ABTS自由基清除能力測定法ABTS測定法操作圖解-ABTS清除法(最新版)- 以高香草酸為例

1、ABTS自由基清除能力測定法-ABTS測定法-操作圖解-ABTS清除法（最新版）-以高香草酸為例【原理】ABTS法常常被用于檢測物質(zhì)的體外抗氧化能力。穩(wěn)定的自由基ABTS+溶液顯藍(lán)綠色，在734nm上有最大吸收。這種自由基可以通過ABTS與K2S2O8反應(yīng)生成。當(dāng)自由基被清除，數(shù)量減少，它的溶液顏色會(huì)變淺，734nm下吸光度降低，由此可以來判斷樣品清除ABTS+的能力。圖1.ABTS結(jié)構(gòu)式【實(shí)驗(yàn)對象】高香草酸（Homovanillicacid），學(xué)名“4-羥基-3-甲氧基苯乙酸”分子式為C9H9O4，為兒茶酚胺（腎上腺素、去甲腎上腺素）的代謝產(chǎn)物。關(guān)于高香草酸抗氧化活性的研究非常少，因其結(jié)構(gòu)與

2、咖啡酸相比少一個(gè)雙鍵，高香草酸與咖啡酸的抗氧化活性作用有相似之處，故提出研究。本實(shí)驗(yàn)僅用于驗(yàn)證ABTS實(shí)驗(yàn)可行性與合理性。圖3.高香草酸結(jié)構(gòu)式圖4.高香草酸的分子模型（基于Chem3D,MM2優(yōu)化）【儀器與試劑】1儀器可見分光光度計(jì)；SB3200D超聲波清洗機(jī)；電子天平（BS110S）；BIOHIT單道手動(dòng)可調(diào)移液器（10-100"、100-1000"、1000-5000"）；微量比色皿。2試劑Homovanillicacid（AR）、ABTS（AR）、無水乙醇（AR）；KSO（AR）228【實(shí)驗(yàn)操作】清除ABTS能力檢測本實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)1的方法，并視情況改動(dòng)。我們

3、選取Caffeicacid作1.ABTS自由基儲(chǔ)備液的配置0.2mL7.4mmol/LABTS儲(chǔ)備液+0.2mL2.6mmol/LK2S2O8儲(chǔ)備液為實(shí)驗(yàn)對象，其實(shí)驗(yàn)過程大致如下：避光放置12h使用前用95%乙醇稀釋成ABTS+工作液，要求在300，734nm波長下的吸光度為0.700±0.02。2.樣品液的配置預(yù)試樣品先配置成1mg/mL>根據(jù)預(yù)試結(jié)果調(diào)節(jié)濃度溶劑根據(jù)樣品的極性進(jìn)行選擇，首選95乙醇或無水乙醇，如不溶可用DMSO。3.預(yù)試800"ABTS自由基溶液+少量樣品液先少后多漸加>溶液顏色基本褪去時(shí)，記下加樣量在此加樣量的基礎(chǔ)上，往前設(shè)置5個(gè)用量，使之

4、成等差數(shù)列。4.測定A0值：800|1LABTS溶液+200"95%乙醇混合>測在734nm處A734nm值，為A。5.測定A值：800"ABTS溶液+高香草酸溶液（0.0005mol/L）x"（x為2，4，6，8,10，12，14，16）+95%乙醇（200-x）"混合，靜置6min>加樣情況如表1所示。實(shí)驗(yàn)設(shè)試劑空白組和樣品實(shí)驗(yàn)組，平行測定3次取平均值。表1清除ABTS+能力測定的加樣表測A734nm，實(shí)驗(yàn)平行檢測三次樣品液（卩L）95%乙醇（吐）ABTS+工作液（卩L）總體積（卩L）219880010004196800100061948

5、00100081928001000101908001000121888001000141868001000161848001000計(jì)算公式：清除率=（A0-A）/A0*100%式中，A0為樣品濃度為0時(shí)的A734nm值；A為樣品的A734nm值?！咀⒁馐马?xiàng)】每次使用前先測量空板吸光度并保存數(shù)據(jù)，實(shí)際吸光度=測量吸光度-空板吸光度。當(dāng)加入較少量樣品(如2卩1)時(shí)，移液器盡量垂直打入孔內(nèi)，如掛液在槍頭可輕輕觸碰孔內(nèi)液體使其吸附，但注意下次取樣需換槍頭；如樣品沾到孔壁，可把移液器調(diào)制10"左右，吸取孔內(nèi)溶液以沖壁，同樣下次取樣需換槍頭。以上操作槍頭均不能觸碰孔板底以免損壞槍頭?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】

6、表2.ABTS清除法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)ABTS清除法Homovanillicacid(0.O005mol/L)A0:0.601IC50:0.O02889mmol/L加樣量(yL)最終濃度(mmol/L)吸光度A清除率平均清除率SD20.0010.47123.90953219.978463.4510440.50418.5783520.51117.44749640.0020.35445.3703741.100823.8311820.38939.9691360.40237.96296360.0030.28457.09969857.653582.3900190.26360.2719030.29455.58912

7、480.0040.22467.10719564.39063.8418430.26161.674009100.0050.1572.27356772.704870.7470340.1572.2735670.14373.567468120.0060.08285.11796784.331522.3686350.10181.6696910.07686.206897140.0070.0590.89253291.621129330.6567490.04392.1675770.04591.803279160.0080.03893.14079493.922984360.6833820.03294.2238270.03194.40433210080o60200i1I'I1I1I1I1I1I1I1I0.0000.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.009Concentration(mmol/L)圖5.Homovanillica量效曲線(實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3)【參考文獻(xiàn)】1XicanLi,TingtingWang,JingjingLiu,YulongLiu,JunZhang,JianLin,ZhongxiangZhao,DongfengChen.Effecta