第六章_酶工程-酶的固定化

1、1.酶的穩(wěn)定性較差，在溫度、pH、和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活。2.酶一般都是在水溶液中與底物反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后酶難以回收。 3.反應(yīng)結(jié)束后，酶成為產(chǎn)物的雜質(zhì)。固定化酶固定化酶是指固定在載體上并在一定的是指固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶。固定化酶既空間范圍內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增強穩(wěn)定性，可反復(fù)或連續(xù)使足之處，具有增強穩(wěn)定性，可反復(fù)或連續(xù)使用以及易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開等顯著特點。直用以及易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開等顯著特點。直接固定菌體或菌體碎片的，稱為固定化菌體接固定菌體或菌體碎

2、片的，稱為固定化菌體或固定化死細胞?；蚬潭ɑ兰毎?9531953年年Grubhofer,SchleitGrubhofer,Schleith h以聚氨基苯乙烯固定羧肽酶、以聚氨基苯乙烯固定羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶淀粉酶、胃蛋白酶19691969年年千千火田火田一郎一郎固定化氨基?；福潭ɑ被；福珼L-DL-氨基氨基酸拆分酸拆分19711971年年第一屆國際酶工第一屆國際酶工程大會程大會固定化酶：固定化酶：Immobilized Immobilized EnzymeEnzyme19731973年年日本日本固定大腸桿菌生產(chǎn)天冬氨酸固定大腸桿菌生產(chǎn)天冬氨酸19791979年年固定化植物細胞

3、：長春花和固定化植物細胞：長春花和毛地黃細胞毛地黃細胞19821982年年日本日本固定原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸固定原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸交聯(lián)法膠體包埋法半透膜包埋法離子鍵結(jié)合法共價鍵結(jié)合法熱處理法結(jié)合法包埋法吸附法吸附法是利用各種固體吸附劑將酶或含酶吸附法是利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定化的方法。菌體吸附在其表面上而使酶固定化的方法。活性炭、氧化鋁、硅藻活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石。璃、硅膠、羥基磷灰石。 優(yōu)點：操作簡單、條件溫和、優(yōu)點：操作簡單、條件溫和、 載體廉價易得、可反復(fù)使用。載體廉價易得、可反復(fù)使用。 缺點：結(jié)合力不

4、勞、容易脫落。缺點：結(jié)合力不勞、容易脫落。 將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。使酶固定化的方法稱為包埋法。載體：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、載體：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 （1）凝膠包埋法：以各種多孔凝膠為載體，將酶、）凝膠包埋法：以各種多孔凝膠為載體，將酶、細胞或原生質(zhì)體包埋在凝膠的微孔內(nèi)的固細胞或原生質(zhì)體包埋在凝膠的微孔內(nèi)的固定化方法。定化方法。（2）半透膜包埋法）半透膜包埋法將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶球內(nèi)，制成固

5、定化酶.制備方法：制備方法：酶，酶， 水，水，乙二胺乙二胺癸二酰氯癸二酰氯+氯仿氯仿優(yōu)點：結(jié)合力勞、活力回收高、底物專一性不變。優(yōu)點：結(jié)合力勞、活力回收高、底物專一性不變。 缺點：制備較難，載體無法回收、擴散限制。缺點：制備較難，載體無法回收、擴散限制。 選擇適宜載體，使之通過共價鍵或離子鍵選擇適宜載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。（1）離子結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體）離子結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。結(jié)合的固定化方法。 載體：載體：DEAEDEAE纖維素、纖維素、TEAETEAE纖維素、纖維素、DEAED

6、EAE葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 + +-+（2）共價結(jié)合法：通過共價鍵將酶與載體）共價結(jié)合法：通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。結(jié)合的固定化方法。 載體：載體：纖維素纖維素瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠甲殼質(zhì)甲殼質(zhì)氨基酸共聚物氨基酸共聚物酶分子中可以形成共價鍵的基團：酶分子中可以形成共價鍵的基團：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基、咪唑基氨基、羧基、巰基、羥基、酚基、咪唑基載體載體活潑基團活潑基團載體活化的方法載體活化的方法 1. 活化活化酶輔助蛋白交聯(lián)法酶輔助蛋白交聯(lián)法對蛋白酶的抵抗性增強，不易被蛋白酶水解。34567游離酶：固定化酶：底物特異性對熱的穩(wěn)定性提高保持穩(wěn)定性好對酶的抵抗性增

7、強對變性劑的耐受性提高載體性質(zhì)對最適pH的影響產(chǎn)物性質(zhì)對最適pH的影響最適pH最適溫度穩(wěn)定性1.固定化酶的優(yōu)點1.酶的穩(wěn)定性增強，可以長期保存。2.可以反復(fù)使用或連續(xù)使用很長時間。3.易于產(chǎn)物分離，有利于產(chǎn)物純化。2.固定化酶的應(yīng)用1.在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用2.在酶傳感器方面的應(yīng)用。氨基酸?；窪L-氨基酸拆分葡萄糖異構(gòu)酶果葡糖漿生產(chǎn)天冬氨酸酶天冬氨酸生產(chǎn)Pt電極（）Ag電極（+）O2G O2H2O2G酸高分子膜通過各種方法將細胞與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化細胞的過程稱為細胞固定化。固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞稱為固定化細胞。固定化細胞能夠進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，

8、所以又稱為固定化或細胞或固定化增殖細胞。利用各種固體吸附劑，將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法。（一）吸附法pH35- - - -+載體：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、金屬絲網(wǎng)、微載體、中空纖維凝膠包埋法半透膜包埋法（二）包埋法將細胞包埋在多孔載體內(nèi)部而制成固定化細胞的方稱為包埋法。載體：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺 （一）利用固定化微生物生產(chǎn)各種產(chǎn)物酒類氨基酸有機酸酶和輔酶抗生素甾體轉(zhuǎn)化、廢水處理有機溶劑、維生素、化工產(chǎn)品的生產(chǎn)（二）制造微生物傳感器微生物傳感器是由固定化微生物細胞與各種能量轉(zhuǎn)換器（電極、燃料電池、場效應(yīng)管等）密切結(jié)合而成的傳感裝置。 呼吸活

9、性測定型：利用固定在高分子膜上的微生物細胞的呼吸作用，測定氧氣的消耗和二氧化碳的生成，從而確定被測定物質(zhì)的量。 O2電極O2CO2高分子膜電極活性測定型：利用固定在膜上的微生物細胞的新陳代謝作用，測定電極活性物質(zhì)的量的變化，從而確定樣品中欲測物質(zhì)的含量。離子選擇電極/氣體電極/生物燃料電池H+高分子膜葡萄糖、有機酸、醇、抗生素、氨基酸、氨、硝酸鹽、生化需氧量、細胞數(shù)量等的測定。（三）微生物傳感器的應(yīng)用（一）固定化植物細胞的特點1.提高存活率2.防止聚集成團3.便于更換培養(yǎng)基4.可反復(fù)使用5.利于產(chǎn)品的分離純化（二）方法吸附法、包埋法（一）固定化動物細胞的特點1.提高存活率2.提高產(chǎn)率3.可反復(fù)使用4.利于產(chǎn)品的分離純化（二）方法吸附法、包埋法（一）為什么要固定原生質(zhì)體（二）方法原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體固定化：包埋法細菌肽多糖溶菌酶酵母-葡具糖葡聚糖酶霉菌幾丁質(zhì)等幾丁質(zhì)酶等植物細胞纖維素、半纖維素、果膠纖維素酶、果膠酶（一）為