復(fù)習(xí)思考題及答案1用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌時(shí)為什么一般都需要

1、第四章復(fù)習(xí)思考題及答案1 .用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌時(shí)，為什么一般都需要先將細(xì)菌進(jìn)行染色？制作細(xì)菌染色標(biāo)本片時(shí)，為什么必須先對(duì)涂在載玻片上的細(xì)菌樣品進(jìn)行固定？固定時(shí)應(yīng)注意什么問題？答：由于細(xì)菌細(xì)胞小且無色透明，直接用光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，菌體和背景反差很小，難以看清細(xì)菌的形態(tài)，更不易識(shí)別某些細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此，一般都需要先將細(xì)菌進(jìn)行染色，借助于顏色的反襯作用，以提高觀察樣品不同部位的反差，能更清楚地進(jìn)行觀察和研究。此外,某些染色法還可用于鑒別不同類群的細(xì)菌，故細(xì)菌的染色是工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中重要的基本技術(shù)。染色前必須先對(duì)涂在載玻片上的細(xì)菌樣品進(jìn)行固定，固定的作用一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上，一是增加菌體

2、對(duì)染料的親和力。一般常用酒精燈火焰加熱固定的方法，但應(yīng)注意防止細(xì)胞膨脹和收縮，盡量保持細(xì)胞原形。2 .革蘭氏染色法包括哪幾個(gè)基本步驟？你認(rèn)為影響革蘭氏染色結(jié)果正確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是什么？答：革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑草酸鏤結(jié)晶紫進(jìn)行初染，再用媒染劑碘液媒染，然后用脫色劑乙醇處理，最后用復(fù)染劑石炭酸復(fù)紅或番紅進(jìn)行復(fù)染。經(jīng)此法染色后，若細(xì)菌不被酒精脫色，能保持結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物而呈現(xiàn)藍(lán)紫色，則該菌稱為革蘭氏陽性細(xì)菌(G+);反之，若細(xì)菌能被酒精脫色，而被復(fù)紅或番紅復(fù)染成紅色，則稱之為革蘭氏陰性細(xì)菌(G-)。被普遍采用的經(jīng)Hucker氏改良的革蘭氏染色法,其操作步驟為：制片-初染-媒染-脫色-

3、復(fù)染-干燥-觀察。影響革蘭氏染色結(jié)果正確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是用脫色劑乙醇處理，為了保證革蘭氏染色結(jié)果的正確性，必須控制乙醇脫色時(shí)間，盡量采用規(guī)范的染色方法。3 .放線菌、酵母菌和霉菌顯微標(biāo)本片的制作分別可采用哪些方法？各有什么特點(diǎn)？答：放線菌與細(xì)菌的單染色一樣，可用石炭酸復(fù)紅或呂氏美蘭等染料著色后，在顯微鏡下觀察其形態(tài)。但為了觀察放線菌在自然生長狀態(tài)下的形態(tài)特征，可應(yīng)用各種培養(yǎng)、制片和觀察方法，其中印片法、插片法和玻璃紙法是三種常用的方法。觀察酵母菌形態(tài)可制備水浸片，若加入一滴美蘭染色液，還可區(qū)別死活細(xì)胞(呈蘭色的為死細(xì)胞，無色的為活細(xì)胞)，這是因?yàn)榛罴?xì)胞具有較強(qiáng)的還原能力，能使無毒性的美藍(lán)從藍(lán)色的

4、氧化型變成無色的還原型。霉菌具有復(fù)雜分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲。由氣生菌絲分化產(chǎn)生繁殖菌絲再由繁殖菌絲產(chǎn)生抱子。霉菌菌絲較粗大，制片時(shí)容易收縮變形，抱子也容易分散。為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的標(biāo)本片，常用載片培養(yǎng)法和玻璃紙培養(yǎng)法進(jìn)行制片觀察。4 .簡述透射電鏡微生物樣品的制備方法與操作步驟。答：透射電鏡采用覆蓋有支持膜的載網(wǎng)來承載被觀察的微生物樣品。最常用的載網(wǎng)是銅網(wǎng)，而支持膜可用塑料膜（如火棉膠膜、聚乙烯甲醛膜等），也可用碳膜或金屬膜。透射電鏡樣品制備技術(shù)主要有下列三種：負(fù)染技術(shù)；投影技術(shù)；超薄切片技術(shù)。透射電鏡的微生物樣品的簡單制備步驟為：處理金屬載網(wǎng)-制備支持膜-轉(zhuǎn)移支持膜

5、到載網(wǎng)上-制備微生物電鏡樣品。5 .何謂微生物的純培養(yǎng)技術(shù)？主要包括哪些技術(shù)內(nèi)容？答：在微生物學(xué)中，通常只有純培養(yǎng)物才能被較好地進(jìn)行研究、利用和重復(fù)其結(jié)果；在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，絕大多數(shù)情況下也只有采用純培養(yǎng)物，才能實(shí)施正常運(yùn)作和具有實(shí)用價(jià)值。因此，把特定的單一微生物從自然界（或含菌樣品）以混雜存在的狀態(tài)中分離出來、經(jīng)純化、轉(zhuǎn)接、繁殖、并以純培養(yǎng)物的形式保藏下來等一系列操作技術(shù)，稱之為純培養(yǎng)技術(shù)。它是進(jìn)行微生物學(xué)研究和工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)最基本的技術(shù)。純培養(yǎng)技術(shù)主要包括：培養(yǎng)基的配制與滅菌技術(shù)、無菌操作技術(shù)、工業(yè)微生物分離與純化技術(shù)、厭氧微生物純培養(yǎng)技術(shù)、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)等。6 .試述一般培養(yǎng)基的配

6、制方法和操作步驟。高壓蒸汽滅菌和干熱滅菌的操作方法怎樣？應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？答：一般培養(yǎng)基的配制方法如下（各種天然培養(yǎng)基的配制方法略有不同）:1.按照配方的組分及用量先分別稱量并配成液體；2.根據(jù)要求調(diào)到一定的酸堿度（pH值）；3.若要制成固體則加入2%瓊脂并加熱融化；4.根據(jù)需要的數(shù)量分裝入試管或三角瓶中，加上棉塞或蓋上紗布；5.包扎好滅菌后備用。配制斜面培養(yǎng)基為例，一般操作步驟為：稱量-溶解-調(diào)pH值-加瓊脂f過濾分裝加棉塞包扎火菌擺斜面無菌檢查。高壓蒸汽滅菌法一般培養(yǎng)基、無菌水、耐熱藥物及玻璃器皿等常采用高壓蒸汽滅菌法。該法的優(yōu)點(diǎn)是時(shí)間短，滅菌效果好。它可以殺滅所有的微生物，包括最耐熱的細(xì)菌

7、芽抱及其它休眠體。一般培養(yǎng)基常用0.1MPa（1kg/cm2或15Ib/in2）,約120c維持1520分鐘，便可達(dá)到徹底滅菌的目的；單獨(dú)玻璃器皿滅菌的溫度可高些，維持的時(shí)間可長些。滅菌的溫度及維持的時(shí)間，應(yīng)隨滅菌物品的性質(zhì)和容量多少而靈活掌握。要注意滅菌的因素是高溫而不是高壓，故滅菌鍋內(nèi)的冷空氣要徹底排除（在排除冷空氣的條件下，蒸汽壓與溫度之間有一定關(guān)系），否則，壓力雖達(dá)到0.1Mpa（lkg/cm2工但溫度并沒有達(dá)到要求。干熱滅菌法常用玻璃器皿（培養(yǎng)皿、三角燒瓶、試管、吸管等卜金屬器皿及其它干燥耐熱物品，烘干后經(jīng)適當(dāng)包扎（勿裝液體）,可采用干熱滅菌法。干熱滅菌一般在電烘箱內(nèi)利用干熱空氣滅菌

8、。該法比濕熱滅菌法所需的溫度要高些（160170C）,時(shí)間也要長些（12h）。但滅菌溫度若超過180C,包扎器皿的紙或棉塞就容易燒焦。7 .為什么微生物菌種移接的所有操作，均應(yīng)在無菌環(huán)境下進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作？什么是無菌的環(huán)境條件？什么是無菌操作技術(shù)？答：微生物無處不在，無孔不入，因此，在對(duì)微生物的研究和應(yīng)用過程中，必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的純潔性，防止乃至殺滅其他微生物（雜菌）的混入；在進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)微生物純培養(yǎng)物時(shí)，要采用嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)，防止被其他微生物所污染。在微生物學(xué)研究中，常需用接種環(huán)把微生物純培養(yǎng)物，由一個(gè)器皿移接到另一個(gè)培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)。由于周圍環(huán)境（主要是空氣）

9、中，存在著大量肉眼無法發(fā)現(xiàn)的各種微生物，只要一打開器皿，就可能會(huì)引起器皿內(nèi)的培養(yǎng)基或培養(yǎng)物，被環(huán)境中其他微生物所污染。此外，實(shí)驗(yàn)室人員與所試驗(yàn)的微生物，應(yīng)保證沒有或最少直接接觸或氣霧接觸。因此，微生物菌種移接的所有操作，均應(yīng)在無菌環(huán)境下進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作。無菌環(huán)境是指在無菌室、無菌箱、超凈工作室或超凈工作臺(tái)等無菌或相對(duì)無菌的環(huán)境條件下進(jìn)行操作。無菌操作技術(shù)的要點(diǎn)是要充分利用酒精燈焰周圍的高溫區(qū)（無菌區(qū)），即接種時(shí)，管口和瓶口始終保持在火焰（如酒精燈焰）旁邊，進(jìn)行熟練的移接種操作，以便保證微生物的純種培養(yǎng)。此外，挑取和移接微生物純培養(yǎng)物用的接種環(huán)及接種針，應(yīng)采用易于迅速加熱和冷卻的饃銘合金等金屬

10、制備，使用時(shí)用火焰灼燒滅菌；轉(zhuǎn)移液體純培養(yǎng)物時(shí)，應(yīng)采用無菌吸管或無菌移液槍。8 .常用的微生物分離純化方法有哪些？這些方法各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？答：常用的微生物分離純化方法有：稀釋混合倒平板法、稀釋涂布平板法、平板劃線分離法、稀釋搖管法、液體培養(yǎng)基分離法、單細(xì)胞分離法、選擇培養(yǎng)分離法等。其中前三種方法最為常用，不需要特殊的儀器設(shè)備，分離純化效果好稀釋混合倒平板法有兩個(gè)缺點(diǎn)，一是會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間，缺乏溶氧而生長受影響，形成的菌落微小難于挑??；一是在傾入熔化瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，若溫度控制過高，易燙死某些熱敏感菌，過低則會(huì)引起瓊脂太快凝固，不能充分混勻。在微生物學(xué)研究中，更常用的純種分離方法

11、是稀釋涂布平板法。另一種簡單快速有效的涂布平板法，為玻璃涂棒連續(xù)涂布分離法。平板劃線分離法的特點(diǎn)是簡便快速，但單個(gè)菌落并不一定是由單個(gè)細(xì)胞形成的，需再重復(fù)劃線12次，并結(jié)合顯微鏡檢測個(gè)體形態(tài)特征，才可獲得真正的純培養(yǎng)物。9 .厭氧微生物常用哪些純培養(yǎng)技術(shù)？簡述厭氧手套箱培養(yǎng)法的原理和操作過程。答：目前，已發(fā)展了很多厭氧微生物培養(yǎng)技術(shù)，有化學(xué)方法、物理方法、物理與化學(xué)相結(jié)合的方法，如真空干燥器化學(xué)吸氧法、厭氧罐培養(yǎng)法、厭氧手套箱培養(yǎng)法、厭氧發(fā)生袋培養(yǎng)法、庖肉培養(yǎng)基法、亨蓋特氏（Hungate）厭氧技術(shù)等。厭氧手套箱是利用通入的氫氣，在箱內(nèi)黑色鋁粒的催化下，與氧結(jié)合生成水的反應(yīng)，達(dá)到除去箱內(nèi)氧的目

12、的。厭氧箱可分為操作室和交換室兩部分。操作室用于進(jìn)彳T厭氧操作，前面有一對(duì)供操作用的套袖及膠皮手套。操作室內(nèi)的常溫鋁粒和干燥劑用鋼絲網(wǎng)分別裝著，并與電風(fēng)扇組裝在一起，不斷除去操作室內(nèi)的氧及所形成的水分。操作室內(nèi)還備有接種針和用于接種針滅菌的電熱器，有的還安裝有培養(yǎng)箱。交換室是用于室外物品的放入和室內(nèi)物品的取出。交換室又與真空泵及混合氣鋼瓶相連?；旌蠚怏w體積分?jǐn)?shù)一般為10%CO2、5%10%H2和80%85%高純N2。以平板法分離雙歧桿菌的純培養(yǎng)為例，厭氧手套箱的操作過程：厭氧箱的準(zhǔn)備-培養(yǎng)物的準(zhǔn)備-換混合氣培養(yǎng)-觀察挑取菌落。10 .微生物菌種長期保藏根據(jù)什么基本原理？常用哪些保藏菌種的方法？

13、這些方法各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？答：微生物菌種保藏共同的基本原理是：使微生物的新陳代謝處于最低或幾乎停止的狀態(tài)，因而極少或不發(fā)生變異；保藏方法通常都是基于溫度、水分、氧氣、營養(yǎng)成分和滲透壓等方面考慮；保藏條件都是人工方法創(chuàng)造的低溫、干燥、缺氧環(huán)境。目前，已建立了許多種長期保藏菌種的方法，包括：斜面冰箱保藏法、穿刺法、液體石蠟保藏法、沙土管保藏法、濾紙法、甘油低溫保藏法、冷凍干燥保藏法、低溫法、液氮超低溫保藏法等。斜面冰箱保藏法操作簡單、使用方便，但保藏時(shí)間短、容易被污染；液體石蠟保藏法制作簡單，不需經(jīng)常移種，實(shí)用且效果較好；沙土管保藏法操作通常比較簡單，效果較好，可保存幾年時(shí)間，廣泛應(yīng)用于抗生素工業(yè)的

14、生產(chǎn)菌種保藏中，但不能用于保藏營養(yǎng)細(xì)胞；甘油低溫保藏法簡單易行，保藏時(shí)間可達(dá)1年至幾年；冷凍干燥保藏法綜合利用了各種有利于菌種保藏的因素（低溫、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌種保藏方法之一；液氮超低溫保藏法比其他任何保藏方法都要優(yōu)越，被世界公認(rèn)為防止菌種退化的最有效方法，適用于各種微生物菌種的保藏。11 .了解并熟悉不同工業(yè)微生物的生理與發(fā)酵試驗(yàn)技術(shù)有什么實(shí)用意義？如何進(jìn)行微生物對(duì)碳源和氮源的利用試驗(yàn)？厭氧的酵母菌酒精發(fā)酵試驗(yàn)與好氧的短桿菌谷氨酸發(fā)酵試驗(yàn)有什么不同？答：了解不同工業(yè)微生物的生理特性，并熟悉其生理與發(fā)酵試驗(yàn)技術(shù)。使人們能利用這些不同的生理特性，作為不同微生物分類鑒定和菌種選育的

15、依據(jù)；利用它們的多種發(fā)酵類型和代謝產(chǎn)物，更有效地為發(fā)酵工業(yè)作貢獻(xiàn)。碳源的利用試驗(yàn)：（1）糖類發(fā)酵試驗(yàn)絕大多數(shù)細(xì)菌和酵母菌都能利用糖類作為碳源和能源，但它們?cè)诜纸馓穷愇镔|(zhì)的能力上有很大差異，糖類發(fā)酵試驗(yàn)主要是試驗(yàn)多種糖類能否被利用作為碳源或能源。（2）淀粉水解試驗(yàn)淀粉酶能水解淀粉成為小分子的糊精、雙糖和單糖，此過程可通過觀察細(xì)菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實(shí)。淀粉遇碘液會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，但細(xì)菌水解淀粉后的周圍區(qū)域，用碘測定不再顯示藍(lán)色，使平板上的菌落周圍出現(xiàn)透明圈，表明該細(xì)菌能產(chǎn)生淀粉酶，以此鑒別不同細(xì)菌。（3）脂肪水解試驗(yàn)脂肪也是碳源之一。微生物對(duì)大分子的脂肪不能直接利用，必須依賴其胞外產(chǎn)生的脂肪酶，

16、將脂肪分解成小分子的甘油和脂肪酸，才能被微生物所吸收利用。脂肪被脂肪酶水解后產(chǎn)生的脂肪酸，可改變培養(yǎng)基的pH.,使pH降低。加入培養(yǎng)基的中性紅指示劑，會(huì)使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色，說明微生物胞外能產(chǎn)生脂肪酶。氮源的利用試驗(yàn)：工業(yè)微生物對(duì)于氮源的利用，主要是看其對(duì)蛋白質(zhì)、蛋白月東、氨基酸、鏤鹽和硝酸鹽的利用能力，例如：（1）酵母菌對(duì)氮源利用試驗(yàn)；（2）明膠液化試驗(yàn)；（3）石蕊牛奶試驗(yàn)；（4）尿素分解試驗(yàn)；（5）硝酸鹽還原試驗(yàn)。酒精發(fā)酵試驗(yàn)是在無氧條件下，某些酵母菌（如釀酒酵母）能把己糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳的作用，稱為酒精發(fā)酵。酵母菌由于其種類不同，酒精發(fā)酵力的強(qiáng)弱也不同，工業(yè)生產(chǎn)上必須采用酒精發(fā)

17、酵過程中所生成的二氧化碳和酒精的量，以及計(jì)算其發(fā)酵度來測定不同酵母菌種的發(fā)酵力。谷氨酸發(fā)酵試驗(yàn)是在有氧條件下，谷氨酸短桿菌在各種酶系的作用下，葡萄糖經(jīng)己糖酵解、單磷酸己糖、三竣酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)等途徑生物合成谷氨酸。因此，谷氨酸發(fā)酵是好氧性發(fā)酵。谷氨酸短桿菌是生物素營養(yǎng)缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中含有充足的生物素時(shí)，菌體大量生長，但不積累谷氨酸產(chǎn)物，因此，發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物素要控制在一個(gè)亞適量的水平（除非采用特殊的發(fā)酵工藝）。12 .在科研和工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)踐中，最常用的微生物檢測項(xiàng)目主要有哪些？各有什么實(shí)際意義？試舉例說明之。答：在科研工作和生產(chǎn)實(shí)踐中，最常用的微生物檢測項(xiàng)目是細(xì)胞數(shù)或生長量的測定。例如

18、，在酒精、啤酒和白酒等的成熟酒母在鏡檢時(shí)，除了要求菌體細(xì)胞飽滿肥大、細(xì)胞質(zhì)均勻、空泡小、出芽率高外，還要求酵母細(xì)胞數(shù)每毫升達(dá)到l億個(gè)以上，以此作為酵母菌繁殖能力和培養(yǎng)成熟的指標(biāo)；又例如，在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，每間隔24h,就要取樣用光電比濁法測定發(fā)酵液的光密度（OD）,以此作為短桿菌增殖數(shù)量的指標(biāo)，有助于指導(dǎo)發(fā)酵過程的工藝控制。13 .簡述水和食品中細(xì)菌菌落總數(shù)的測定程序。多管發(fā)酵法測定水與食品中大腸菌群數(shù)的操作過程有何異同？答：細(xì)菌菌落總數(shù)是指水或食品檢樣經(jīng)處理，在肉汁營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37c經(jīng)24h培養(yǎng)后，lml或lg檢樣中所生長的嗜中溫需氧性細(xì)菌菌落總數(shù)。一般都采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行測定。它主要作為判定水和食品被污染程度的標(biāo)志，也可應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。水和食品中細(xì)菌菌落總數(shù)的測定與前面的平板菌落計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，在原理和方法上基本是相同的。其測定過程如下：培養(yǎng)基的制備一檢樣的采取一檢樣的稀釋一傾注平板及培養(yǎng)一菌落總數(shù)的計(jì)算一菌落總數(shù)的報(bào)告。食品中大腸菌群數(shù)是以每100毫升（克）檢樣