分子生物學緒論b

1、會計學1分子生物學緒論分子生物學緒論b生物大分生物大分子子核核酸酸蛋白蛋白質質多多糖糖脂脂類類 它以核酸和蛋白它以核酸和蛋白質等生物大分子的結質等生物大分子的結構及其在遺傳信息和構及其在遺傳信息和細胞信息傳遞中的作細胞信息傳遞中的作用為研究對象。用為研究對象。第1頁/共44頁分子生物學分子生物學生物化學生物化學研究方研究方向向主要研究核酸、蛋白質和主要研究核酸、蛋白質和其它大分子的結構和功能，其它大分子的結構和功能，及它們之間的相互作用。及它們之間的相互作用。著重解決細胞中信息傳遞著重解決細胞中信息傳遞的問題。的問題。主要研究大、小分主要研究大、小分子在生命活動中的子在生命活動中的代謝轉化過程

2、，如代謝轉化過程，如糖酵解、脂肪氧化、糖酵解、脂肪氧化、三羧酸循環(huán)等。三羧酸循環(huán)等。研究方研究方法法以以X-射線等物理學方法研射線等物理學方法研究大分子結構，以生化與究大分子結構，以生化與遺傳相結合的方法探索其遺傳相結合的方法探索其功能。功能。采用生化和化學方采用生化和化學方法。法。重點是大重點是大分子的結分子的結構與功能構與功能重點是重點是分子的分子的代謝轉代謝轉化化第2頁/共44頁DNADNA一級結構一級結構DNADNA二級結構二級結構DNADNA三級結構三級結構第3頁/共44頁DNADNA的一級結構的一級結構實際上就是實際上就是DNADNA分子內堿基的排分子內堿基的排列順序。列順序。第4

3、頁/共44頁第5頁/共44頁第6頁/共44頁第7頁/共44頁第8頁/共44頁回文結構回文結構 palindrome第9頁/共44頁分分類類微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA（microsatelletite DNA）小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNA（minisatelletite DNA）重復頻率重復頻率重復序列重復序列長度長度具有種屬特具有種屬特異性，常作異性，常作為一種分子為一種分子遺傳標記。遺傳標記。第10頁/共44頁第11頁/共44頁又稱單又稱單序列序列第12頁/共44頁The Double Helix (1953) The foundation of molecular biology Francis H. Cr

4、ick James D. Watson 第13頁/共44頁（1）反向平行，右手雙）反向平行，右手雙螺旋；螺旋；（ 2 ） 糖 與 磷 酸 通 過） 糖 與 磷 酸 通 過3,5- 磷酸二酯鍵在外側磷酸二酯鍵在外側形成骨架；形成骨架；（3）堿基在內部，平面）堿基在內部，平面與螺旋軸垂直；與螺旋軸垂直；（4）A=T，G C；（5）直徑為）直徑為2nm，螺距，螺距為為3.4 nm，10bp/helix；（ 6 ） 大 溝 （） 大 溝 （ m a j o r groove）和小溝（）和小溝（minor groove）第14頁/共44頁氫鍵堿基堆積力靜電斥力疏水力有利于維持雙螺有利于維持雙螺旋結構旋結

5、構不利于維持雙螺不利于維持雙螺旋結構旋結構第15頁/共44頁除除B-DNA外，人們還發(fā)現到了其它的結構外，人們還發(fā)現到了其它的結構參數有一定差異的參數有一定差異的DNA，如，如A-DNA, Z-DNA，三鏈和四鏈，三鏈和四鏈DNA等，這一現象稱為等，這一現象稱為。分子間的三螺旋分子間的三螺旋DNADNA分子內的三螺旋分子內的三螺旋DNADNA平行的三螺旋結構平行的三螺旋結構 R-DNAR-DNAA-DNAA-DNA：周堿基數可變：周堿基數可變DNADNAZ-DNAZ-DNA：左旋：左旋DNADNADNA三螺旋結構中的第三螺旋結構中的第三條鏈與第一條鏈的序三條鏈與第一條鏈的序列和方向均相同，這種

6、列和方向均相同，這種的的DNA叫叫G四聯體螺旋：含有端粒重復四聯體螺旋：含有端粒重復序列的單鏈寡核苷酸可以形成四序列的單鏈寡核苷酸可以形成四聯體螺旋結構。聯體螺旋結構。第16頁/共44頁不同不同DNA結構形式相互轉變的現象結構形式相互轉變的現象，稱為，稱為。DNA基本結構：基本結構：B型型天然天然DNADNA分子中，分子中，以以B B型結構為主型結構為主在這個分子的某在這個分子的某些區(qū)段會出現些區(qū)段會出現A、Z型，甚至三鏈型，甚至三鏈、四鏈。、四鏈。這些不同的結構處于動態(tài)變化中這些不同的結構處于動態(tài)變化中第17頁/共44頁雙鏈雙鏈DNADNA中配對堿基的氫鍵不斷處中配對堿基的氫鍵不斷處于斷裂和

7、再生狀態(tài)之中，特別是穩(wěn)于斷裂和再生狀態(tài)之中，特別是穩(wěn)定性較低的富含定性較低的富含A-TA-T的區(qū)段，氫鍵的區(qū)段，氫鍵的斷裂和再生更為明顯。在微觀上的斷裂和再生更為明顯。在微觀上，它們常常發(fā)生瞬間的單鏈泡狀結，它們常常發(fā)生瞬間的單鏈泡狀結構，這種現象稱為雙螺旋的呼吸作構，這種現象稱為雙螺旋的呼吸作用。用。對于一些識別雙鏈對于一些識別雙鏈DNADNA開鏈成單鏈開鏈成單鏈的蛋白質結合到的蛋白質結合到DNADNA上具有重要作上具有重要作用。這些蛋白質需要處于呼吸狀態(tài)的用。這些蛋白質需要處于呼吸狀態(tài)的雙鏈雙鏈DNADNA來閱讀和識別來閱讀和識別DNADNA內部所內部所含信息（如堿基序列、堿基上可以作含信

8、息（如堿基序列、堿基上可以作用的氫供體、氫受體的數目和方位等用的氫供體、氫受體的數目和方位等）。）。第18頁/共44頁是指是指DNA雙螺旋進一雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的構象，包括線形雙步扭曲盤繞所形成的構象，包括線形雙鏈中的紐結、超螺旋、多重螺旋、分子鏈中的紐結、超螺旋、多重螺旋、分子內局部單鏈環(huán)和環(huán)狀內局部單鏈環(huán)和環(huán)狀DNA中的超螺旋及中的超螺旋及連環(huán)等拓撲學性質。連環(huán)等拓撲學性質。1、超螺旋、超螺旋DNA形狀更緊密，在形狀更緊密，在DNA 組裝中組裝中有重要作用；有重要作用；2、超螺旋程度的改變介導了、超螺旋程度的改變介導了DNA結構的變結構的變化，有利于功能的發(fā)揮；化，有利于功能的發(fā)揮

9、；3、超螺旋、超螺旋DNA能實現松弛態(tài)能實現松弛態(tài)DNA所不能實所不能實現的結構轉化。現的結構轉化。第19頁/共44頁在物理和化學因素的影響下，維在物理和化學因素的影響下，維系核酸二級結構的氫鍵和堿基堆系核酸二級結構的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，積力受到破壞，DNA雙鏈解旋雙鏈解旋成單鏈，這一過程稱為成單鏈，這一過程稱為DNA的的變性。變性。第20頁/共44頁1、核酸的變性可發(fā)生在整個、核酸的變性可發(fā)生在整個DNA分子中，分子中，也可發(fā)生在局部的雙螺旋節(jié)段上（局部變也可發(fā)生在局部的雙螺旋節(jié)段上（局部變性）。性）。2、DNA變性不涉及核苷酸中二酯鍵的斷裂變性不涉及核苷酸中二酯鍵的斷裂。3、引起變性

10、的因素有酸、堿、尿素、胍等、引起變性的因素有酸、堿、尿素、胍等變性劑和乙醇、丙酮等化學因素以及熱、變性劑和乙醇、丙酮等化學因素以及熱、紫外線等物理因素。紫外線等物理因素。4、變性后的、變性后的DNA其一系列的物理、化學性其一系列的物理、化學性質都發(fā)生變化，如質都發(fā)生變化，如260nm處紫外吸收值降處紫外吸收值降低，粘度下降，沉降速度增加，浮力密度低，粘度下降，沉降速度增加，浮力密度上升等。上升等。5、熔解曲線的中點，即一半的、熔解曲線的中點，即一半的DNA雙螺旋雙螺旋解為單鏈所對應的溫度稱為熔解溫度或解解為單鏈所對應的溫度稱為熔解溫度或解鏈溫度。鏈溫度。6、每一種、每一種DNA都有一個解鏈溫度

11、，都有一個解鏈溫度，Tm值值是一個固定常數。是一個固定常數。第21頁/共44頁第22頁/共44頁第23頁/共44頁分子碰分子碰撞撞時間長時間長核心作核心作用用時間短時間短拉拉鏈拉拉鏈作用作用限制因限制因素素第24頁/共44頁 不完全變性不完全變性DNA容易迅速復容易迅速復性；性；復性復性DNA分子不一定是原有分子不一定是原有互補鏈，大部分不是原配，而互補鏈，大部分不是原配，而是形成雜交分子；是形成雜交分子；復性復性DNA分子的結構和理化分子的結構和理化性質等均得到恢復。性質等均得到恢復。第25頁/共44頁、DNA片段小的比大的容易復性。片段小的比大的容易復性。、鹽可以減少兩條互補鏈負電荷的排鹽

12、可以減少兩條互補鏈負電荷的排斥作用，通常增加鹽濃度，可加速兩條斥作用，通常增加鹽濃度，可加速兩條互補鏈重新結合的速度?；パa鏈重新結合的速度。、DNA濃度越大，兩條互補鏈彼此相濃度越大，兩條互補鏈彼此相遇的可能性越大，復性速度也越快。遇的可能性越大，復性速度也越快。第26頁/共44頁 一定的鹽一定的鹽濃度濃度 適宜的溫適宜的溫度度復性是分子雜交的理論基礎復性是分子雜交的理論基礎第27頁/共44頁 親緣關系很近的親緣關系很近的不同來源的不同來源的DNADNA單鏈或單鏈或RNARNA單鏈單鏈與與DNADNA單鏈之間單鏈之間通過堿基互補形通過堿基互補形成雜交分子的過成雜交分子的過程程, ,叫做核酸分叫

13、做核酸分子雜交。子雜交。DNA/DNADNA/RNA第28頁/共44頁根據核酸分子雜交的原理，有目的地人工根據核酸分子雜交的原理，有目的地人工制備或從基因組中分離一段已知序列的制備或從基因組中分離一段已知序列的DNA，使其帶上標記，經變性后成為單，使其帶上標記，經變性后成為單鏈，在一定條件下與待測鏈，在一定條件下與待測DNA單鏈雜交單鏈雜交，如兩者序列有同源性，就形成帶有標記，如兩者序列有同源性，就形成帶有標記的雙鏈的雙鏈DNA分子，即檢測到了待測的分子，即檢測到了待測的DNA。這段帶有標記的核苷酸序列稱為。這段帶有標記的核苷酸序列稱為核酸探針或基因探針（核酸探針或基因探針（Gene prob

14、e）。）。第29頁/共44頁第30頁/共44頁DNADNA序列分析技術是揭開生命奧秘的一把金鑰匙序列分析技術是揭開生命奧秘的一把金鑰匙吳瑞士吳瑞士 引物引物- -延伸測序策略延伸測序策略19711971年首次成功地年首次成功地測定了測定了噬菌體兩噬菌體兩個粘性末端的完整個粘性末端的完整序列。序列。F.SangerF.Sanger末端終止法末端終止法K.MullisK.MullisPCRPCRM.SmithM.Smith堿基定點突變技術堿基定點突變技術第31頁/共44頁利用脫氧核苷三磷酸（利用脫氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）的類似）的類似物雙脫氧核苷三磷酸（物雙脫氧核苷三磷酸（ddNTPddN

15、TP）取代）取代正常的底物。正常的底物。第32頁/共44頁 在在DNA合成反應中除了加入合成反應中除了加入4種正常種正常dNTP外，再加入外，再加入1種少量的種少量的ddNTP，反，反應產物是一系列長短不一的核苷酸鏈。在應產物是一系列長短不一的核苷酸鏈。在4組獨立的核苷酸反應中，分別加入組獨立的核苷酸反應中，分別加入4種種不同的不同的ddNTP，結果生成，結果生成4組核苷酸鏈，組核苷酸鏈，它們分別終止于每一個它們分別終止于每一個A、T、C、G的位的位置上。對這置上。對這4組核苷酸進行聚丙烯酰胺凝組核苷酸進行聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈DNA ，可

16、讀出序列。，可讀出序列。 ddNTP可以在可以在DNA聚合酶作用聚合酶作用下和多核苷酸鏈的下和多核苷酸鏈的3羥基形成磷酸羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能再與下一個核苷二酯鍵，但卻不能再與下一個核苷酸縮合，結果使得多核苷酸鏈的延酸縮合，結果使得多核苷酸鏈的延伸終止伸終止。ddNTP的的作用作用方法過方法過程程第33頁/共44頁聚丙烯酰胺凝膠電泳第34頁/共44頁 DNA DNA聚合酶聚合酶 單鏈單鏈DNADNA模板模板 單鏈寡核苷酸引物單鏈寡核苷酸引物 MgMg2+2+ 4 4種種dNTP (dATP,dGTP,dCTPdNTP (dATP,dGTP,dCTP和和dTTP)dTTP) 4 4種種ddNTP ddNTP (ddATP,ddGTP,ddCTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和和ddTTP)ddTTP)第35頁/共44頁第36頁/共44頁實現了凝膠電泳、初始數據獲取、堿基閱讀實現了凝膠電泳、初始數據獲取、堿基閱讀等步驟自動化。等步驟自動化。DNADNA自動測序儀自動測序儀第37頁/共44頁第38頁/共44頁第39頁/共44頁又稱單又稱單序列序列第40頁/共44頁是指是指DNA雙螺旋進一雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的構象，包括線形雙步扭曲盤繞所形成的構象，包括線形雙鏈中的紐結、超螺旋、多重螺旋、分子鏈中的紐結、超螺旋、多重螺旋、分子內局部單鏈環(huán)和環(huán)狀內局部