723分光光度計使用方法

1、最佳答案1 .接通電源，打開儀器開關(guān)，掀開樣品室暗箱蓋，預熱 10 分鐘。 2.將靈敏度開關(guān)調(diào)至“ 1檔（若零點調(diào)節(jié)器調(diào)不到”“ 0時，需選用較高檔。）”3.根據(jù)所需波長轉(zhuǎn)動波長選擇鈕。4.將空白液及測定液分別倒入比色杯處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，使空白管對準光路。5.在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤指針指向 t=0 處。6.蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)“100調(diào)節(jié)器，使空白管的”t=100,指針穩(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測定管的光密度值，并記錄。7. 比色完畢，關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈分光光度計使用的外部環(huán)境要求分光光度計屬于精密儀器，應當妥善保管和精心維

2、護，這樣才能保證分光光度計長期使用、長期的穩(wěn)定可靠、測量精度高。元析公司在多年的生產(chǎn)和應用的過程中，得到了一套在一定環(huán)境下維護分光光度計的經(jīng)驗，具體如下：1 、環(huán)境溫度在條件容許的情況下，盡量保持在15-30 攝氏度之間，這樣能保持電器件穩(wěn)定工作，不易老化，使分光光度計不易損壞，燈源的使用壽命得到延長。若條件不容許，在高溫的情況下，縮短開機時間，高效使用分光光度計，使電器件不要長期保持在高溫下。在低溫下，使預熱時間比常溫下的預熱時間要長，這樣能保證在儀器穩(wěn)定的情況下進行測試。2 、環(huán)境濕度在條件容許的情況下，盡量保持在60%以下，這樣能保證光度計內(nèi)部的光學件和電器件不易受潮、腐蝕、和上霉。若條

3、件不容許，在高濕度和低濕度的情況盡量保持通風。3、環(huán)境在條件容許的情況下盡量保持潔凈，打掃環(huán)境時動作不宜太大，不要揚起灰塵，打掃之前用防塵罩蓋上分光光度計，不要讓灰塵進入分光光度計內(nèi)部。以上僅就儀器使用的外部環(huán)境作了描述，以供使用用戶參考。分光光度計的使用分光光度計的應用常識分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度xx。核酸的定量核酸的定量是分光光度計使用頻率最

4、高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核甘酸，單鏈、雙鏈 DNA,以及RNA核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當于50區(qū)g/ml的dsDNA, 37 g/ml 的ssDNA 40區(qū)g/ml的RNA, 30 g/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的 換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。事實上，分光光度計的設計原理和工

5、作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如 Eppendorf Biophotometer 的準確度W1.0% 1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的 pH 值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數(shù)漂移，因此建議使用 pH 值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TEE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可 忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在

6、0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如 A260/A280 的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8 （DNA）或者2.

7、0 （RNQ。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230 的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品， A320一般是0。蛋白質(zhì)的直接定量（UVxx）這種方法是在280nm 波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的 “背景 ”信息，設定此功能 “開”。與測試核酸類似，

8、要求 A280的吸光值至少大于0.1A,最佳的線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù) “漂移 ” 。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280 的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如 DNA 的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的

9、化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應蛋白質(zhì)濃度。比色方法一般有BCA， Bradford， Lowry 等幾種方法。Lowry 法：以最早期的Biuret反應為基礎(chǔ)，并有所改進。蛋白質(zhì)與Cu2短應，產(chǎn)生藍色的反應物。但是與Biuret 相比， Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA， Triton x-100， ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。BCA （B

10、icinchonineacidassay 法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2板應產(chǎn)生Cu+,后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562nm 波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極強，反應后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于 Lowry 法，操作簡單，敏感度高。但是與 Lowry 法相似的是容易受 到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。具最大的特點是，敏感度好，是 Lowry和BCA兩種測試方法的2 倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩(wěn)定1

11、小時， 方便結(jié)果；而且與一系列干擾 Lowry, BCA反應的還原劑（如DTT,航基乙醇） 相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry, BCA測出的濃度明顯高于 Bradford,差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用 Lowry測試細胞勻漿中的

12、蛋白質(zhì)，以 BSA作 標準品，濃度1.34mg/ml,以a球蛋白作標準品，濃度2.64mg/ml。因此，在選 擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構(gòu)成，尋找化學構(gòu)成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是，反應后 1011分光光度計的重要配件 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括標準樣品），都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。止匕外，非常重要的是，最好是用塑料的比 色法

13、。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。細菌細胞密度（ OD 600）實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數(shù)，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細菌培養(yǎng)一段時間后，與 培養(yǎng)基反應，發(fā)生變色反應。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心

14、，保持細菌懸浮狀態(tài)。分光光度計的重要配件 比色杯比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測試樣品。由于另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50gl比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette?

15、塑料比色杯，是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學以及相關(guān)學科發(fā)展，對此類科學的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物學實驗室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實驗室的必備設備之一。分光光度技術(shù)6.1 基本原理利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質(zhì)進行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計，這種分光光度計靈敏度高，測定速度快，應用范圍廣，其中的紫外/ 可見分光光度技術(shù)更是生物化學研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本章重點討論紫外 / 可見分光光度法的基本原理、儀器構(gòu)造及其在生化領(lǐng)域中

16、的應用等。1. 光譜：光是電磁波，可用波長“震示，電磁波譜是由不同性質(zhì)的連續(xù)波長的光譜所組成，對于生物化學來說，最重要的波長區(qū)域是可見光和紫外光。光的波長是二個相鄰的 xx 之間的距離。光的傳播是由相互垂直的電場分量“前磁場分量“所構(gòu)成。壯C/ Y械長C光速一項率，單位時間通過一個定點的波數(shù)。光又可以看作是由具有能量的粒子所組成。這些粒子所具有的原能量“曲下式算出：E= h? yH普朗克常數(shù)（6.624 X 10-27格？秒）頻率紫外區(qū)可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠紫外）。由于吸收池（又稱樣品池、比色杯等）和光學元件以及氧氣能吸收小于 190nm 波長的光，因此常 規(guī)紫外測定集中在近紫外區(qū)

17、，即200nm400nm?？梢姽鈪^(qū)為400nm800nm。組成物質(zhì)的分子均處于一定能態(tài)并不停地運動著，分子的運動可分為平動、轉(zhuǎn)動、振動和分子內(nèi)電子的運動，每種運動狀態(tài)都處于一定的能級，因此分子的能量可以寫成：E= E0+E平+E轉(zhuǎn)+E振+E電E0是分子內(nèi)在的不隨分子運動而改變的能量，平動能E平只是溫度的函數(shù)，因此與光譜有關(guān)的能量變化是分子的轉(zhuǎn)動能量、振動能量和分子的電子能量。分子的每一種能量都有一系列的能級，能級不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子處于基態(tài)，當它吸收一定能量躍遷到激發(fā)態(tài)，則產(chǎn)生吸收光譜。分子轉(zhuǎn)動、振動和電子能級的躍遷，相應地產(chǎn)生轉(zhuǎn)動、振動及電子光譜。按照量子力學原理，分子

18、能態(tài)按一定的規(guī)律跳躍式地變化，物質(zhì)在入射光的照射下，分子吸收光時，其能量的增加是不連續(xù)的，物質(zhì)只能吸收一定能量的光，吸收光的頻率和兩個能級間的能量差要符合下列關(guān)系：E= E2- EU hE1、E2分別表示初能態(tài)和終能態(tài)的能量，初能態(tài)與終能態(tài)之間的能量差愈大，則所吸收的光的頻率愈高（即波長愈短），反之則所吸收的光的頻率愈低（即波長愈長）。由于吸收是不連續(xù)的，因此在光的一定部位出現(xiàn)一系列吸收暗帶。因為分子轉(zhuǎn)動、振動及電子能級躍遷的能量差別較大，因此，它們的吸收光譜出現(xiàn)在不同的光譜區(qū)域。分子轉(zhuǎn)動能級級差小， E為（T之（T 7 兀左（T-（T*紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子，尤其是共鈍雙鍵中的兀電子

19、和未共享的電子對的激發(fā)所產(chǎn)生的。所以各種物質(zhì)分子對紫外光的吸光性質(zhì)取決于該分 子的雙鍵數(shù)目和未共享電子對的共軛情況等。如下表所示：電子躍遷類型與紫外吸收波長（nm）關(guān)系表電子躍遷類型例子紫外吸收波長范圍（T-（T KH 100150 nm兀一兀三似鈍）C= O 104為強吸收；&= 103104為較強吸收； 102為 弱吸收，此時分光光度法不靈敏。因為通常使用分光光度計可檢測出的最小吸光度A= 0.001，所以，當b=1cm,= 105時，可檢測的溶液最小濃度是 C= 10-8 mol/L。常用的吸光系數(shù)還有一種百分吸光系數(shù)，即在某一波長下，溶液濃度為 1%（W / V）,液層厚度b= 1cm

20、時的吸光度，以E1% max表示。C 百分濃度（ W / V）。L液層厚度，吸收杯光徑長度。A吸光度。最大吸收波長 入maX寸的e和E1%750nm 紅外線光具有波粒二相性，波長不同，其能量不同。（二）物質(zhì)的吸收光譜及顏色：1 物質(zhì)的原子吸收光譜和原子發(fā)射光譜：原子的最外層電子可以選擇性吸收特征波長的電磁波成為激發(fā)態(tài)而產(chǎn)生的光譜稱為原子吸收光譜。激發(fā)態(tài)原子恢復到基態(tài)，則釋放出特征波長的光子，形成原子發(fā)射光譜。不同的溶液其光譜不同，即不同溶液對不同波長的光其吸收能力不同，對某一特定波長的光存在吸收峰。2可見光由赤橙黃綠青蘭紫等能量不同的光線組成，當可見光穿過某一溶液時，由于特定波長的光被吸收而使

21、溶液呈現(xiàn)相應的顏色。（如CuSO4由于吸收了可見光中的黃光（600nm）而成藍色）不同顏色的溶液對不同波長的光其吸收 能力不同。（三）光吸收的基本定律（ Lambert-Beer 定律）：一束平行單色光（Io）通過有色的透明溶液時，一部分的光可以透過溶液（It）,另一部分被溶液吸收（Ia）,還有一部分被器皿表面反射（Ir）,則：Io=It+Ia+Ir 。那么，該溶液透光率為 :T = It / Io。1 Lambert 定律：設有一束平行單色光,通過液層厚度為b 的均勻透明溶液,則溶液對光的吸收能力 :A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k2bk2 為吸光系數(shù)，為常數(shù)。與入射光波長、溶液性

22、質(zhì)、濃度和溫度有關(guān)； A 為吸光度（又稱光密度 O.D或消光度E）,當入射光波長、吸光溶液的濃度和 溫度一定時， A 與 b 成正比。2 Beer 定律：設有一束平行單色光,通過濃度為c 的均勻透明溶液,則溶液對光的吸收能力:A=Ig（Io/It）=Ig（1/T）=k4ck2 為常數(shù)。由 Beer 定律可知：當入射光波長、吸光溶液的厚度和溫度一定時， A 與 c 成正比。3 Lambert-Beer 定律：綜合1.2.得：A=Kbc ,即：當入射光波長、吸光溶液的性質(zhì)和溫度一定時， A 與 b、 c 成正比。（四）吸光光度法的基本原理：1 、不同物質(zhì)，由于其分子結(jié)構(gòu)和原子組成不同，故對光的吸收

23、光譜不同 （如：CuSO4 ,在測定不同顏色的物質(zhì)濃度時要用最大吸收的波長的入射光，這 樣測量的靈敏度最高。2、同一種物質(zhì)，若濃度不同，則對同一波長的入射光的吸收能力（吸光度）也不同，且成正比關(guān)系。3、應此，利用特定波長的單色光（通常用最大吸收波長的入射光）照射不同濃度的某一溶液時，所得的吸光度大小應與溶液濃度呈線性關(guān)系，故可利用該線性關(guān)系通過計算或查標準曲線來求得未知溶液的濃度。（五）吸光光度法特點：2 靈敏度高：mg%M、甚至 ug%M。3 準確度高：誤差 2-5%4 操作簡便、快速，儀器設備不復雜，價格低廉，故應用廣泛。*：分光光度計的使用：（一）分光光度計的基本原理：利用吸光光度法的原理，采用棱鏡或光柵等分光器獲得純度較高的單色光來測