第五章分子生物學(xué)研究法(上)2

1、分子生物學(xué)基本研究法（上）分子生物學(xué)基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)及蛋白質(zhì)操作技術(shù)第五章 扉頁：扉頁： 當(dāng)你進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，要像脫去外衣那樣放下你當(dāng)你進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作中不能有一丁點(diǎn)兒的想象，的想象力，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作中不能有一丁點(diǎn)兒的想象，否則，你對事物的觀察就會受影響；當(dāng)你翻開書本否則，你對事物的觀察就會受影響；當(dāng)你翻開書本的時(shí)候，你又必須盡可能展開想象的的時(shí)候，你又必須盡可能展開想象的“翅膀翅膀”，否，否則，你就不可能走在別人的前面。則，你就不可能走在別人的前面。RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)真核生物基因組真核生物基因組DNA龐大，有大量

2、重復(fù)序列，很難直龐大，有大量重復(fù)序列，很難直接分離得到靶基因片段。而接分離得到靶基因片段。而cDNA來自反轉(zhuǎn)錄的來自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選，無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快文庫，可較快地分離到相關(guān)基因。地分離到相關(guān)基因。Trizol總總RNA提取試劑提取試劑 TIANGEN rRNA電泳后的三條特征性條帶電泳后的三條特征性條帶28S、18S、5S (特別是特別是28S和和18S特征性條帶特征性條帶) 是鑒定總是鑒定總RNA純度純度和完整性的重要參數(shù)。和完整性的重要參數(shù)。RNA的抽提方法RNA Extraction by TRIzol使用BioSpcetrometer分光

3、光度計(jì)進(jìn)行快速檢測核酸mRNA Extraction from Cell CulturemRNA Extraction from Tissue5.32. mRNA的純化 寡聚（寡聚（dT）纖維素柱色譜法：）纖維素柱色譜法： 利用利用mRNA3端含有端含有PolyA+的特點(diǎn)，當(dāng)?shù)奶攸c(diǎn)，當(dāng)RNA流經(jīng)寡聚流經(jīng)寡聚dT纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，用下，mRNA被特異性地結(jié)合在柱上，再用被特異性地結(jié)合在柱上，再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經(jīng)過兩次此。經(jīng)過兩次此柱可得到較高純度的柱可得到較高純度的mRNA.圖圖5-14PolyATtractmRNA

4、的分離的分離純化過程簡圖。純化過程簡圖。每個Oligotex Kit 包括用于結(jié)合poly A+ mRNA的Oligotex 樹脂，和用于洗滌、洗脫結(jié)合的mRNA的離心柱。Oligotex mRNA Kits可從總RNA中純化mRNA，回收poly A+體外轉(zhuǎn)錄子。Oligotex Direct mRNA Kits 可從細(xì)胞和組織中純化mRNA。mRNA Extraction from Total RNA5.3.3 cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）：在體外以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶合成的一段雙鏈DNA。cDNA 的合成5.3.4 cDNA文庫的構(gòu)

5、建 cDNA文庫：文庫：是指將某種生物體基因組轉(zhuǎn)是指將某種生物體基因組轉(zhuǎn)錄的全部錄的全部mRNAmRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNAcDNA片段片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNAcDNA文庫。文庫。基因文庫的建立基因組基因組DNADNA文庫文庫cDNAcDNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫與文庫與cDNAcDNA文庫的比較文庫的比較基因組文庫與基因組文庫與cDNA文庫的差別文庫的差別 基因組文庫中包含了所有基因，而基因組文庫中包含了所有基因，而cDNA文庫只包含表達(dá)的文庫只包

6、含表達(dá)的基因，缺乏內(nèi)含子和調(diào)控序列，在研究基因結(jié)構(gòu)時(shí)用處不大基因，缺乏內(nèi)含子和調(diào)控序列，在研究基因結(jié)構(gòu)時(shí)用處不大 cDNA文庫代表了文庫代表了mRNA的來源，轉(zhuǎn)錄本在豐度上有差別，的來源，轉(zhuǎn)錄本在豐度上有差別，而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列 不同細(xì)胞類型制備的不同細(xì)胞類型制備的cDNA文庫包含一些共同序列和獨(dú)特序文庫包含一些共同序列和獨(dú)特序列，可用于分離差別表達(dá)的基因，基因組文庫中不能列，可用于分離差別表達(dá)的基因，基因組文庫中不能 基因組文庫由于含有不表達(dá)序列，比基因組文庫由于含有不表達(dá)序列，比cDNA文庫大文庫大 mRNA在不同組織之

7、間存在豐度差異，因此在不同組織之間存在豐度差異，因此cDNA文庫在構(gòu)文庫在構(gòu)建時(shí)對于建時(shí)對于mRNA含量較少的就比較困難，而基因組文庫不存含量較少的就比較困難，而基因組文庫不存在這樣的問題在這樣的問題5.3.5 基因文庫的篩選基因文庫的篩選5.3.5.1 核酸雜交法5.3.5.2 PCR篩選法5.4 SNP的理論與應(yīng)用 SNP的定義定義：單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphism，SNP) 主要是指在基因組DNA序列中由于單個核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。 是第三代遺傳標(biāo)記。5.4.1 SNP概述 單倍型：是指位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)

8、。 SNP分類： cSNP 同義cSNP 非同義cSNP pSNP rSNP5.4.2 SNP的檢測技術(shù)傳統(tǒng)的傳統(tǒng)的SNP檢測方法使用的技術(shù)主要有：檢測方法使用的技術(shù)主要有： 限制性酶切片段長度多態(tài)性（限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）；）； PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性（單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCRSSCP）；）； 毛細(xì)管電泳；毛細(xì)管電泳； 變性高效液相色譜（變性高效液相色譜（DHPLC）等。）等。目前獲得新的目前獲得新的SNP最常見的方法是：最常見的方法是： 通過通過DNA測序法測序法2.5.2.1 基因芯片技術(shù) 是在固相支持介質(zhì)上進(jìn)行分子雜交和原位熒光檢測的一種高通量SNP分析方法。 通過激光掃描，

9、可根據(jù)熒光強(qiáng)弱或熒光的種類檢測出被檢序列的堿基類別。 優(yōu)點(diǎn)：高通量優(yōu)點(diǎn)：高通量 一次可對多個一次可對多個SNP進(jìn)行規(guī)模性篩選進(jìn)行規(guī)模性篩選 被檢起始材料少被檢起始材料少 操作步驟簡單操作步驟簡單 缺點(diǎn)：芯片設(shè)計(jì)成本高缺點(diǎn)：芯片設(shè)計(jì)成本高 若樣品復(fù)雜，有些若樣品復(fù)雜，有些SNP不能被檢出不能被檢出5.4.2.2 Taqman 技術(shù)5.4.2.3 分子信標(biāo)技術(shù) 分子信標(biāo)：是一種呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)分子信標(biāo)：是一種呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記的寡核苷酸，環(huán)狀的熒光標(biāo)記的寡核苷酸，環(huán)狀區(qū)與靶序列特異性結(jié)合，莖干區(qū)與靶序列特異性結(jié)合，莖干區(qū)由區(qū)由58個堿基組成，個堿基組成，5帶有帶有熒光發(fā)生基團(tuán)，熒光發(fā)生基團(tuán)，3帶有熒光

10、猝帶有熒光猝滅基團(tuán)。自由狀態(tài)時(shí)，發(fā)生熒滅基團(tuán)。自由狀態(tài)時(shí)，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，無熒光；當(dāng)光共振能量轉(zhuǎn)移，無熒光；當(dāng)分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合時(shí)可檢分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合時(shí)可檢測到熒光。測到熒光。5.4.2.4 焦磷酸測序法(Pyrosequencing ) 四種酶催化的酶級聯(lián)反應(yīng)四種酶催化的酶級聯(lián)反應(yīng):DNA :DNA 聚合酶、硫聚合酶、硫酸化酶酸化酶( (ATP sulfurylaseATP sulfurylase) ) 、熒光素酶熒光素酶( (luciferaseluciferase) ) 和和雙磷酸酶雙磷酸酶( ( apyrase) apyrase) 。 反應(yīng)底物：反應(yīng)底物：APSAPS和熒光素和熒光素（luciferinluciferin） 原理：原理：DNA DNA 聚合酶在一種聚合酶在一種dNTPdNTP的存在下進(jìn)的存在下進(jìn)行引物延