分子遺傳學(xué) 章 基因操作技術(shù)及其應(yīng)用

1、會(huì)計(jì)學(xué)1分子遺傳學(xué)分子遺傳學(xué) 章章 基因操作技術(shù)及其應(yīng)用基因操作技術(shù)及其應(yīng)用一、重組一、重組DNA技術(shù)技術(shù) 二二 、PCR技術(shù)技術(shù) 三、基因文庫(kù)及分子雜三、基因文庫(kù)及分子雜交技術(shù)交技術(shù) 第1頁/共63頁l克(clone)-無性繁殖l分子克DNA的無性繁殖技術(shù)l重組DNA技術(shù)的重大突破帶動(dòng)了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起，并很快產(chǎn)生了許多生命科學(xué)的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)二、重組DNA技術(shù)是基因工程的核心技術(shù)一、重組一、重組DNA技術(shù)技術(shù) 重組重組DNA技術(shù)，又稱為基因克或分子技術(shù)，又稱為基因克或分子克技術(shù)。它是基因工程的核心技術(shù)?？思夹g(shù)。它是基因工程的核心技術(shù)。第2頁/共63頁應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)

2、（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克或重組DNA (recombinant DNA)。 DNADNA克定義克定義第3頁/共63頁（1）獲得目的基因；（2）與克載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；（4）對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。重組重組DNA操作一般步驟操作

3、一般步驟：第4頁/共63頁（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)，從中釣取目的基因。（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段，建立全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)或EST文庫(kù)；從文庫(kù)直接篩選所需基因。（3）根據(jù)同源克等原理克需要的目的基因片段。（4）直接化學(xué)合成。(一一)、獲得目的基因的方法：、獲得目的基因的方法：第5頁/共63頁(二二)、限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用則是、限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用則是DNA重組的關(guān)鍵重組的關(guān)鍵限制性內(nèi)切核酸酶(restrictive endonucle-ases)，又稱限制酶。是識(shí)別并特異性地切割雙鏈DNA序列的一種核酸內(nèi)切酶。（“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”）發(fā)現(xiàn)于原核

4、生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類工具酶。限制酶（限制酶（“基因剪刀基因剪刀”） 第6頁/共63頁根據(jù)其來源命名。如：根據(jù)其來源命名。如： 屬名屬名 菌株名菌株名 E co R I 種名種名 編號(hào)編號(hào)EcoRI來源于大腸桿菌來源于大腸桿菌E.coli的的RY13菌株菌株,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。命名命名第7頁/共63頁每種限制酶能識(shí)別和切割的通常48個(gè)核苷酸序列，稱為限制性位點(diǎn)（restriction sites）或切點(diǎn)。（回文結(jié)構(gòu)） 如：Hare III 5-GGCC- 3 3-CC

5、GG- 5 Bam HI 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 平末端(blunt end) 對(duì)稱軸切，連接效果差切割形式 粘性末端（sticky end）交錯(cuò)切切割形式切割形式 第8頁/共63頁l 不論不論DNA的來源如何，同一種限制酶切割的來源如何，同一種限制酶切割后產(chǎn)生的粘性末端容易重新連接。因此可后產(chǎn)生的粘性末端容易重新連接。因此可將不同種屬的將不同種屬的DNA重組。如人和質(zhì)粒重組。如人和質(zhì)粒DNA等。等。l 用于人類基因組的用于人類基因組的DNA分析，具特定的酶分析，具特定的酶切位點(diǎn)。切位點(diǎn)。l Gene突變改變酶切位點(diǎn)的消失或新產(chǎn)生將突變改變酶切位點(diǎn)的消失或新產(chǎn)生將改變酶切片

6、段長(zhǎng)度。應(yīng)用于限制性片段多改變酶切片段長(zhǎng)度。應(yīng)用于限制性片段多態(tài)性分析。態(tài)性分析。根據(jù)上述限制酶的特點(diǎn)，在基因根據(jù)上述限制酶的特點(diǎn)，在基因工程和基因診斷中的重要用途：工程和基因診斷中的重要用途：第9頁/共63頁 載體（載體（Vector）:將外源目的將外源目的DNA導(dǎo)入受體導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。（三）、基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體及其選擇（三）、基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體及其選擇常用載體：常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、 粘粒、大片段克載體（BAC，YAC等）。第10頁/共63頁克載體克載體(cloning vector)(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源

7、DNADNA序列被擴(kuò)增而特序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克載體。意設(shè)計(jì)的載體稱為克載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) (expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNADNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。體。第11頁/共63頁1、能自主復(fù)制；且插入外源DNA后，不影響其復(fù)制能力；2、具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；3、有克位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克位點(diǎn)；4、分子量小，以容納較大的外源DNA；5、具生物安全性。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)載體

8、的選擇標(biāo)準(zhǔn)第12頁/共63頁1. 1. 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)(plasmid)第13頁/共63頁2. 2. -噬菌體噬菌體( (phage) )置換載體 溶解途徑 載體和外源DNA整合到宿主菌DNA中?？煽?3kb的外源DNA。插入載體 裂解途徑 DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制，然后包裝成噬菌體，裂解宿主，釋放噬菌體。可克5kb的cDNA。 是一種可在體外包裝的細(xì)菌病毒,可高效感染大腸桿菌。-噬菌體DNA是線狀雙鏈DNA分子，全長(zhǎng)約50kb，每條鏈各帶12bp長(zhǎng)的單鏈互補(bǔ)末端-粘末端(COS序列)。進(jìn)入宿主細(xì)胞后不久，COS序列堿基配對(duì)環(huán)化。可包裝3752kb DNA分子。 改建后的噬菌體發(fā)展

9、了多種較大型的克載體，如：第14頁/共63頁3.3.柯斯質(zhì)粒柯斯質(zhì)粒(cosmid vector)： 粘粒粘粒 是將質(zhì)粒和噬菌體改建的一種載體.它含COS序列,插入一小plasmid 而得名Cosmid。改建后的粘粒含有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和cos末端，全長(zhǎng)8kb?？筛腥敬竽c桿菌。大片段外源DNA插入后，在體外包裝進(jìn)而被克?？砂b3050 kb長(zhǎng)的DNA片段，多用于基因文庫(kù)構(gòu)建。 第15頁/共63頁4. 4. 其他載體：大片段其他載體：大片段DNADNA克載體克載體 細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)(bacterial ar

10、tificial chromosome, BAC) 約約300kb300kb噬菌體噬菌體PIPI人工染色體人工染色體（PI artificial chromosome, PACPI artificial chromosome, PAC） 約約100kb 100kb 酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)(yeast artificial chromosome, YAC) 200kb 2000kb 200kb 2000kb動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒DNADNA改造的載體改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，

11、逆轉(zhuǎn)錄病毒）第16頁/共63頁（四）、外源（四）、外源DNA片斷和載體的連接片斷和載體的連接1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)(1)同一限制酶切位點(diǎn)同一限制酶切位點(diǎn)連接連接 (2)(2)不同限制酶切位點(diǎn)不同限制酶切位點(diǎn)連接連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連接第17頁/共63頁Bam H切割切割反應(yīng)反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割G

12、C C T A GGC C T A GGC C T A GGC C T A GG A T C CGG A T C CGG A T C CGG A T C CG重組體重組體GC C T A GGC C T A GG A T C CGG A T C CGGC C T A GGC C T A GG A T C CGG A T C CG載體自連載體自連目的基因自目的基因自連連同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接第18頁/共63頁不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接）的連接G AATTCCTTAAGAG ATCTTCTAG AEco R切割切割位點(diǎn)位點(diǎn)GCTTAAATCT

13、AGAATTCGGATCTABg l切割位切割位點(diǎn)點(diǎn)AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAA A T T CGAT C T A GEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末配伍末端的連接情況端的連接情況和同一限制酶和同一限制酶切位點(diǎn)連接相切位點(diǎn)連接相似。似。第19頁/共63頁2. 2. 平端連接平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端平端 粘端補(bǔ)齊或切平形成的平粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端端第20頁/共63頁目的基因目的基因載體載體限制性

14、內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連第21頁/共63頁3. 3. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal (terminal transferase)transferase)的作用下，在的作用下，在DNADNA片段片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。端，再進(jìn)行粘端連接。第22頁/共63頁5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶或機(jī)械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T

15、)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體第23頁/共63頁4. 4. 人工接頭人工接頭(linker)(linker)連接連接 由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 第24頁/共63頁人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAG

16、C5-3-Eco REco REco REco R第25頁/共63頁受體菌條件受體菌條件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) (competent) 導(dǎo)入方式導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)(transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 ( (transfectiontransfection) )感染感染 (infection)(infection)（五）重組（五）重組DNADNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌感受態(tài)細(xì)胞：感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞經(jīng)處理后處于最適攝取和容忍重組體的狀態(tài)。第26頁/共63頁轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（infection

17、infection）：是特殊形式的轉(zhuǎn)化，）：是特殊形式的轉(zhuǎn)化，是離體狀態(tài)的完整的病毒噬菌體是離體狀態(tài)的完整的病毒噬菌體DNA/RNADNA/RNA感感染受體菌而引起的后者遺傳型和表型發(fā)生染受體菌而引起的后者遺傳型和表型發(fā)生的變化。的變化。轉(zhuǎn)導(dǎo)（轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction ）：當(dāng)病毒從被感染）：當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。作用。轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformation）通過自動(dòng)獲取或）通過

18、自動(dòng)獲取或人為地供給外源人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用。第27頁/共63頁（五）重組體的篩選（五）重組體的篩選(1) (1) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(2) (2) 標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(marker rescue)(3) (3) 分子雜交法分子雜交法 原位雜交原位雜交 Southern blotSouthern blot第28頁/共63頁四四環(huán)環(huán)素素標(biāo)標(biāo)記記篩篩選選抗抗藥藥標(biāo)標(biāo)記記第29頁/共63頁藍(lán)藍(lán)白白斑斑篩篩選選標(biāo)志補(bǔ)救標(biāo)志補(bǔ)救第30頁/共63頁重組重組DNA

19、DNA技術(shù)操作過程總結(jié)：技術(shù)操作過程總結(jié)： 分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 第31頁/共63頁三、三、PCR技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain eaction,PCR ）1 9 9 3 ， K a r y B . MullisPCR是模擬體內(nèi)是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性聚合酶反應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一擴(kuò)增某一DNA片段的片段的技術(shù)。體外程序化的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。合成技術(shù)。第32頁/共

20、63頁1) 原理：原理：模擬體內(nèi)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一聚合酶反應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一DNA片段。片段。2) 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系：DNA模板，引物，模板，引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，聚合酶，buffer3) 反應(yīng)程序：反應(yīng)程序： 變性變性 ( 9495oC) 退火退火 延伸延伸 ( 3755 oC) ( 7072 oC ) 72 oC延伸延伸10min 30-35cycles DNA擴(kuò)增擴(kuò)增100萬倍萬倍第33頁/共63頁第34頁/共63頁P(yáng)CR特點(diǎn)及應(yīng)用特點(diǎn)及應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)：（優(yōu)點(diǎn)：（1）特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定可靠）特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定

21、可靠、快速；、快速； （2）微量的模板）微量的模板DNA即可擴(kuò)增大量產(chǎn)即可擴(kuò)增大量產(chǎn)物。物。應(yīng)用：（應(yīng)用：（1）基因組）基因組DNA分析；分析； （2）遺傳物質(zhì)的鑒定；）遺傳物質(zhì)的鑒定； （3）遺傳病的診斷。）遺傳病的診斷。缺點(diǎn)：（缺點(diǎn)：（1）需靶）需靶DNA序列的信息；序列的信息； （2）產(chǎn)物短小，）產(chǎn)物短小，DNA復(fù)制不精確。復(fù)制不精確。第35頁/共63頁四、基因文庫(kù)與分子雜交技術(shù)四、基因文庫(kù)與分子雜交技術(shù)（一）、（一）、基因文基因文庫(kù)庫(kù)基因組文基因組文庫(kù)庫(kù)cDNA文文庫(kù)庫(kù)（一）、（一）、基因文基因文庫(kù)庫(kù)Southern blot（二）、（二）、分子雜交分子雜交技術(shù)技術(shù)Northern b

22、lotWestern blot第36頁/共63頁基因組基因組DNADNA文庫(kù)（文庫(kù)（genomic DNA librarygenomic DNA library）將某一基因組將某一基因組DNADNA用適當(dāng)?shù)南拗泼赣眠m當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載（質(zhì)?；蚴删w）體切斷后，與載（質(zhì)?；蚴删w）體DNADNA重重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，存在于轉(zhuǎn)化組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克載體所攜帶的所有基因組細(xì)胞內(nèi)由克載體所攜帶的所有基因組DNADNA的集合稱為的集合稱為G G文庫(kù)文庫(kù)（一）、（一）、基因文基因文庫(kù)庫(kù)第37頁/共63頁組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片基因片斷斷克隆載克隆載體體

23、重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)含重組分子的轉(zhuǎn)化菌化菌限制性內(nèi)限制性內(nèi)切酶切酶受體受體菌菌基基因因組組文文庫(kù)庫(kù)構(gòu)構(gòu)建建流流程程圖圖第38頁/共63頁限制酶切位點(diǎn)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左左臂臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫(kù)基因文庫(kù)第39頁/共63頁cDN

24、AcDNA文庫(kù)文庫(kù)(cDNA library)(cDNA library) 以某種細(xì)胞的全部以某種細(xì)胞的全部mRNAmRNA為模板，利為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNAmRNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的DNADNA（cDNAcDNA）再?gòu)?fù)制成雙鏈）再?gòu)?fù)制成雙鏈cDNA,cDNA,與適當(dāng)?shù)妮d與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含全部表體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為達(dá)基因的種群，稱為C-C-文庫(kù)文庫(kù)(cDNA (cDNA library)library)。C-C-文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。第40頁/共63頁組織或細(xì)胞組織或細(xì)胞RNA提提取取反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄c

25、DNA(double strand)克隆載克隆載體體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)含重組分子的轉(zhuǎn)化菌化菌受體受體菌菌cDNA文文庫(kù)構(gòu)建庫(kù)構(gòu)建流程圖流程圖第41頁/共63頁cDNA library construction第42頁/共63頁（二）、（二）、分子雜交分子雜交技術(shù)技術(shù) 分子雜交（分子雜交（molecular hybridization）：標(biāo)標(biāo)記的探針記的探針DNA變性后與變性后的靶變性后與變性后的靶DNA/RNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，形成雜通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，形成雜種分子的過程。種分子的過程。 分子雜交包括：分子雜交包括： DNA-DNA雜交（雜交（Southern blot

26、）; DNA-RNA雜交（雜交（Northern blot）; 蛋白蛋白-蛋白雜交（蛋白雜交（Western blot）。）。 第43頁/共63頁1、基因探針（、基因探針（gene probe）基因探針（基因探針（probeprobe）：是指與一段目的基）：是指與一段目的基因或因或DNA/RNADNA/RNA片段特異雜交的核苷酸序列片段特異雜交的核苷酸序列。可以是整個(gè)基因，或是基因的一部分，?？梢允钦麄€(gè)基因，或是基因的一部分，是是DNADNA，也可以是，也可以是RNARNA。1）、探針標(biāo)記）、探針標(biāo)記 同位素：同位素：32P , 35S , 3H-dNTP等；等； 非同位素：地高辛非同位素：地

27、高辛-dNTP ，生物素，生物素-dNTP。2）探針制備方法）探針制備方法缺口平移法（缺口平移法（Nick translation）隨機(jī)引物法（隨機(jī)引物法（Random primer）末端標(biāo)記法（末端標(biāo)記法（Random primer）第44頁/共63頁Nick TranslationOHpOH+PPDNAdNTP ，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP Bio-dNTP第45頁/共63頁隨機(jī)引物標(biāo)記探針53553DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bp primerKlenow,dNTP變性變性-復(fù)姓復(fù)姓第46頁/共63頁DNA末端標(biāo)記第47頁/共63頁2、Southern bl

28、ot原原理理和和步步驟驟提取提取T 、Cell DNA 限制酶消化限制酶消化 DNA片段片段電泳分離電泳分離變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜變性、雜交變性、雜交洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析第48頁/共63頁Southern blot第49頁/共63頁Southern blot第50頁/共63頁2、Northern blot原原理理和和步步驟驟提取提取T 、Cell 總總RNA 提純分離提純分離mRNA凝膠電泳分離凝膠電泳分離RNA變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜雜雜交交洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析第51頁/共63頁第52頁/共63頁3、Weste

29、rn blot原原理理和和步步驟驟提取提取T 、Cell 蛋白蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜抗體雜抗體雜交交第53頁/共63頁Western blot第54頁/共63頁(二二)、限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用則是、限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用則是DNA重組的關(guān)鍵重組的關(guān)鍵限制性內(nèi)切核酸酶(restrictive endonucle-ases)，又稱限制酶。是識(shí)別并特異性地切割雙鏈DNA序列的一種核酸內(nèi)切酶。（“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”）發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類工具酶。限

30、制酶（限制酶（“基因剪刀基因剪刀”） 第55頁/共63頁Bam H切割切割反應(yīng)反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GC C T A GGC C T A GGC C T A GGC C T A GG A T C CGG A T C CGG A T C CGG A T C CG重組體重組體GC C T A GGC C T A GG A T C CGG A T C CGGC C

31、T A GGC C T A GG A T C CGG A T C CG載體自連載體自連目的基因自目的基因自連連同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接第56頁/共63頁人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R第57頁/共63頁轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（infectioninfection）：是特殊形式的轉(zhuǎn)化，）：是特殊形式的轉(zhuǎn)化，是離體狀態(tài)的完整的病毒噬菌體是離體狀態(tài)的完整的病毒噬菌體DNA/RNADNA/RNA感感染受體菌而引起的后者遺傳型和表型發(fā)生染受體菌而引起的后者遺傳型和表型發(fā)生的變化。的變化。轉(zhuǎn)導(dǎo)（轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction ）：當(dāng)病毒從被感染）：