人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)

1、人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)摘要：正常情況下哺乳動物的外周血中沒有分裂相，這是由于外周血中的小淋巴細胞大多處于G0期。但在一定條件下，外周血中的小淋巴細胞受刺激轉(zhuǎn)化成淋巴母細胞，隨后進入有絲分裂。本實驗介紹人外周血淋巴細胞的培養(yǎng)方法，染色體標本的制備和正常人染色體的組型分析。1關(guān)鍵詞：外周血淋巴細胞低滲處理空氣干燥法染色體組型分析前言：人體外周血細胞培養(yǎng)是制備染色體標本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作簡便。1960年Nowell和Morhead驗證，使紅細胞凝集從而能分離出白細胞的植物凝集素Pphytohaemagglutinin,PHA）是人和其他動物淋巴細胞的有絲分裂的刺激劑。在PHA

2、的作用下，原來處于Go期的淋巴細胞轉(zhuǎn)換為淋巴母細胞，進而進行有絲分裂。這樣經(jīng)過短期培養(yǎng)，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺進行處理，經(jīng)過低滲和固定，就可獲得大量的處于有絲分裂時期的細胞2,因為秋水仙素（或秋水酰胺）可通過干擾微管組裝而抑制紡錘絲形成，使細胞分裂順利進入后期而停滯于中期，從而可在短期內(nèi)積累大量最適于進行染色體分中期分裂相。此外，秋水仙素還能使染色單體縮短、分開，使染色體呈現(xiàn)明顯形而利于辨認。淋巴細胞經(jīng)過培養(yǎng)以后，形成了體外活躍生長的細胞群體，經(jīng)過空氣干燥法制片。所謂空氣干燥法，實際上是將細胞經(jīng)過秋水仙素一低滲處理一充分的固定一滴片等步驟之后再載玻片上得到染色體制片的技術(shù)。有時，有人把滴

3、片的步驟叫做染色體分散，也有人把這一步和隨后的干燥稱為空氣干燥法?！翱諝飧稍铩本褪堑纹?，不加熱或任何處理，使載玻片在室溫中自然干燥的方法。3淋巴細胞的培養(yǎng)已成為制備染色體的最主要的方法。因為該法材料便宜易得，對同一個體可進行連續(xù)觀察，并可得到優(yōu)良的染色體制片。各種因素的作用效應(yīng)（如病毒、電離輻射、化學(xué)試劑等）可在淋巴細胞的培養(yǎng)條件下進行觀察，從而可進行多種在體內(nèi)無法進行的研究。本方法已在臨床醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、遺傳毒理學(xué)等方面廣泛應(yīng)用。2染色體標本制備過程中有兩個重要環(huán)節(jié)，其原理是：（1）低滲處理：目的是使水分通過細胞膜向細胞內(nèi)滲入，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的淋巴細胞，染色體進一步分散而利于分析。同時，低

4、滲處理還可使紅細胞質(zhì)膜破裂，經(jīng)后血影浮于上清中被去除，后續(xù)的固定過程主要針對淋巴細胞，改善了淋巴細胞的固定質(zhì)量及標本質(zhì)量。（2）固定：目的在于盡快使細胞的結(jié)構(gòu)固定于接近存活的狀態(tài)，以便作進一步處理，若不固定則可因細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化。染色體研究中常用固定液為甲醇一冰醋酸（3:1）固定液。冰醋酸滲透力強，固定迅速，但易使組織膨脹而甲醇則可使組織收縮，兩者混合使用能抵消各自的缺點，得到較好的固定效果。1 .材料方法1.1 材料人的外周血淋巴細胞。1.2 器具采血針、20mL培養(yǎng)瓶、毛細管、離心管、載玻片和蓋玻片、顯微鏡、恒溫箱、離心機、電子天平、分析天平、精密PH試紙、移液管、燒杯、酒精

5、燈、移液槍1.3 藥品1.3.1 RPMI“1640培養(yǎng)基稱取“164嗝末1.05g,用100mL的雙蒸水溶解，溶解后pH值調(diào)至6.0。每1000毫升溶液加NaHCO31.0克，校正PH到7.1。1.3. 2肝素作為抗凝劑使用。稱取該粉末8mg（每mg含126單位），用2mL的生理鹽水溶解，此溶液的濃度為504單位/mL。1.3.3 生理鹽水用0.9克NaCL加入100mL蒸儲水中，配制溶液。1.3.4 秋水仙素作為有絲分裂的阻止劑，它能改變細胞質(zhì)的粘度，抑制細胞分裂時紡錘體形成，使細胞分裂停留在中期。稱取秋水仙素1mg,用25mL生理鹽水溶解，然后放入冰箱4c保存。使用時用1mL注射器吸取該

6、溶液0.1mL加入5mL的培養(yǎng)物中，其最終濃度為0.8微克/毫升。1.3.5 植物凝血素（PHA）是淋巴細胞有絲分裂刺激劑，本實驗采用的是市面上購買的PHA粉末，一個針劑為0.2mLo將1瓶粉末溶在2mL的蒸儲水中。1.3.6 抗菌素青霉素（以每瓶80萬單位為例）：將1瓶青霉素溶在8mL生理鹽水中，則每毫升含10萬單位。取0.1mL注入5mL的培養(yǎng)物中，則最終濃度為1000單位/mL。鏈霉素（以每瓶100萬單位為例）：以4毫升生理鹽水稀釋，則每毫升含100萬單位，取0.1mL注入5mL的培養(yǎng)物中，則最終濃度為100單位/mL。1.3.7 吉姆薩染液實驗室中有現(xiàn)成染液1.3.8 3.5%NaHC

7、O3溶液實驗室有已配好的試劑。1.3.9 0.1mol/L磷酸緩沖液實驗室有已配好的試劑。2方法步驟2.1分裝培養(yǎng)液用移液管將培養(yǎng)液和其他各試劑分裝入培養(yǎng)瓶中，每瓶量為：RPMI“1640培養(yǎng)基4mL小牛血清1mLPHA0.2mL雙抗（青霉素加鏈霉素）0.1mL用3.5%NaHCO3溶液調(diào)pH到7.3,分裝到20mL的培養(yǎng)瓶中，蓋好蓋子，用標簽紙標清姓名，置于冰柜中保存。用前從冰柜內(nèi)取出，放入37c恒溫鍋中溫育10min。2.2 采血用酒精消毒手指皮膚，用采血針刺破皮膚，再用毛細管取血0.3mL全血，吹入瓶中，輕輕搖動幾下，蓋好蓋子，直立置于37c恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。2.3 培養(yǎng)置37c溫箱內(nèi)培養(yǎng)7

8、2小時一一這個時間恰好是白細胞分裂的兩個周期。2.4 秋水仙素處理40g/mL的秋水仙素0.1mL,最終濃度為0.8科培養(yǎng)終止前在培養(yǎng)物中加入濃度為g/mL,置恒溫箱中處理4ho2.5 低滲處理秋水仙素處理完畢，小心地從溫箱取出培養(yǎng)瓶，用滴管吸棄上清液，培養(yǎng)物沉積在瓶底，然后加入溫育的低滲液（蒸儲水）5mL,用滴管輕輕沖打成細胞懸液，裝入離心管中置37c溫箱處理20min,使紅細胞破碎，白細胞膨脹。2.6 離心以1000r/min,離心5min10s,棄去上清液，收集白細胞。2.7 固定加入固定液（甲醇：冰乙酸=3：1,臨時配制）3mL,片刻后用滴管輕輕沖打成細胞懸液，在室溫中固定15min后

9、，離心，吸去上清液，留下白細胞。2.8 再固定加入固定液2mL,用吸管輕輕打散，室溫下繼續(xù)固定15min（過夜也可以）。2.9 再離心以1000r/min,離心5min10s,除去上清液，留下白細胞制片。2.10 制片用吸管吸取細胞懸液自1m高處，滴在從冰柜中取出的一塊干燥潔凈的載玻片上，每片滴加懸液13滴，用嘴輕輕吹散，在酒精燈火焰上微微烤干。2.11 染色用磷酸緩沖液（PH7.4）稀釋過的Geimsa染色液（1：10）染色20min,然后倒去多余染液。并用蒸儲水輕輕沖洗。2.12 鏡檢待稍干后，在顯微鏡下觀察。先用低倍尋找良好的分裂相，然后用高倍油鏡觀察。選擇染色體清晰、分散度好的細胞進行

10、核型分析。3結(jié)果分析3.1 實驗結(jié)果該圖為顯微鏡視野內(nèi)所拍到的圖3.2 核型分析：人類每個體細胞有46條染色體，22對常染色體和一對性染色體，男子是46,XY;女子是46,XX?？梢詫⑷说?6條染色體分成A、B、C、D、E、F、G七群，作為進一步識別和鑒定染色體的依據(jù)。三個參數(shù)：(1)染色體的相對長度(2)臂比率(3)著絲點指數(shù)4分析討論4.1 實驗誤差分析實驗利用的是植物凝血素(PHA)使停止分裂的細胞恢復(fù)分裂的原理來獲得大量的有絲分裂細胞，從而便于對染色體經(jīng)行觀察。但淋巴細胞經(jīng)過培養(yǎng)后，制成的標本質(zhì)量不佳，染色體不明顯，視野中除有染色體以外還有雜菌等，其原因可能為：(1)未作滅菌處理，由于

11、細胞培養(yǎng)是在37c的環(huán)境中進行的，而此溫度也是細菌繁殖的最適溫度，所以雜菌會出現(xiàn)在視野中。(2)秋水仙素處理不當，一般秋水仙素溶液的濃度與處理時間有一定的關(guān)系，如果處理時間太短，則標本中的分裂細胞就少，相反，如果處理時間太長，則標本中的分裂細胞雖多，但其染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊，不容易觀察。(3)低滲處理不當：低滲處理細胞時間過長，細胞膜往往過早破裂，以致分裂細胞或染色體丟失；如果處理時間不足時，細胞膨脹不夠，則染色體分散不佳，難以進行染色體計數(shù)分析。(4)低滲處理完后，細胞懸液可能并沒有變渾濁，這有可能是用蒸儲水做低滲液沒有使紅細胞完全破裂，沒有使白細胞充分的膨脹，從而會影響到觀察的

12、結(jié)果。(5)在兩次離心后，在離心管底沒有看到明顯的沉淀，有可能是培養(yǎng)基酸堿度沒有調(diào)到最適的pH值或是培養(yǎng)時間短而導(dǎo)致白細胞量不足，從而影響了觀察結(jié)果。(6)標本固定不充分：如固定液不新鮮，甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，此時染色體形態(tài)模糊、不分散，其周圍有細胞漿的藍色背景。(7)載玻片清洗不徹底：玻片有油跡，致使滴在載玻片上的細胞懸液不能均勻分散，且細胞隨液體流動而丟失。(8)載玻片冷凍不夠：合適的冰濕玻片，從冰水中拿出時，其表面有一層霜雪。如冷凍不夠則無此現(xiàn)象，此時細胞難以貼附在載玻片上。(9)核型圖中染色體有的變粗，而有的很細小。造成這種結(jié)果的原因可能是秋水仙素處理不徹底，一部分染色體加倍，而一部

13、分沒有。4.2 實驗注意事項4.2.1 接種的血樣愈新鮮愈好，最好是在采血后24小時內(nèi)進行培養(yǎng)，如果不能立刻培養(yǎng)，應(yīng)置于4c存放，避免保存時間過久，會影響細胞的活力.4.2.2 在培養(yǎng)中成敗的關(guān)鍵，除了至為重要的PHA的效價外，培養(yǎng)的溫度和培養(yǎng)液的酸堿度也十分重要.人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)最適溫度為37S.5C.培養(yǎng)液的最適pH7.27.4.4.2.3 適量的秋水仙素、適宜的處理時間，是獲得良好分裂相的先決條件。這將影響分裂相的多少和染色體的長短。由于秋水仙素有強烈的毒性作用，用量過大，作用時間過長，可使縮短和發(fā)生異常分裂現(xiàn)象，甚至導(dǎo)致染色體破碎；反之，則染色體數(shù)量少而形態(tài)細長。都不宜觀察形態(tài)及

14、計數(shù)。故秋水仙素的濃度及時間要準確掌握。4.2.4 低滲處理是獲得分散良好的分裂相的關(guān)鍵步驟。低滲使紅細胞膜破裂，淋巴細胞膨脹，低滲處理濃度及時間要適當。低滲后混勻細胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。低滲不夠，則染色體聚在一起，分散不好。太過，則造成細胞破碎，染色體丟失。注意，低滲液在使用前需要在37c溫箱預(yù)溫。4.2.5 充分的固定是制備良好分散的染色體的重要步驟。如果染色體分散的不好，可在余下的細胞懸液中改為甲醇：冰醋酸=1:3的固定液，有時可改善由于低滲處理不夠或固定不充分所造成的缺陷。固定時間可以延長數(shù)小時或過夜。特別要注意的是，固定液要新鮮配制，否則將會形成酯類，從而影響固定的

15、效果。4.2.6 固定液純度要高，臨用時新鮮配制，應(yīng)沿管壁慢慢加入后打勻，如果固定液加入太快，會使固定作用過強，染色體扭轉(zhuǎn)；固定液作用不足，染色體出現(xiàn)毛刷狀。4.2.7 滴片是制備染色體的最后一步，也是非常關(guān)鍵的一步。首先載玻片要非常干凈，否則將會影響染色體的分散的效果。其次，滴片的距離、滴加量的多少、制片的方式都會影響到染色體分散的效果。分裂相過多或過少，染色體過于分散都會影響到染色效果和觀察。4.2.8 在整個操作過程中，要注意不要將細胞吸到吸管上部，也不要接觸離心管的上部，否則將會丟失許多細胞。4.2.9 機械打散細胞團時，用力要適度，若用力過猛，細胞易破碎，染色體不完整。4.2.10 制片過程中，如發(fā)現(xiàn)細胞膨脹得不大，細胞膜沒有破裂，染色體聚集一團伸展不開，可將固定時間延長數(shù)小時或過夜.4.2.11 配藥品時需要注意分析天平是否水平。5內(nèi)容改進5.1 抗菌素的配制以青霉素為例：青霉素，每瓶80萬單位，可用1.6mL生理鹽水稀釋，則每毫升含50萬單位。取0.0