilutionsNone1:10感謝感謝慢性乙肝的三種臨床表現(xiàn)慢性乙肝的三種臨床表現(xiàn)HBeAg 陽性慢性乙肝 HBeAg, ALT升高, HBV-DNA 107 to 1011 拷貝每毫升 ， 病理切片指征明顯HBeAg 陰性慢性乙肝 Anti-HBe, ALT升高 ， HBV-DNA 104 to 108拷貝每毫升 ,病理切片指征明顯HBsAg 陰性攜帶期 Anti-HBe, ALT正常, HBV-DNA 101 to 104拷貝每毫升 ,病理切片變化極小EASL（歐洲肝病學(xué)會(huì)

14、）（歐洲肝病學(xué)會(huì)）將顯著的復(fù)制水平定為HBV-DNA 10 5 拷貝每毫升 抗病毒一般適應(yīng)癥主要指標(biāo)：抗病毒一般適應(yīng)癥主要指標(biāo)：HBV DNA 105 拷貝拷貝/mL 病毒學(xué)應(yīng)答重要指標(biāo)包括血清病毒學(xué)應(yīng)答重要指標(biāo)包括血清HBV，DNA 檢測(cè)不到檢測(cè)不到 (PCR 法法)或低于檢測(cè)下限，或較基線下降或低于檢測(cè)下限，或較基線下降2log10中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)/ /中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì)中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì)慢性乙肝防治指南慢性乙肝防治指南http:/ DNA水平的比較水平的比較baseline1-3wks4-7wks8-11wks12-15wks16-24wks0-5mths6-

15、11mths12-18mths1x1021x1041x1061x1081x1010HBV DNA levelscopies /mlmean SEMp=0.07p=0.2p0.01p0.001p0.001p0.001p0.001p0.001p0.001-不應(yīng)答者-應(yīng)答者-治療中治療后監(jiān)測(cè)抗病毒治療，預(yù)測(cè)耐藥監(jiān)測(cè)抗病毒治療，預(yù)測(cè)耐藥Puchhammer-Stockl E. at al. J Infect Dis 181:2063, 2000HBV DNA 載量顯示攜帶者處于活動(dòng)或非活載量顯示攜帶者處于活動(dòng)或非活動(dòng)狀態(tài)動(dòng)狀態(tài)HBV DNA copies/mlManesis K. et al.Gastroenterology 122 (7): 2092-3, 2002.1.E+021.E+031.E+041.E+051.E+061.E+071.E+081.E+09非活動(dòng)狀態(tài)非活動(dòng)狀態(tài)活動(dòng)狀態(tài)活動(dòng)狀態(tài)目前目前HBV DNA的檢測(cè)方法的檢測(cè)方法 羅氏COBAS Amplicor HB