基因工程-第6章-基因文庫的構(gòu)建與目的基因的獲得

1、第六章 基因文庫的構(gòu)建與目的基因的獲得基因工程主要是通過人工的方法分離、改造、擴(kuò)增并表達(dá)生物的特定基因，從而深入開展核酸遺傳研究或者獲取有價(jià)值的基因產(chǎn)物。通常將那些已被或者準(zhǔn)備要被分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或DNA片段，稱為目的基因。要從數(shù)以萬計(jì)的核苷酸序列中挑選出非常小的所感興趣的目的基因，是基因工程中的第一個(gè)難題。欲想獲得某個(gè)目的基因，必須對(duì)其有所了解，然后根據(jù)目的基因的性質(zhì)制定分離的方案。 目前主要應(yīng)用化學(xué)合成法、目的基因的直接分離法和逆轉(zhuǎn)錄法來分離、獲得目的基因。PCR技術(shù)的問世及其在基因工程中廣泛應(yīng)用，已經(jīng)大大簡(jiǎn)化了構(gòu)建和篩選cDNA文庫的工作。此外，新發(fā)展起來的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法（

2、transposon tagging）、mRNA 差異顯示法（mRNA differential disply）、RFLP 及ESTs等技術(shù)也已經(jīng)在分子克隆工作中展現(xiàn)出廣闊的前景。6.1 基因文庫的構(gòu)建基因組文庫（genomic DNA library） 是指將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶切后（必要時(shí)對(duì)這些DNA片段進(jìn)行密度梯度離心或經(jīng)制備型凝膠電泳進(jìn)行分級(jí)分離，以選擇長度適合于插入載體的片段）所產(chǎn)生的基因組片段隨機(jī)地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。1975年，Clarke和Carbon提出了計(jì)算文庫中任一DNA序列重組子數(shù)目的公式，即N=ln(1-

3、P)/ln(1-f)N為所需要的重組體的數(shù)目， P為選出某一基因的期望概率（通常期望為99%）， f為單個(gè)重組體中的平均插入片段與基因組DNA總量之比。例如要在一哺乳動(dòng)物基因組（3109bp）的17kb片段的文庫中，使含有一給定DNA序列達(dá)99%的概率，則需N=ln(1-0.99)/ln1-(1.7104bp / 3109bp)= 8.1105 即所建的文庫至少含有8.1 105以上的重組體，才能代表整個(gè)的基因組。 基因組DNA文庫有著非常廣泛的用途。如用以分析、分離特定的基因片段；通過染色體步行（chromasome walking）研究基因的組織結(jié)構(gòu)；用于基因表達(dá)調(diào)空研究；用于人類及動(dòng)、植

4、物基因組工程的研究等等?；蚪M文庫的構(gòu)建一般包括下列基本步驟：（1）細(xì)胞染色體大分子DNA的提取和大片段的制備；（2）載體DNA的制備；（3）載體與外源大片段的連接；（4）體外包裝及基因組DNA文庫的擴(kuò)增；（5）重組DNA的篩選和鑒定。6.2 cDNA的合成和克隆6.2.1 cDNA文庫（ cDNA library ）的構(gòu)建和基因的分離 cDNA的克隆對(duì)于特定基因的分離和特性研究是極有價(jià)值的工具。 cDNA文庫最關(guān)鍵的特征是它包括在特定的組織或細(xì)胞類型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列，這樣使得cDNA 文庫的復(fù)雜性要比基因組文庫要低得多。由于不同的細(xì)胞類型、發(fā)育階段以及細(xì)胞所處的特定狀態(tài)是

5、由特定基因的表達(dá)所決定的，因此各自的 mRNA的種類就不同，由此而產(chǎn)生獨(dú)特的cDNA文庫。 構(gòu)建cDNA文庫通常包括：（1）mRNA的提取及其完整性的確定；（2） cDNA 的合成和克??；（3）目的cDNA的鑒定等步驟。 (1) 總RNA的提取 (2) mRNA的分離 (3) mRNA的純化 (4) cDNA第一條鏈的合成:隨機(jī)引物法； oligo-dT(12-18)引物法 (5) cDNA第二條鏈的合成 (6) cDNA的甲基化和接頭的加入 (7) cDNA同載體的連接 (8) 噬菌體蛋白的體外包裝（9）噬菌斑原位雜交分離基因總RNA的提取凡與RNA操作有關(guān)的玻璃器皿經(jīng)常規(guī)洗凈后，用0.1%

6、的焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡處理（37，2小時(shí)），再用滅菌雙蒸水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后250烘烤4小時(shí)以上或180 8小時(shí)以上。塑料器材最好使用滅菌的一次性使用的塑料用品，Eppendorf管、微量加樣吸頭最好是新的，使用前進(jìn)行高壓滅菌。所有溶液應(yīng)加DEPC至終濃度0.05%-0.1%，室溫處理過夜，然后高壓處理。DEPC易與Tris反應(yīng)，配制Tris溶液的水應(yīng)先用0.1%DEPC處理，高壓消毒，配好后再高壓消毒。1 異硫氰酸胍-熱苯酚法1）將實(shí)驗(yàn)用的全部用品用0.1%的DEPC水浸泡過夜，然后高壓滅菌，玻璃器皿在180烘烤8h以上，塑料制品80烘干。2）將0.1g組織樣品在研

7、缽中迅速研成粉末，放入裝有1ml GITC試劑的勻漿管中勻漿。勻漿液取出放在1.5ml離心管中，吸打幾次以剪切染色質(zhì)DNA，60溫浴10min。3）加入等體積60苯酚，混勻，抽提。4）冰中冷卻，10000rpm離心10min。取上清，用熱苯酚重復(fù)抽提一次。5）等體積氯仿在室溫下抽提1-2次后，上清加1/10體積3M 乙酸鈉和3倍體積無水乙醇，在20沉淀過夜。6）12000rpm離心15min，沉淀溶于0.5ml STE中，加蛋白酶K至200g/ml，56消化1h。等體積熱苯酚：氯仿抽提，冷卻離心，重復(fù)一次。7）上清加2.5倍體積無水乙醇沉淀過液。離心，70%乙醇洗沉淀，干燥后，溶于適量DEPC

8、水中。2 用TRIZOL試劑盒提取總RNA1) 勻漿在1ml的TRIZOL試劑中加50-100mg組織，樣本體積不應(yīng)超過TRIZOL的10%。用勻漿機(jī)高速勻漿2分鐘。2)（可選）要分離蛋白、脂肪、多糖或細(xì)胞外物質(zhì)如肌肉、脂肪組織，在勻漿后2-8 12000g離心10分鐘。將上清勻轉(zhuǎn)移至一新的Eppendof管。3) 分相15-30溫育5分鐘，完全解離核蛋白復(fù)合體。加0.2ml氯仿，用力搖動(dòng)15秒，15-30放置2-3分鐘。小于12000g 2-8離心15分鐘。4) RNA的沉淀轉(zhuǎn)移水相于一新管。加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘。4-8 12000g離心10分鐘（離心前RNA通常不可見

9、，在管壁或管底形成膠樣沉淀）。5）RNA沉淀的洗滌棄上清，每1ml TRIZOL至少加1ml 75%的乙醇洗滌RNA一次。2-8小于7500g離心5分鐘。6）RNA的重溶倒掉乙醇，空氣中干燥或真空干燥5-10分鐘。加適當(dāng)?shù)腄EPC處理水，吸打幾次，放于55-60溶解 10分鐘。-70保存。 RNA變性電泳 方法 在一滅菌微量離心管中混合下列液體，以制備RNA樣品。 RNA 9l 10TAE 4l 甲醛 7l 甲酰胺 20l 總體積 40l 混勻后，65溫育15min，取出置冰上。加入RNA上樣緩沖液，用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳buffer為1TAE。 mRNA的分離和純化具體操作按Oligo

10、tex mRNA Mini Kit說明進(jìn)行。500g總RNA于1.5ml離心管中用DEPC處理過的水調(diào)至500l。 加OBB 500l和Oligotex Suspension 45l,充分混勻。7030分鐘取出反應(yīng)，室溫放置10分鐘。12000rpm離心2分鐘，沉淀。用OW2400l重懸沉淀，然后移到一小離心柱中，12000rpm,離心分鐘?？俁NA和mRNA將這小離心柱移入一新1.5ml離心管中，加400l OW2，12000rpm,離心分鐘。將這小離心柱移入一新1.5ml離心管中，加20l熱（70）OEB到離心柱中，用槍上下吹吸次，12000rpm,離心分鐘。再加2l熱（70）OEB到離心

11、柱 中 ， 用 槍 上 下 吹 吸 次 ，12000rpm,離心分鐘。 第一鏈的合成在1.5ml離心管中，按順序加入以下試劑：10first strand buffer 5.0lFirst strand Methyl Nucleotide mixture 5.0lLinker-primer(1.4g/l) 2.0lDEPC water 30.5lRNase Block Ribonuclease Inhibitor(40u/l) 1.0l振蕩混勻，然后加入5l（5g）mRNA,混勻。室溫放置10分鐘，以便模板和引物退火。加入3.5lMMLV-RT(20u/l),終體積50l，混勻，稍離心。取出5

12、L放于含有0.5L -32P dATP的離心管做對(duì)照反應(yīng)。37溫育1小時(shí)同時(shí)準(zhǔn)備16水浴。將第一鏈反應(yīng)液取出，放置在冰上 第二鏈的合成在冰上按順序往第一鏈反應(yīng)液中加入以下試劑：10Second strand buffer 20.0lSecond strand dNTPs 6.0lddH2O 108.2l-32P dATP 2l 稍混勻，離心后加入RNase H（0.9u/l） 3.5lDNA polymerase I(9.0u/l) 11.1l迅速振蕩管子以混勻，稍離心后，在16溫育2.5小時(shí)，然后取出放在冰上。注意：在操作過程中必須保證溫度不超過16，否則會(huì)引起發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，影響cDNA的

13、克隆。cDNA第一鏈和cDNA第二鏈堿變性瓊脂糖凝膠電泳的同位素X光片cDNA第一鏈和雙鏈cDNA凝膠電泳 cDNA末端的補(bǔ)平在反應(yīng)管中加入Bluting dNTP mix 23lpfu DNA polymerase (2.5u/l) 2.0l混勻后，72溫育30 分鐘，注意：不能超過30分鐘。 取出反應(yīng)管，加200l苯酚：氯仿（1：1）抽提。12000rpm室溫離心2分鐘，取上清，用等體積氯仿再抽提1次。取上清，加入20l 3M NaAc(PH5.2)，400l無水乙醇，-20過夜沉淀。12000rpm，4，離心60分鐘。70%乙醇洗沉淀，吸出乙醇后，干燥沉淀。將沉淀溶于9.0l的EcoR

14、I adapters溶液中。4放置至少30分鐘，使cDNA完全溶解。EcoR I adapters的連接在含有cDNA和EcoR I adapters的管中加入10Ligase buffer 1.0l10mM rATP 1.0lT4 DNA ligase(4g/l) 1.0l4連接兩天，將管放在70水欲中30分鐘，以滅活連接酶。 EcoR I 末端的激活在反應(yīng)管中加入10Ligase buffer 1.0l10mM rATP 2.0l滅菌水 6.0lT4 polynucleotide kinase10g/l) 1.0l37溫育30分鐘。70溫育30分鐘以滅活T4 polynucleotide

15、kinase1，稍離心。 Xho I消化在 反 映 管 中 加 入 2 8 . 0 l X h o I buffer,3.0lXho I,37消化2小時(shí)。冷卻至室溫，加入5.0l 10STE buffer。這時(shí)的cDNA可以進(jìn)行片段分離了。 cDNA不同大小片段的分離將Sepharose CL-2B和10STE buffer從4冰箱中取出，平衡至室溫。準(zhǔn)備50ml的1STE buffer。將柱子固定在一個(gè)支架上，輕輕混勻Sepharose CL-2B，用1ml移液器將其加入柱子中。加入10ml 1STE buffer 平衡柱子。當(dāng)在樹脂液面上剩大約50l STE時(shí)，立即加入cDNA樣。一旦樣品

16、進(jìn)入Sepharose CL-2B，用移液槍將連接管加滿1STE buffer。當(dāng)染料達(dá)到柱子管壁刻度為-.4ml時(shí)開始接收 cDNA，每3滴接一管。當(dāng)染料達(dá)到柱子管壁刻度為.3ml時(shí)停止接收 cDNA，大約接收12管。從每管中取8l跑5%的非變性丙烯酰胺凝膠電泳。將非變性丙烯酰胺凝膠壓片，決定哪幾管用于將來與載體的連接。將大于400bp的接收的cDNA合并成一管，用芬：仿（1：1）抽提。12000rpm,室溫離心2分鐘。取上清，加入等體積的氯仿抽提。12000rpm,室溫離心2分鐘。取上清，加入2倍體積的無水乙醇，-20過液。從-20取出沉淀反應(yīng)，4，12000rpm，離心60分鐘。去上清，

17、用80% 乙醇洗沉淀，室溫，12000rpm，離心2分鐘。去上清，干燥沉淀，溶于5l滅菌水中。 cDNA片段與載體的連接及噬菌體蛋白的包裝 按下列比例將合成的cDNA連接到載體上去。 Uni-ZAP XR vector(1g/l) 1.0l 10ligase buffer 0.5l 10mM rATP 0.5l cDNA sample 100ng T4 DNA ligase 0.5l 加水至 5.0l 4連接2天。取出1l連接產(chǎn)物，加入Gigapack III 包裝蛋白進(jìn)行包裝。22溫育2小時(shí)，然后加500l SM緩沖液，20l氯仿混勻后稍離心，將管子儲(chǔ)存于4。 準(zhǔn)備XL1-BLUE MRF宿

18、主細(xì)菌。取1l文庫，用SM緩沖液將其稀釋至102、104、105倍等3個(gè)梯度，在每個(gè)梯度中分別取ll放入200l XL1-BLUE MRF感受態(tài)細(xì)胞中。 37培養(yǎng)15分鐘。然后加入：2-3ml NZY頂層培養(yǎng)基、15l IPTG和50l X-gal。I P T G （ I s o p r o p y l - b e t a - D -thiogalactopyranoside）； X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷）立即鋪入NZY固體培養(yǎng)基上，37過夜培養(yǎng)，測(cè)定文庫的滴度。文庫的滴度計(jì)算公式為：文庫滴度（pfu/ml）（噬菌斑數(shù)加入l數(shù)）* 稀釋倍數(shù) * 103l/ mlcDNA文庫噬菌斑照片cDNA文庫噬菌體PCR電泳圖6.2.2 從蛋白質(zhì)已知序列推知C末端5-6個(gè)氨基酸的相應(yīng)DNA序列，合成一組寡聚脫氧核苷酸片段作為引物。在總mRNA中這組引物只與該蛋白質(zhì)的mRNA可以氫鍵配對(duì)，以此引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到特性cDNA。6.2.3 利用RT-PCR技術(shù)可以得到特定的cDNA。6.3 PCR技術(shù)分離基因6.4 化學(xué)法合成目的基因隨著寡核苷酸的化學(xué)合成的自動(dòng)化，基因的化學(xué)合成變的更經(jīng)濟(jì)、容易和準(zhǔn)確?；瘜W(xué)合成基因?qū)δ切┢渌夹g(shù)方法不易分離的基因尤為重要。6.4.