【專題討論】超詳細(xì)包涵體復(fù)性常見問題分析

1、專題討論】超詳細(xì)包涵體復(fù)性常見問題分析包涵體復(fù)性常見問題分析1.對于尿素和鹽酸胍該怎么選擇?尿素和鹽酸胍屬中強(qiáng)度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn)，故目前已被廣泛采用。鹽酸胍溶解能力達(dá)95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉

2、淀、復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點(diǎn)。2. 怎樣洗滌包涵體？通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，可以找到一個合適去除雜質(zhì)的辦法，其實這就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脫效果好。3. 8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存?在4度放置半個月，都沒什么問題。在室溫放置超過48小時，可能會對目的蛋白有影響，因為尿素在堿性條件下可使一些氨基酸?；栽缧┨幚鞡I溶液比較好。4. 包涵體復(fù)性有什么原則？低濃度，平緩梯度

3、，低溫。5. 復(fù)性時的蛋白濃度是？一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟(jì)，而且很多蛋白在低濃度時不穩(wěn)定，很容易變性。6. 復(fù)性中蛋白析出是怎么回事？該怎么處理？出現(xiàn)蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復(fù)性應(yīng)該采取復(fù)性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據(jù)包涵體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。但是復(fù)性的比率應(yīng)該很低。若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M;另外可將甘油濃度增加，范圍可在30%，且在復(fù)性樣品中也可加適量甘油。包涵體復(fù)性效率和檢測復(fù)性是一個非常復(fù)雜

4、的過程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL-11，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點(diǎn)幾。一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測。其效果檢測方法如下：1. 凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳

5、可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對情況。2. 光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測。3. 色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。4. 生物學(xué)活性及比活測定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。5. 黏度和濁度測定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的

6、沉淀析出。6. 免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。包涵體復(fù)性的方法一個有效的、理想的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備以下幾個特點(diǎn)：活性蛋白質(zhì)的回收率高；正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤折疊蛋白質(zhì)分離；折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品；折疊復(fù)性方法易于放大；復(fù)性過程耗時較少。1. 透析、稀釋和超濾復(fù)性法：這三種方法是最傳統(tǒng)也是應(yīng)用最普遍的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性方法，復(fù)性活性回收率低，而且難于與雜蛋白分離。透析法耗時長，易形成無活性蛋白質(zhì)聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利于工業(yè)放大。2. 凝膠過濾層析復(fù)性凝膠過濾層析復(fù)

7、性又稱體積排阻復(fù)性(SEC),是一種廣泛應(yīng)用的層析技術(shù)。與常用的稀釋復(fù)性法相比，凝膠過濾層析復(fù)性能在高的起始蛋白濃度下對蛋白進(jìn)行復(fù)性，活性回收率較高，同時又能使目標(biāo)蛋白得到一定程度的純化。凝膠過濾復(fù)性時，除了蛋白質(zhì)在膠粒中的傳質(zhì)和擴(kuò)散外，蛋白質(zhì)與介質(zhì)之間并不發(fā)生其它任何作用。復(fù)性過程始終發(fā)生在溶液中。蛋白質(zhì)在伸展?fàn)顟B(tài)中，每個蛋白質(zhì)分子的伸展?fàn)顟B(tài)都會有差別，而不同伸展?fàn)顟B(tài)的蛋白質(zhì)分子在凝膠顆粒內(nèi)部擴(kuò)散所受到的限制也不相同，有的會擴(kuò)散入顆粒內(nèi)部深一些，有的會淺一些，這使不同伸展?fàn)顟B(tài)的蛋白質(zhì)分子達(dá)到一定程度的分離，這樣蛋白質(zhì)分子問相互作用的機(jī)會就大大減少，從而起到一定抑制凝集的作用；即使發(fā)生了部分凝

8、集，凝集的蛋白質(zhì)會附著在膠粒上，而不隨著溶液向下運(yùn)動，這樣后面的變性劑可以趕上凝集的蛋白質(zhì)，使其重新溶解并變性；并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對較慢，這對有些蛋白質(zhì)的復(fù)性是有利的。在普通凝膠過濾中，變性劑和還原劑的脫除雖較稀釋復(fù)性慢，但變性蛋白質(zhì)仍會經(jīng)歷變性劑濃度突然變化的過程。脲梯度復(fù)性是樣品上柱前用復(fù)性緩沖液平衡柱子，接著使變性劑濃度遞減（如從6M鹽酸胍或8M尿素下降到復(fù)性緩沖液中預(yù)先確定的變性劑的濃度）。此法為蛋白質(zhì)復(fù)性提供了一個較溫和的環(huán)境，實現(xiàn)了線性去除變性劑，對高濃度變性蛋白質(zhì)的復(fù)性效果十分顯著。對初始濃度為17mg/ml的還原變性溶菌酶在40min內(nèi)可以得到高達(dá)90%的活性回

9、收率。此外在脲梯度SEC的基礎(chǔ)上發(fā)展了pH和脲濃度雙梯度SEC法用于蛋白復(fù)性，效果很好。在SEC復(fù)性的基礎(chǔ)上設(shè)計的連續(xù)基質(zhì)輔助蛋白復(fù)性系統(tǒng)能使變性蛋白定量地轉(zhuǎn)換成復(fù)性的天然態(tài)蛋白。此復(fù)性方法能夠?qū)?fù)性過程中產(chǎn)生的蛋白聚集體再次復(fù)性，使蛋白最大程度地得到回收。伴侶溶劑塞（Chaperonsolventplug)SEC復(fù)性法在一定程度上解決了變性蛋白進(jìn)入柱頂端之前發(fā)生沉淀這一問題。此外，抗體、小分子添加劑如L-精氨酸和環(huán)糊精等共價結(jié)合到SEC固定相上也可能會提高某些蛋白的復(fù)性效率，同時又能使這些物質(zhì)得以重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本。3. 高蛋白濃度下的復(fù)性方法：一個成功的復(fù)性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍

10、能得到較高的復(fù)性率。一個方法是把變性蛋白緩慢連續(xù)或不連續(xù)地加入到復(fù)性液中。在兩次蛋白加入之間，應(yīng)有足夠的時間間隔使蛋白質(zhì)折疊通過了易聚集的中間體階段。這是由于完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。第二種方法是用溫度跳躍策略。變性蛋白在低溫下復(fù)性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉(zhuǎn)化為不易聚集的后期中間體后，溫度快速升高來促進(jìn)后期中間體快速折疊為蛋白的天然構(gòu)象。第三種方法是復(fù)性在中等的變性劑濃度下進(jìn)行，變性劑濃度應(yīng)高到足以有效防止聚集，同時又必須低到能夠引發(fā)正確復(fù)性。4. 添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法：包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進(jìn)劑的促進(jìn)作用可以分為：穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、改變錯誤折疊

11、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、增加折疊復(fù)性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解性。通常使用的添加劑有：a) 共溶劑：如PEG600020000，通過與中間體特異的形成非聚集的復(fù)合物，可以阻止蛋白質(zhì)分子間的相互碰撞機(jī)會，減少蛋白質(zhì)的聚集；b) 去污劑及表面活性劑：如TritionX-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜堿等對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用，但它們能與蛋白質(zhì)結(jié)合，很難去除；c) 氧化-還原劑：對于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程中應(yīng)加入氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化還原系統(tǒng)通過促進(jìn)不正確形成的二硫鍵快速交換反應(yīng)，提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率；d) 小分子的添加劑：如

12、鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)、降低非正確折疊的穩(wěn)定性、增加折疊中間體的穩(wěn)定性、增加解折疊狀態(tài)的穩(wěn)定性。e、0.40.6ML-Arg:L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進(jìn)行，可大幅度地提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。e) 添加分子伴侶和折疊酶：分子伴侶是指能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，并能通過有控制的結(jié)合和釋放，促進(jìn)新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細(xì)胞器蛋白的跨膜運(yùn)輸?shù)囊活惖鞍踪|(zhì)。折疊酶有二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酸異構(gòu)酶等。分子伴侶和折疊酶都能在體外調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的正確折疊，提

13、高蛋白質(zhì)的合成效率。但這類蛋白在折疊復(fù)性后要除去，而且十分昂貴，因此采用可回收利用的方法如固定化法為好。f）人工伴侶：為模仿分子伴侶而發(fā)展的一種方法：首先，變性蛋白被復(fù)性液中的去污劑捕獲，形成蛋白-去污劑復(fù)合體，復(fù)合體的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入環(huán)糊精從復(fù)合體中去除去污劑，使得蛋白質(zhì)正確折疊。g）單克隆抗體：待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的抗體可有效協(xié)助復(fù)性，但只限于此蛋白才能獲得明顯的助折疊作用。h）其它：多聚離子化合物如肝素可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的復(fù)性，具有穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的作用；甘油可以增加黏度，減少分子碰撞的機(jī)會，減少錯配以提高復(fù)性效率；適量的鹽濃度可以降低某些帶電基團(tuán)間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊；輔助

14、因子、短鏈醇、高滲物等能有效的降低聚集體的形成，對蛋白有穩(wěn)定的作用。5. 液相色譜（LC）復(fù)性法：液相色譜是一種最有效的純化蛋白質(zhì)的方法，已成為基因重組蛋白質(zhì)純化的必不可少的手段，現(xiàn)有報道，疏水相互作用色譜（HIC）離子交換色譜（IEC）凝膠排阻色譜（SEC）親和色譜（AFC）已成功的對變性蛋白進(jìn)行了復(fù)性。與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比，液相色譜復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)是：a）在進(jìn)樣后可很快的除去變性劑；b)由于色譜固定相對變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質(zhì)分子在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產(chǎn)生，提高蛋白質(zhì)復(fù)性的質(zhì)量和活性回收率；包涵體形成原因及減少策略形成原因1. 表達(dá)量過高

15、，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。2. 重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。3. 重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時容易形成包涵體。4. 重組蛋白是大腸桿菌(Escherichiacoli)的異源蛋白，由于缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。5. 有報道認(rèn)為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時，容易形成包涵體。減少包涵體形成的策略

16、1. 降低重組菌的生長溫度，降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。2. 添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑，培養(yǎng)E.coli時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質(zhì)的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng)，在最適濃度范圍內(nèi)添加這些添加劑不會影響細(xì)胞的生長、蛋白質(zhì)的合成或運(yùn)輸，其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑還有乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl。3. 供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧、pH等。包涵體復(fù)性原理包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時，尤其在大腸桿菌（Escherichiacoli）中高效表達(dá)時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時為