實(shí)驗(yàn)三、質(zhì)粒DNA的提取2

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的分離提取的分離提取實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?了解堿法提取質(zhì)粒的原理；了解堿法提取質(zhì)粒的原理； 掌握堿法提取質(zhì)粒的方法。掌握堿法提取質(zhì)粒的方法。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 19461946年，美國(guó)科學(xué)家年，美國(guó)科學(xué)家LederburgLederburg 首先研首先研究了細(xì)菌的性因子究了細(xì)菌的性因子, ,并于并于19521952年由年由LederburgLederburg正式命名為質(zhì)粒。正式命名為質(zhì)粒。 質(zhì)粒是一種細(xì)菌染色體外的、具有自主質(zhì)粒是一種細(xì)菌染色體外的、具有自主復(fù)制能力的、雙鏈復(fù)制能力的、雙鏈DNADNA分子，大小可為分子，大小可為1kb1kb到到200kb200kb，

2、它隨寄主細(xì)胞穩(wěn)定遺傳。，它隨寄主細(xì)胞穩(wěn)定遺傳。質(zhì)粒類(lèi)型質(zhì)粒類(lèi)型質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類(lèi)型：質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類(lèi)型： 嚴(yán)緊型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒和和松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒 復(fù)制要在蛋白質(zhì)合成時(shí)和復(fù)制要在蛋白質(zhì)合成時(shí)和DNADNA聚合酶聚合酶的存在，只隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，拷貝的存在，只隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，拷貝數(shù)少，每個(gè)細(xì)胞只有數(shù)少，每個(gè)細(xì)胞只有1 11010個(gè)。個(gè)。松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒 松弛型質(zhì)粒的復(fù)制需要松弛型質(zhì)粒的復(fù)制需要DNADNA聚合酶聚合酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)周期中隨時(shí)可以復(fù)制，每個(gè)細(xì)在細(xì)胞生長(zhǎng)周期中隨時(shí)可以復(fù)制，每個(gè)細(xì)胞中有胞中有1010200200個(gè)以上的拷貝，有的甚至個(gè)

3、以上的拷貝，有的甚至達(dá)到上千個(gè)。達(dá)到上千個(gè)。質(zhì)粒的應(yīng)用質(zhì)粒的應(yīng)用 質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。用價(jià)值。 大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。 嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來(lái)表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受?chē)?yán)緊型質(zhì)粒用來(lái)表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。毒害致死的基因。三大要素：三大要素： 多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn) 選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記 （耐藥性，LacZ） 獨(dú)立的復(fù)制單位獨(dú)立的復(fù)制單位T-載體載體分離質(zhì)粒分

4、離質(zhì)粒DNADNA方法方法目前常用的目前常用的: :堿變性法堿變性法煮沸法煮沸法SDSSDS法法 羥基磷灰石層析法羥基磷灰石層析法堿變性法基本原理堿變性法基本原理 在在pH 12.0-12.6pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體菌染色體DNADNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNADNA仍為自仍為自然狀態(tài)。然狀態(tài)。 將將PHPH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體體DNADNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNADNA和蛋白質(zhì)在去污劑和蛋白質(zhì)在去污劑S

5、DSSDS的作用下形成沉淀，的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒而質(zhì)粒DNADNA仍為可溶狀態(tài)，通過(guò)離心可除去大部仍為可溶狀態(tài)，通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體分細(xì)胞碎片、染色體DNADNA、RNARNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNADNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒粒DNADNA。實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 （一） 儀器 1. 恒溫?fù)u床 2. 超凈工作臺(tái) 3. 高壓滅菌鍋 4. 高速臺(tái)式離心機(jī) 5. 微量取液器 （二）（二） 材料材料 含含pGEX-4T-2pGEX-4T-2質(zhì)粒的大腸桿菌質(zhì)粒的大腸桿菌 JM109JM109。（三）（三） 試劑試劑 1

6、. LB1. LB液體培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基（1L1L） 胰蛋白胨胰蛋白胨 10g 10g 酵母提取物酵母提取物 5 g 5 g NaCl NaCl 10 g 10 g 加去離子水至加去離子水至800ml 800ml 攪拌，使溶質(zhì)完全溶解，用攪拌，使溶質(zhì)完全溶解，用NaOHNaOH調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)pHpH值至值至7.07.0，加入去，加入去 離子水至總體積為離子水至總體積為1 1升，高壓蒸汽滅菌升，高壓蒸汽滅菌20 20 分鐘。分鐘。 LBLB固體培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基（1L1L） 在上述在上述LBLB液體培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基（1L1L）中加入瓊脂粉）中加入瓊脂粉15g15g。 2. Solution 50 m

7、mol/L 葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA ( (pH 8.0) ) 高壓滅菌后，高壓滅菌后，44保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩?3. Solution(現(xiàn)用現(xiàn)配制現(xiàn)用現(xiàn)配制) ) 0.2 mol/L NaOH 1% SDS 4. Solution 4. Solution （100 ml100 ml） 5mol/L KAc5mol/L KAc 60 ml 60 ml 冰醋酸冰醋酸 11.5 ml 11.5 ml 水水 28.5 ml 28.5 ml 配制成的溶液配制成的溶液含含3 mol/L3 mol/L鉀鹽、鉀鹽、5 mol/L5 mo

8、l/L醋酸醋酸 （pH 4.8pH 4.8）。）。 5. 5. 氨芐青霉素（氨芐青霉素（AmpAmp） 用無(wú)菌水配制成用無(wú)菌水配制成100 mg/ml 100 mg/ml 溶液，置溶液，置-20-20冰箱保存冰箱保存?zhèn)溆?。備用?6. 6. 胰胰RNARNA酶酶 將胰將胰RNARNA酶（酶（RNA RNA 酶酶 A A）溶于）溶于10 10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L 15 mmol/L NaClNaCl中，中， 配成配成10 mg/ml10 mg/ml的濃度，于的濃度，于100100加熱加熱1515分鐘，緩

9、慢冷卻至室溫，分分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于裝成小份保存于-20-20。 7. 7. 氯仿，乙醇氯仿，乙醇 ，70%70%乙醇。乙醇。質(zhì)粒提取的實(shí)驗(yàn)步驟質(zhì)粒提取的實(shí)驗(yàn)步驟 1. 1. 用滅菌的牙簽挑取單菌落放入用滅菌的牙簽挑取單菌落放入50ml LB50ml LB液體培養(yǎng)基（含液體培養(yǎng)基（含Amp Amp 0.1 mg/ml 0.1 mg/ml ）中，）中，3737振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；振蕩培養(yǎng)過(guò)夜； 2. 2. 將菌液倒入將菌液倒入1.5 ml Eppendorf1.5 ml Eppendorf管中，管中，10,000 rpm10,000 rpm離心離心3030秒，秒，去掉上清液，重復(fù)兩次

10、；去掉上清液，重復(fù)兩次； 3. 3. 加入加入100L SolutionI100L SolutionI 漂洗沉淀，倒盡液體；漂洗沉淀，倒盡液體； 4. 4. 加入加入100L 100L 用冰預(yù)冷的用冰預(yù)冷的SolutionISolutionI, , 渦旋使沉淀充分懸浮，室渦旋使沉淀充分懸浮，室溫放置溫放置5 5分鐘；分鐘； 5. 5. 加入加入200L SolutionII200L SolutionII，混勻（快速顛倒混勻，混勻（快速顛倒混勻3030次，注意動(dòng)次，注意動(dòng)作輕），室溫放置作輕），室溫放置2min2min。 6. 6. 加入加入150L150L用冰預(yù)冷的用冰預(yù)冷的SolutionI

11、IISolutionIII，溫和顛倒混勻（注意動(dòng)，溫和顛倒混勻（注意動(dòng)作輕）作輕） ，冰浴放置，冰浴放置2 25min5min。 7. 12,000rpm7. 12,000rpm，離心，離心10min10min，將上清移至，將上清移至1 1個(gè)新個(gè)新EppendorfEppendorf 管中，注意所取體積（約管中，注意所取體積（約400 L 400 L ） 。 6. 6. 加入等體積氯仿（約加入等體積氯仿（約400 L 400 L ），混勻（注意動(dòng)作），混勻（注意動(dòng)作輕）。輕）。12,000rpm12,000rpm，44，離心，離心10min10min，取上清液。，取上清液。 7. 7. 上清液

12、中加入預(yù)冷的等體積異丙醇，上清液中加入預(yù)冷的等體積異丙醇，-20-20沉淀沉淀 2030 min2030 min。 8. 12,000 rpm8. 12,000 rpm離心離心15 min15 min。 9. 9. 去上清，沉淀加入去上清，沉淀加入500L 70%500L 70%乙醇洗滌乙醇洗滌2 2次次（ 12,000 rpm12,000 rpm離心離心3 3分鐘）。分鐘）。 10. 10. 去掉上清（注意沉淀勿丟失），室溫或真空干去掉上清（注意沉淀勿丟失），室溫或真空干燥沉淀。燥沉淀。 11. 11. 每管中加入每管中加入25L25L無(wú)菌水無(wú)菌水1L RNase1L RNase， 3737

13、溶溶解質(zhì)粒解質(zhì)粒DNADNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論 堿法提取質(zhì)粒的注意事項(xiàng)堿法提取質(zhì)粒的注意事項(xiàng)試劑盒操作方法【實(shí)驗(yàn)步驟【實(shí)驗(yàn)步驟】1、將培養(yǎng)好的、將培養(yǎng)好的12 ml細(xì)菌細(xì)菌12,000 rpm離心離心2min，去上清。，去上清。2、加、加250 l Solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌。，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌。3、加入、加入250 l Solution II，立即上下顛倒，立即上下顛倒510次，使細(xì)菌裂解，室次，使細(xì)菌裂解，室溫放置溫放置2分鐘。分鐘。4、加入、加入 400 l Solution III，立即上下顛倒，立即上下顛倒510次，使之充分中和，次，使之充

14、分中和，室溫放置室溫放置2-4分鐘。分鐘。5、12,000 rpm離心，離心，10分鐘。分鐘。6、將步驟、將步驟5中的上清轉(zhuǎn)移到套放于中的上清轉(zhuǎn)移到套放于2.0 ml收集管內(nèi)的收集管內(nèi)的spin column柱柱中，中，12,000 rpm室溫離心室溫離心60秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。入同一個(gè)收集管中。7、向吸附柱中加入、向吸附柱中加入500微升的微升的Rnase A, 12,000rpm離心離心30秒。倒掉秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。8、向吸附柱中加入向吸附柱中加入700微升的微升的Rnase B, 12,000rpm離心離心30秒。秒。