微量中和實(shí)驗(yàn)齊立

1、流感病毒微量中和實(shí)驗(yàn)技術(shù) 采集臨床標(biāo)本 采集急性期和恢復(fù)期雙份血清 快速診斷 病毒分離 RT-PCR HAI 或微量中和實(shí)驗(yàn) 試劑盒 （MDCK 或 EGG） 測(cè)序 CPE + HA + HAI (WHO FLU H5 KIT)直接進(jìn)行抗原檢測(cè)疫情爆發(fā)微量中和實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì) 一、傳統(tǒng)的流感病毒中和實(shí)驗(yàn)主要基于對(duì)MDCK細(xì)胞病變抑制作用觀察，即費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。結(jié)合感染細(xì)胞快速鑒定方法，改進(jìn)后的中和實(shí)驗(yàn)可以在兩天內(nèi)完成，并可一次測(cè)定大量血清樣品 二、微量中和試驗(yàn)技術(shù)已被成功應(yīng)用于檢測(cè)血清中抗流感病毒甲5型抗體，并可以推廣用于檢測(cè)血清中其它抗禽流感病毒亞型中和抗體水平，其敏感性高于血凝抑制試驗(yàn)。 三、由于人

2、群中缺乏抗禽流感病毒特異性抗體，因此，檢測(cè)單份血清即可反映人群的免疫狀態(tài)。但是當(dāng)診斷可疑病患時(shí)，則需要同時(shí)檢測(cè)急性期和恢復(fù)期雙份血清中的中和抗體滴度，若恢復(fù)期血清抗體水平高于急性期（4倍）即可確立診斷。實(shí)驗(yàn)原理1抗原抗體之間的中和反應(yīng)1：20 DILUTION1：40 DILUTION1：80 DILUTION1：160 DILUTIONHA抗原血清中的中和抗體2ELISA 的實(shí)驗(yàn)原理MDCK 細(xì)胞中的病毒核蛋白（NP）抗原NP-AG鼠抗流感病毒甲型核蛋白單克隆抗體 NP-AB病毒核蛋白抗原-核蛋白單克隆抗體 復(fù)合物辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IGG磷苯二胺實(shí)驗(yàn)材料 一 、中和反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)材料（一

3、）病毒 1）當(dāng)使用甲5型病毒時(shí)，9-10日齡的SPF胚較好，一般在37培養(yǎng)26-28小時(shí)會(huì)得到較高的滴度，一般血凝滴度在128以上方可用于中和實(shí)驗(yàn) 2）凍存的病毒不能重復(fù)使用 3）進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)前，需先進(jìn)行病毒滴定（TCID50）的滴定進(jìn)行病毒定量（二）血清樣品 1）收到的被檢血清要分裝多份，凍存于-20 ，一般不要反復(fù)凍融3次以上。 2）血清樣品包括待檢血清和陽(yáng)性以及陰性對(duì)照血清，人血清實(shí)驗(yàn)前需56滅活30分鐘分鐘，動(dòng)物血清需要RDE 處理分裝，去除非特異性抑制因素。（三）MDCK細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)試劑 1）MDCK細(xì)胞（狗腎上皮細(xì)胞） 早代的細(xì)胞（10代）以及處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞對(duì)病毒感染具有最

4、大的敏感性（在細(xì)胞培養(yǎng)皿中70%-90%）成片 2）細(xì)胞培養(yǎng)液 DMEM 牛血清 抗生素 3）用于細(xì)胞消化的胰酶和VERSON二 ELISA 實(shí)驗(yàn)材料1, 抗體1 鼠抗流感病毒甲型核蛋白單克隆抗體2.抗體2:辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IGG3.洗滌液:PBS +0.05%TWEEN-204.封閉液:PBS +1%牛血清白蛋白+0.05%TWEEN-205.底物和底物溶液: 常用的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)所用的底物為磷苯二胺(OPD) 底物溶液為PH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液6.終止反應(yīng)液質(zhì)量控制 病毒中和實(shí)驗(yàn)技術(shù)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，參與中和反應(yīng)的因素有病毒、抗血清和宿主細(xì)胞，這些因素的變化都

5、會(huì)影響中和試驗(yàn)的結(jié)果。因此，須對(duì)中和試驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，每次測(cè)定必須設(shè)立陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照，陽(yáng)性和陰性細(xì)胞對(duì)照，以及對(duì)病毒使用劑量進(jìn)行滴定 一 血清對(duì)照 血清對(duì)照包括人或動(dòng)物血清陽(yáng)性和陰性對(duì)照。即血清中含有（陽(yáng)性對(duì)照）或不含有（陰性對(duì)照）對(duì)測(cè)定病毒特異性的中和抗體。血清對(duì)照一般分裝成多份，-20保存，并避免反復(fù)凍融使用。1陰性血清對(duì)照（1） 動(dòng)物血清一般來(lái)自未免疫或未感染動(dòng)物，即與待檢血清同種動(dòng)物的正常血清。（2） 人血清一般來(lái)自與待檢血清年齡相同的正常人群，該人群未暴露于待檢病毒。（3） 測(cè)定過(guò)程中，陰性對(duì)照血清與待檢血清應(yīng)處于相同稀釋水平。2陽(yáng)性血清對(duì)照（1） 動(dòng)物血清一般來(lái)

6、自免疫后或感染后動(dòng)物。（2） 人血清一般采用急性期和恢復(fù)期雙份血清做對(duì)照。*人血清使用前須經(jīng)加熱滅活處理，動(dòng)物血清則須經(jīng)霍亂濾液RDE（即受體破壞酶）處理，以排除非特異性反應(yīng)因素。二 病毒和細(xì)胞對(duì)照 每次試驗(yàn)必須設(shè)立陽(yáng)性和陰性細(xì)胞對(duì)照，以及對(duì)加入病毒工作液進(jìn)行滴定檢查，以便獲得準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。BCDEFGHl細(xì)l胞l對(duì)l照l(shuí)病l毒l對(duì)l照回滴A血清陰性對(duì)照 血清陽(yáng)性對(duì)照12345 6 7 89 10 11 12質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)步驟該實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)步驟：（1）病毒滴定（2）病毒中和試驗(yàn)（3）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。一 病毒滴度測(cè)定（組織培養(yǎng)半數(shù)感染量TCID50滴定）（一） 流感病毒制備

7、利用雞胚尿囊腔接種法制備流感病毒，收獲尿囊液，血凝試驗(yàn)測(cè)定病毒的存在，分裝后-70凍存。（二） 病毒的稀釋1 取1管凍存病毒尿囊液，1：100稀釋（100微升病毒液+9.9毫升稀釋液） 第1排加入146微升1：100稀釋過(guò)的病毒液，然后做系列半對(duì)數(shù)稀釋， 使之成10-2、10-2.5、10-3、10-3.510-7。每孔含100微升病毒液，每個(gè) 稀釋度重復(fù)4孔。（三） MDCK細(xì)胞的準(zhǔn)備1 用病毒稀釋液將細(xì)胞稀釋成1.5X105細(xì)胞/毫升。2 加100微升細(xì)胞（1.5X104細(xì)胞/孔）于已稀釋好病毒的微量培養(yǎng)板中。3 在375%CO2溫箱中培養(yǎng)18-22小時(shí)。 l-BCDEFGH加入146ul

8、病毒稀釋液46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul棄掉46ul-TPCK-trypsin+TPCK-trypsin無(wú)病毒的稀釋液A123 456 7 8 9 101211病毒TCID50滴定方法（一） 測(cè)定組織細(xì)胞半數(shù)感染劑量（TCID50）1 棄去微量培養(yǎng)板中的細(xì)胞液，250微升PBS洗細(xì)胞一次。2 棄去PBS（不要讓細(xì)胞干燥），加入100微升/孔固定液。3 覆蓋微量培養(yǎng)板，于室溫固定細(xì)胞10分鐘。4 棄去固定液，讓微量培養(yǎng)板室溫干燥。5 用ELISA檢測(cè)細(xì)胞感染6 利用ELISA檢測(cè)儀，于490納米波長(zhǎng)，測(cè)定每孔吸光度（OD）值，計(jì)數(shù)細(xì)胞陰性對(duì)照的平

9、均OD值。7 若含有不同稀釋度病毒孔平均OD值是細(xì)胞陰性對(duì)照孔平均OD值的2倍以上，則判斷為病毒生長(zhǎng)陽(yáng)性。8根據(jù)Reed和Muench方法對(duì)病毒滴度進(jìn)行核算，最終獲得TCID50/100微升。9在進(jìn)行中和試驗(yàn)前，稀釋病毒液，使之50微升中含有100TCID50流感病毒。TCID50值的計(jì)算一般使用Reed-Muench方法計(jì)算。稀釋 （1） （2） （3） （4） （5） （6） 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性數(shù) 陰性數(shù) 比率 %陽(yáng)性數(shù)104 4 0 11 0 11/11 100 104.5 4 0 7 0 7/7 100 105 3 1 3 1 3/4 75 105.5 0 4 0 5 0/5 01計(jì)算各

10、病毒稀釋度陽(yáng)性孔數(shù)目（1）和陰性孔數(shù)目（2）2計(jì)算陽(yáng)性和陰性孔的累積數(shù)：陽(yáng)性孔累積數(shù)由下向上累積（3）；陰性孔累積數(shù)由上向下累積（4）3計(jì)算陽(yáng)性孔的百分比：比率（5）=（3）/（3）+（4），（6）=（5）X 1004計(jì)算距離比例距離比例=（大于50%的陽(yáng)性百分比-50）/（大于50%的陽(yáng)性百分比-小于50%的陽(yáng)性百分比） =（75-50）/（75-0）=0.3TCID50的對(duì)數(shù)=大于50%的陽(yáng)性百分比的最高稀釋稀釋對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)=5+0.3 X 0.5=5.15TCID50=10-5.15/100微升100TCID50/100微升=10-3.15100TCID50/50微升=

11、10-3.15/2=10-3.15+0.3=10-2.8=1:6311加入血清2倍稀釋2 加入病毒100TCID50/孔2h 37 3加入細(xì)胞孔h 37 洗板固定 特異性抗體流感病毒微量中和實(shí)驗(yàn)步驟BCDEFGHl細(xì)l胞l對(duì)l照l(shuí)病l毒l對(duì)l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N1 23456 7 8 9 1011 12流感病毒微量中和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)905050505050505090909090 90 90909090505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505

12、0505050505050505050505050505010010050501005010050505050505050505050505050BCDEFGHl細(xì)l胞l對(duì)l照l(shuí)病l毒l對(duì)l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N1 2345678 9 1011 12流感病毒微量中和實(shí)驗(yàn)加樣方法50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul棄掉50ul10050505050505050100100100100 100 100 100 100 100100505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505

13、0505050505050505050505050505050505050505050505050505010010050501005010050505050505050505050505050BCDEFGHl細(xì)l胞l對(duì)l照l(shuí)病l毒l對(duì)l照回滴血清A加入10UL血清,從A1-A10 SYDSADK/SINGX-49N1 234567 8 9 1011 12加入100UL 病毒到A1150505050505050505050505050 50505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050

14、505050505050505050505050505050505050505050505010010050501005010050505050505050505050505050BCDEFGHl細(xì)l胞l對(duì)l照l(shuí)病l毒l對(duì)l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N1 234567 8 9 1011 122倍稀釋后的情況A-1-A-111:1001:2001:4001:800 1:1600 1:3200 1:64001:12800100100100100100100100100100100100100 100 100 100 100 1005010010010010010010010010

15、0100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100 100100100 100100100100100100100100100 10050100100501001001005010010010010010010010050100100501001001001001001001005050100100100100100BCDEFGHl細(xì)l胞l對(duì)l照l(shuí)病l毒l對(duì)l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N1 234567 8 9 1011 12加50UL(100TCID50)病毒于淺蘭色孔100TC

16、ID50502512.56310.5100100100100100100100100100100100100 100 100 100 100 100100 100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100 100100100 100100100100100100100100100 100100 10010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010010

17、0100100100100100BCDEFGHl細(xì)l胞l對(duì)l照l(shuí)病l毒l對(duì)l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N1 234567 8 9 1011 12加50UL稀釋液于A-11100TCID50502512.56310.52小時(shí)后200200200200200200200200200200200200 200 200 200 200 200200 200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200 200200200 200200200200

18、200200200200200 200200 200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200200BCDEFGHl細(xì)l胞l對(duì)l照l(shuí)病l毒l對(duì)l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N1 234567 8 9 1011 12所有各孔均加入100ULMDCK細(xì)胞(1.5104)培養(yǎng)18-22 小時(shí)100TCID50502512.56310.51:2001:4001:8001:16001:32001:64001:128001:25600中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定0.

19、712 0.701 0.112 0.096 1.453 1.752 1.495.1.136 0.979 0.971 0.792 1.4240.638 0.567 0.093 0.095 0.061 0.760 0.963 0.943 0.817 0.940 0.749 1.2950.931 0.681 0.094 0.105 0.995 0.993 0.968 1.040 0.942 0.951 0.515 1.3210.759 0.732 0.137 0.101 0.975 0.966 1.149 0.925 0.846 0.925 0.346 1.2290.800 0.986 0.182

20、0.174 1.033 0.997 1.044 0.925 0.982 0.965 0.158 0.1020.756 0.725 0.474 0.356 0.982 0.975 0.978 0.751 0.877 0.910 0.098 0.1100.739 0.778 0.551 0.628 0.913 0.945 0.943 0.923 0.724 0.849 0.156 0.1230.968 0.958 0.981 1.059 1.104 1.094 0.941 1.079 1.075 1.011 0.100 0.093 SYDDK/SINGX-49NVCCC(+)1.33(-)0.11

21、20032006400128002560040080016001)X=1.33-011/2+ 0.11=0.72(細(xì)胞半數(shù)感染域值）2）低于1.1 的細(xì)胞孔判定為中和反應(yīng)陽(yáng)性中和反應(yīng)陽(yáng)性的血清最高稀釋度即為血清中的中和抗體的滴度Y=OD（)2=0.22 0.155 0.128 0.225 0.256 2.020 2.122 2.216 2.084 1.680 1.721 1.546 2.140 0.130 0.134 0.484 0.702 1.825 1.912 1.987 1.678 1.634 1.884 1.440 1.999 O.153 0.185 1.306 1.126 1.966

22、 1.905 1.981 1.849 1.776 1.888 0.929 2.078 0.223 0.202 1.823 1.586 1.809 1.932 1.970 1.911 1.953 1.821 0.651 2.038 0.364 0.414 1.846 1.738 1.764 2.170 1.905 1.900 2.043 1.967 0.609 0.0780.673 0.694 1.776 1.785 1.731 2.145 2.014 1.712 1.797 1.723 0.453 0.083 1.177 1.204 1.989 1.696 1.846 1.997 2.019

23、1.791 1.856 1.856 0.242 0.092 1.701 1.531 1.746 1.623 1.717 1.851 1.920 1.720 1.787 2.028 0.136 0.083(+)2.1(-)0.081)X=2.1-0.08/2+ 0.08= 1.1(細(xì)胞半數(shù)感染域值）2）低于1.1 的細(xì)胞孔判定為中和反應(yīng)陽(yáng)性中和反應(yīng)陽(yáng)性的血清最高稀釋度即為血清中的中和抗體的滴度Y=OD（)2=0.222004008001600320064001280025600SYDDK/SINGX-49NVCCC操作中注意的事項(xiàng)1待檢人血清需5630分鐘滅活，動(dòng)物血清需RDE處理。2待檢血清需

24、要重復(fù)測(cè)定時(shí)，應(yīng)分裝后凍存，以免反復(fù)凍融。3每管病毒只使用一次，若重復(fù)使用，或血清陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果過(guò)高或過(guò)低，以及細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照OD值過(guò)低，須對(duì)病毒進(jìn)行重新測(cè)定。4MDCK細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，嚴(yán)禁細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)或老化（代數(shù)過(guò)高）。因此，必須在10代前進(jìn)行細(xì)胞凍存，保存于液氮中備用。5牛血清有中和病毒感染力的作用。試驗(yàn)過(guò)程中切勿將細(xì)胞培養(yǎng)液與病毒稀釋液混淆使用。6病毒與抗血清混合，常規(guī)采用37作用1小時(shí)，該試驗(yàn)采用37作用2小時(shí)，但針對(duì)不同耐熱性的病毒，孵育溫度和時(shí)間應(yīng)有所增減。7在ELISA過(guò)程中，每步都要洗滌，以保證結(jié)果可靠。8選擇合適的抗體稀釋濃度，一般預(yù)先將不同稀釋度的抗體以及酶結(jié)合抗體進(jìn)行ELISA測(cè)定，以獲得最佳稀釋度。9正確控制顯色時(shí)間，以降低背景染色。10.大量測(cè)定時(shí)，為穩(wěn)定培養(yǎng)液的PH值，可用HEPES增加溶液的緩沖能力，減少PH變化對(duì)細(xì)胞的不利影響。11. 在缺少病毒特異性抗體的情況下，可用細(xì)胞病變觀察或檢測(cè)微量培養(yǎng)板中每孔血凝活性來(lái)替代ELISA方法。但細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間一般須從18-22小時(shí)增至2-4天。 總結(jié)一、病毒微量中和實(shí)驗(yàn)（第一天）（一） 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取一96孔微量培養(yǎng)板，標(biāo)記：細(xì)胞陽(yáng)性和陰性對(duì)照孔，血清陽(yáng)性和陰性對(duì)照孔，待檢血清孔，以及病毒工作液滴定