第十二章：基因工程所需要的條件

1、第十二章第十二章 基因工程所需要的條件基因工程所需要的條件第一節(jié)、基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)、基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ) 限制性核酸內(nèi)切酶（限制性核酸內(nèi)切酶（restriction restriction endonucleaseendonuclease）這類酶又簡(jiǎn)稱為限制性內(nèi)切酶或限制這類酶又簡(jiǎn)稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶酶 。是一類能夠識(shí)別雙鏈。是一類能夠識(shí)別雙鏈DNADNA分子中的分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割某種特定核苷酸序列，并由此切割DNADNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。寄主控制的限制（寄主控制的限制（restrictionrestriction） 與修飾（與修飾（

2、modificationmodification）現(xiàn)象）現(xiàn)象簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱R/MR/M體系。細(xì)菌的體系。細(xì)菌的R/MR/M體系同免疫體系同免疫體系類似，它能夠辨別自己的體系類似，它能夠辨別自己的DNADNA和和外來(lái)的外來(lái)的DNADNA，并使后者降解掉。，并使后者降解掉。無(wú)論是限制還是修飾，都是由寄主控?zé)o論是限制還是修飾，都是由寄主控制的。制的。 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象由兩寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象由兩種酶活性配合完成的種酶活性配合完成的修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶核酸內(nèi)切限制酶。核酸內(nèi)切限制酶。 寄主控制的限制與修飾的作用寄主控制的限制與修飾的作用l保護(hù)自身的保護(hù)自身的DNADNA不受限制；不受

3、限制；l破壞外源破壞外源DNADNA使之迅速降解。使之迅速降解。根據(jù)限制根據(jù)限制- -修飾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)修飾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切限制酶，現(xiàn)在已成為重組切限制酶，現(xiàn)在已成為重組DNADNA技技術(shù)學(xué)的重要工具酶。術(shù)學(xué)的重要工具酶。 限制性核酸內(nèi)切酶的類型限制性核酸內(nèi)切酶的類型型酶的基本特性型酶的基本特性l 在在DNADNA雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割割DNADNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。l 兩個(gè)單鏈斷裂部位在兩個(gè)單鏈斷裂部位在DNADNA分子上的分布，分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的。通常不是彼此直接相對(duì)的。l 因此，斷裂的結(jié)果形成的因此，斷裂的結(jié)

4、果形成的DNADNA片斷，也片斷，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。絕大多數(shù)的絕大多數(shù)的型核酸內(nèi)切限制酶能夠識(shí)別的型核酸內(nèi)切限制酶能夠識(shí)別的由由4 48 8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。稱為核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別序列。而限制酶稱為核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別序列。而限制酶就是從其識(shí)別序列內(nèi)切割就是從其識(shí)別序列內(nèi)切割DNADNA分子的，因此識(shí)分子的，因此識(shí)別序列又稱為核酸內(nèi)切限制酶的切割位點(diǎn)或別序列又稱為核酸內(nèi)切限制酶的切割位點(diǎn)或靶子序列。靶子序列。識(shí)別序列的共同特點(diǎn)：它們具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)識(shí)別序列的共同特點(diǎn)：它們具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)形式，即這些核苷

5、酸對(duì)的順序是呈稱的結(jié)構(gòu)形式，即這些核苷酸對(duì)的順序是呈回文結(jié)構(gòu)?；匚慕Y(jié)構(gòu)。 由核酸內(nèi)切限制酶的作用所造成的由核酸內(nèi)切限制酶的作用所造成的DNADNA分分子的斷裂類型：子的斷裂類型：l 兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列，又是對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列，這種形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性這種形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的末端的DNADNA片段；片段；l 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心，這樣形式的斷裂是形成具有構(gòu)的中心，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的平末端的DNADNA片段。片段。 同裂酶（同裂酶（

6、isoschizomersisoschizomers） 指來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列的核指來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同，可用來(lái)研究位點(diǎn)的敏感性不同，可用來(lái)研究DNADNA甲基甲基化作用?；饔谩?限制酶限制酶HpaHpa和和MspMsp是一對(duì)同裂酶是一對(duì)同裂酶 (CCGG) (CCGG) ，當(dāng)靶序列中一個(gè)是，當(dāng)靶序列中一個(gè)是5-5-甲基胞嘧甲基胞嘧啶時(shí)啶時(shí)HpaHpa不能進(jìn)行切割，而不能進(jìn)行切割，而MspMsp可以?？梢浴?同尾酶（同尾酶（iso

7、caudamerisocaudamer） 來(lái)源各異，識(shí)別的靶子序列也各不相同，來(lái)源各異，識(shí)別的靶子序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端。但都產(chǎn)生出相同的粘性末端。 由同尾酶所產(chǎn)生的由同尾酶所產(chǎn)生的DNADNA片段，是能夠通片段，是能夠通過(guò)其粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連過(guò)其粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來(lái)的。由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘接起來(lái)的。由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，特稱之為性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，特稱之為“雜種位點(diǎn)雜種位點(diǎn)”（hybrid sitehybrid site），一般不），一般不能被原來(lái)的任何一種同尾酶識(shí)別。能被原來(lái)的任何一種同尾酶識(shí)別。限制片段末

8、端的連接作用限制片段末端的連接作用由限制酶產(chǎn)生的具粘性末端的由限制酶產(chǎn)生的具粘性末端的DNADNA片段間的連接作用有兩種不同的片段間的連接作用有兩種不同的類型：類型： 分子間的連接：不同的DNA片段通過(guò)互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來(lái)。 分子內(nèi)的連接：由同一片段的個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子。 核酸內(nèi)切限制酶的命名法核酸內(nèi)切限制酶的命名法 第一個(gè)字母：大寫，表示所來(lái)自的微生物的屬名的第一個(gè)字母：大寫，表示所來(lái)自的微生物的屬名的第一個(gè)字母。第一個(gè)字母。 第二、三字母：小寫，表示所來(lái)自的微生物種名的第二、三字母：小寫，表示所來(lái)自的微生物種名的第一、二個(gè)字母。第一、二個(gè)字母。

9、其它字母：大寫或小寫，表示所來(lái)自的微生物的菌其它字母：大寫或小寫，表示所來(lái)自的微生物的菌株號(hào)。株號(hào)。 羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。 例：例：EcoR: EcoR: 來(lái)自于來(lái)自于E Escheria scheria cocolili R RY13Y13的第一個(gè)的第一個(gè)限制酶。限制酶。影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：lDNADNA的純度：的純度： 例如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙例如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（二胺四乙酸（EDTAEDTA）、）、SDSSDS（十二烷（十二烷基硫酸鈉）、以及高濃度的鹽離子基硫酸鈉）、以及

10、高濃度的鹽離子等，都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶等，都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶的活性。的活性。增加核酸內(nèi)切限制酶的用量，平增加核酸內(nèi)切限制酶的用量，平均每微克底物均每微克底物DNADNA可高達(dá)可高達(dá)1010單位單位甚至更多些。甚至更多些。擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，以使?jié)摂U(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)地稀釋。在的抑制因素被相應(yīng)地稀釋。延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。 一般采用如下三種方法：一般采用如下三種方法：核酸內(nèi)切限制酶不能夠切割甲基化的核苷核酸內(nèi)切限制酶不能夠切割甲基化的核苷酸序列，在基因克隆中是使用失去了甲基酸序列，在基因克隆中是使用失去了甲基化酶的大腸桿菌菌

11、株制備質(zhì)?；傅拇竽c桿菌菌株制備質(zhì)粒DNADNA，其目，其目的是為了避免被核酸內(nèi)切限制酶局部消化，的是為了避免被核酸內(nèi)切限制酶局部消化，甚至完全不被消化。甚至完全不被消化。lDNADNA的甲基化程度的甲基化程度大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是都是3737，但也有例外，如：，但也有例外，如：SmaSma是是2525、MaeMae是是4545。消化反應(yīng)的溫度低。消化反應(yīng)的溫度低于或高于最適溫度，都會(huì)影響核酸內(nèi)切于或高于最適溫度，都會(huì)影響核酸內(nèi)切限制酶的活性，甚至最終導(dǎo)致完全失活。限制酶的活性，甚至最終導(dǎo)致完全失活。l酶切消化反應(yīng)的溫度酶切消化反應(yīng)的溫度DNA

12、DNA分子的不同構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切限制酶的分子的不同構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切限制酶的活性也有很大的影響。某些核酸內(nèi)切限制活性也有很大的影響。某些核酸內(nèi)切限制酶切割超盤旋的質(zhì)粒酶切割超盤旋的質(zhì)粒DNADNA或病毒或病毒DNADNA所需要所需要的酶量，要比消化線性的酶量，要比消化線性DNADNA的高出許多倍，的高出許多倍，最高的可達(dá)最高的可達(dá)2020倍。倍。lDNADNA的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)此外，還有一些核酸內(nèi)切限制酶，切割它們此外，還有一些核酸內(nèi)切限制酶，切割它們自己的處于不同部位的限制位點(diǎn)，其效率亦自己的處于不同部位的限制位點(diǎn)，其效率亦有明顯的差別。有明顯的差別。核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的核酸內(nèi)切限制酶的

13、標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組份包括氯化鎂、氯化鈉或氯化組份包括氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、鉀、Tris-HClTris-HCl、-巰基乙醇或巰基乙醇或二硫蘇糖醇（二硫蘇糖醇（DTTDTT）以及牛血清）以及牛血清白蛋白（白蛋白（BSABSA）等。）等。l核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液 DNADNA連接酶（連接酶（ligaseligase）在一條在一條DNADNA鏈的鏈的3-3-末端具有一個(gè)末端具有一個(gè)游離的羥基（游離的羥基（-OH-OH），和在另一條），和在另一條DNADNA鏈的鏈的5-5-末端具有一個(gè)磷酸基末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（團(tuán)（-P-P）的情況下，能夠催化在）的情況下，能夠催化在2 2條條DN

14、ADNA鏈之間形成的磷酸二酯鍵。鏈之間形成的磷酸二酯鍵。l由大腸桿菌染色體編碼的叫做由大腸桿菌染色體編碼的叫做DNADNA連連接酶，用接酶，用NAD+NAD+作能源輔助因子作能源輔助因子 ；l由大腸桿菌由大腸桿菌T4T4噬菌體噬菌體DNADNA編碼的叫做編碼的叫做T4DNAT4DNA連接酶，用連接酶，用ATPATP作能源輔助因作能源輔助因子。子。 用于共價(jià)連接用于共價(jià)連接DNADNA限制片段的連接酶限制片段的連接酶有兩種不同的來(lái)源：有兩種不同的來(lái)源：粘性末端粘性末端DNADNA片段的連接片段的連接 DNADNA連接酶最突出的特點(diǎn)是，它能連接酶最突出的特點(diǎn)是，它能夠催化外源夠催化外源DNADNA

15、和載體分子之間發(fā)和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組的生連接作用，形成重組的DNADNA分子。分子。 平末端平末端DNADNA片段的連接片段的連接 l 同聚物加尾法（同聚物加尾法（homopolymertail-joininghomopolymertail-joining） 利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移核苷酸的利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能。在特殊功能。在DNADNA分子的分子的3-OH3-OH末端加上由末端加上由脫氧核苷酸組成的脫氧核苷酸組成的DNADNA單鏈延伸。這樣的延單鏈延伸。這樣的延伸片段，稱之為伸片段，稱之為polypoly（dA/TdA/T）尾巴）尾巴。因此任因此任

16、何兩條何兩條DNADNA分子，只要分別獲得分子，只要分別獲得polypoly（dAdA）和和polypoly（dTdT）尾巴，就會(huì)彼此連接起來(lái)。）尾巴，就會(huì)彼此連接起來(lái)。l銜接物連接法銜接物連接法 所謂銜接物（所謂銜接物（linkerlinker），是指用化），是指用化學(xué)方法合成的一段由學(xué)方法合成的一段由10101212個(gè)核苷個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。片段。lDNADNA接頭連接法接頭連接法DNADNA接頭，是一類人工合成的一頭具某接頭，是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端，另一頭為平

17、末端的種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當(dāng)它的平特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源末端與平末端的外源DNADNA片段連接之后，片段連接之后，便會(huì)使后者成為具粘性末端的新的便會(huì)使后者成為具粘性末端的新的DNADNA分子，而易于連接重組。分子，而易于連接重組。 DNADNA聚合酶聚合酶能夠把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到雙能夠把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到雙鏈鏈DNADNA分子引物鏈的分子引物鏈的3-OH3-OH末端，催化末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。模板上解離的情況。 基因工程常用的基因工程常用的DN

18、ADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶與核酸雜交探針的制備與核酸雜交探針的制備DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶-DNA-DNA的復(fù)制有關(guān)的復(fù)制有關(guān)參與參與DNADNA的修復(fù)過(guò)程的修復(fù)過(guò)程 DNADNA聚合酶聚合酶的三種不同的酶催活性：的三種不同的酶催活性：5 35 3的聚合酶活性的聚合酶活性5353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性3535的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 只有在具備了下述三種條件的情況下，只有在具備了下述三種條件的情況下，DNADNA聚合酶聚合酶才能夠催化合成才能夠催化合成DNADNA的互補(bǔ)鏈：的互補(bǔ)鏈：l全部四種脫氧核苷全部四種脫

19、氧核苷5-5-三磷酸三磷酸dNTPsdNTPs和和Mg2+Mg2+離子。離子。l帶有帶有3-OH3-OH游離基團(tuán)的引物鏈。游離基團(tuán)的引物鏈。lDNADNA模板，它可以是單鏈的，也可以是雙模板，它可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。鏈的。DNADNA聚合酶聚合酶在分子克隆中的主要用途是，在分子克隆中的主要用途是，通過(guò)通過(guò)DNADNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的用的帶放射性標(biāo)記的DNADNA探針。探針。在在DNADNA分子的單鏈缺口上，分子的單鏈缺口上，DNADNA聚合酶聚合酶的的5353核酸外切酶活性和聚合作用可以核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。同時(shí)

20、發(fā)生。 DNADNA缺口轉(zhuǎn)移缺口轉(zhuǎn)移應(yīng)用缺口轉(zhuǎn)移法制備應(yīng)用缺口轉(zhuǎn)移法制備DNADNA雜交探針雜交探針KlenowKlenow片段與片段與DNADNA末端標(biāo)記末端標(biāo)記 由大腸桿菌由大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶全酶，經(jīng)枯草桿全酶，經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理之后，產(chǎn)生出來(lái)的分子量菌蛋白酶處理之后，產(chǎn)生出來(lái)的分子量為為7676103D103D的大片段分子。的大片段分子。KlenowKlenow聚合聚合酶仍具有酶仍具有5353的聚合活性和的聚合活性和3535核酸外切酶活性，但失去了全酶的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5353的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。l修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNAD

21、NA所形成的所形成的33隱隱蔽末端；蔽末端；l標(biāo)記標(biāo)記DNADNA片段的末端；片段的末端；lcDNAcDNA克隆中的第二鏈克隆中的第二鏈cDNAcDNA的合成；的合成；lDNADNA序列測(cè)定。序列測(cè)定。KlenowKlenow聚合酶的主要用途有聚合酶的主要用途有T4 DNAT4 DNA聚合酶是由噬菌體基因聚合酶是由噬菌體基因4343編編碼的，具有兩種酶催活性，即碼的，具有兩種酶催活性，即5353的聚合酶活性和的聚合酶活性和3535的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。T4DNAT4DNA聚合酶也聚合酶也可以用來(lái)標(biāo)記可以用來(lái)標(biāo)記DNADNA平末端或隱蔽的平末端或隱蔽的3-3-末端。末端。T4DNA

22、T4DNA聚合酶和取代合成法標(biāo)記聚合酶和取代合成法標(biāo)記DNADNA片段片段T7 DNA T7 DNA 聚合酶聚合酶從從T7T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的，由兩個(gè)亞基組成：出來(lái)的，由兩個(gè)亞基組成：lT7T7基因基因5 5蛋白編碼的大亞基，有蛋白編碼的大亞基，有5353聚合酶和聚合酶和3535外切酶活外切酶活性。性。l大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白，大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白，增加大亞基對(duì)模板的親和性。增加大亞基對(duì)模板的親和性。T7 DNAT7 DNA聚合酶的特點(diǎn)聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力強(qiáng)，一旦與模板結(jié)合就持續(xù)合成能力強(qiáng)，一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互

23、補(bǔ)鏈。會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。3535外切酶活性高，單鏈和雙鏈外切酶活性高，單鏈和雙鏈都能降解。都能降解。不受不受DNADNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。其它二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。其它DNADNA聚聚合酶受合酶受DNADNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙。二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙。進(jìn)行末端標(biāo)記。取代合成法標(biāo)記進(jìn)行末端標(biāo)記。取代合成法標(biāo)記33末末端，這與端，這與T4 DNAT4 DNA聚合酶相同。聚合酶相同。補(bǔ)平隱蔽末端。合成補(bǔ)平補(bǔ)平隱蔽末端。合成補(bǔ)平33隱蔽末端；隱蔽末端；水解修平水解修平33突出末端。突出末端。 修飾后的修飾后的T7 DNAT7 DNA聚合酶聚合酶去除了其去除了其3535外切酶活性，使外切酶活性，使DNADNA聚合能力和

24、聚合速率提高了聚合能力和聚合速率提高了3 3倍。修飾倍。修飾后的后的T7 DNAT7 DNA聚合酶的用途：聚合酶的用途：l雙脫氧法雙脫氧法DNADNA測(cè)序；測(cè)序；l標(biāo)記標(biāo)記DNA 3DNA 3隱蔽末端；隱蔽末端；l更有效地補(bǔ)平末端。更有效地補(bǔ)平末端。依賴于依賴于RNARNA的的DNADNA聚合酶與互補(bǔ)聚合酶與互補(bǔ)DNADNA的合成的合成也稱也稱RNARNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNADNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptasereverse transcriptase）。由）。由和和兩條多肽鏈組成，其中兩條多肽鏈組成，其中鏈具有反轉(zhuǎn)錄酶鏈具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和活性和RN

25、aseHRNaseH活性，活性， 肽鏈具有以肽鏈具有以RNA-RNA-DNADNA雜交分子為底物的雜交分子為底物的5533脫氧核酸脫氧核酸外切酶活性。外切酶活性。555333RNADNA4dNTPs35反轉(zhuǎn)錄酶的53方向DNA聚合酶活性555333DNARNADNA+5rNMPs反轉(zhuǎn)錄酶的53方向和35方向的核糖核酸外切酶活性（RNaseH） DNADNA及及RNARNA的修飾酶的修飾酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶（簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferaseterminal transferase），），由大小亞基組成，在二甲胂酸緩沖液中，能夠由大小亞基

26、組成，在二甲胂酸緩沖液中，能夠催化催化55脫氧核苷三磷酸進(jìn)行脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5353方向的方向的聚合作用，逐個(gè)將脫氧核苷酸分子加到線性聚合作用，逐個(gè)將脫氧核苷酸分子加到線性DNADNA分子的分子的3-OH3-OH末端，且不需要模板。該酶末端，且不需要模板。該酶為非特異性酶，為非特異性酶，4 4種種dNTPsdNTPs都可以作為它的前體都可以作為它的前體物。物。5533單鏈單鏈DNADNAdNTPs(dN)nl具有具有3-OH3-OH末端的單鏈末端的單鏈DNADNA；l具有具有3-OH3-OH突出末端的雙鏈突出末端的雙鏈DNADNA。l平末端不是其有效底物，但如果平末端不是其有效底物，但如果用

27、用CoCo2+2+代替代替MgMg2+2+作為輔助因子，作為輔助因子，也可以成為其有效底物。也可以成為其有效底物。 受體受體DNADNA的特性：的特性：l給外源給外源DNADNA片段及載體分子加上互補(bǔ)片段及載體分子加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們可以重組的同聚物尾巴，以使它們可以重組起來(lái)。起來(lái)。 末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途：末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途：l催化催化 -3232P-3-P-3-脫氧核苷酸標(biāo)記脫氧核苷酸標(biāo)記DNADNA片段的片段的3-3-末端：在末端：在DNADNA序列分析中，序列分析中，使用使用 -3232P-3-P-3-脫氧核苷三磷酸脫氧核苷三磷酸（不具有游離的（不具有游離的3-OH3-OH）

28、，可終止單），可終止單核苷酸的參入作用。核苷酸的參入作用。l催化非放射性的標(biāo)記物（通常為生物催化非放射性的標(biāo)記物（通常為生物素標(biāo)記的核苷酸衍生物）參入到素標(biāo)記的核苷酸衍生物）參入到DNADNA片片段的段的3-3-末端：當(dāng)這些核苷酸參入后，末端：當(dāng)這些核苷酸參入后，可分別作為非放射性標(biāo)記物熒光染料可分別作為非放射性標(biāo)記物熒光染料及抗生素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。及抗生素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。l按照模板合成多聚脫氧核苷酸的同聚按照模板合成多聚脫氧核苷酸的同聚物。物。T4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 （T4 polynucleotide kinaseT4 polynucleotide kinase）催化

29、催化- -磷酸從磷酸從ATPATP分子轉(zhuǎn)移給分子轉(zhuǎn)移給DNADNA或或RNARNA分子的分子的5-OH5-OH末端，其作用不受末端，其作用不受底物分子鏈的長(zhǎng)短大小限制。底物分子鏈的長(zhǎng)短大小限制。天然產(chǎn)生的核酸不具有天然產(chǎn)生的核酸不具有5-OH5-OH末端，因末端，因此只能先用堿性磷酸酶處理，使其發(fā)生此只能先用堿性磷酸酶處理，使其發(fā)生脫磷酸作用而暴露出脫磷酸作用而暴露出5-OH5-OH基團(tuán)后，才基團(tuán)后，才能同多核苷酸激酶從能同多核苷酸激酶從- -3232P-ATPP-ATP分子中分子中轉(zhuǎn)移來(lái)的轉(zhuǎn)移來(lái)的- -3232P P基團(tuán)鍵合，實(shí)現(xiàn)末端標(biāo)基團(tuán)鍵合，實(shí)現(xiàn)末端標(biāo)記。記。 正向反應(yīng)（正向反應(yīng)（for

30、ward reactionforward reaction）當(dāng) 反 應(yīng) 混 合 物 中 存 在 過(guò) 量當(dāng) 反 應(yīng) 混 合 物 中 存 在 過(guò) 量 - -3232PATPPATP和和ADPADP時(shí)，多核苷酸激酶能夠時(shí)，多核苷酸激酶能夠催化催化-3232PATPPATP中中-3232P P的同的同DNADNA分分子的末端發(fā)生交換。標(biāo)記效率沒(méi)有正子的末端發(fā)生交換。標(biāo)記效率沒(méi)有正向反應(yīng)有效，很少使用。向反應(yīng)有效，很少使用。 交換反應(yīng)標(biāo)記法交換反應(yīng)標(biāo)記法5 PP 5OH 33 HO 3232P PATP+ADPss或dsDNA或RNA5突出末端突出末端5隱蔽末端隱蔽末端5 32P32P 5OH 33 H

31、O 堿性磷酸酶堿性磷酸酶催化核酸分子脫掉催化核酸分子脫掉55磷酸基團(tuán)，磷酸基團(tuán)，使使DNADNA（或（或RNARNA）片段的）片段的5-P5-P末端末端轉(zhuǎn)換成轉(zhuǎn)換成5-OH5-OH末端。末端。5 PP 5OH 33 HO 5 HOOH 5OH 33 HO ss或dsDNA或RNA5突出末端突出末端5隱蔽末端隱蔽末端細(xì)菌堿性磷酸酶（細(xì)菌堿性磷酸酶（bacterial alkaline bacterial alkaline phosphatasephosphatase，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱BAPBAP）小牛腸堿性磷酸酶（小牛腸堿性磷酸酶（calf intestinal calf intestinal alk

32、aline phosphatasealkaline phosphatase，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱CIPCIP） 兩種堿性磷酸酶的實(shí)用差別：兩種堿性磷酸酶的實(shí)用差別：lCIPCIP在在SDSSDS中加熱到中加熱到6868可以完全失活。可以完全失活。lBAPBAP是熱抗性酶，終止反應(yīng)困難，去是熱抗性酶，終止反應(yīng)困難，去除極微量的除極微量的BAPBAP活性需要用酚活性需要用酚/ /氯仿抽氯仿抽提多次。提多次。lCIPCIP的比活性比的比活性比BAPBAP高出高出1020倍。倍。 堿性磷酸酶的作用：堿性磷酸酶的作用：l序列分析中，需要序列分析中，需要5-5-末端標(biāo)記的末端標(biāo)記的DNADNA片段，在標(biāo)記之前必須從

33、片段，在標(biāo)記之前必須從DNADNA分子上除分子上除去去5-P5-P基團(tuán)?；鶊F(tuán)。lDNADNA體外重組，需要除去載體片段上的體外重組，需要除去載體片段上的5-P5-P基團(tuán)，以防線性化載體自我連接?；鶊F(tuán)，以防線性化載體自我連接。是一類從多核苷酸鏈的一頭開(kāi)始按序是一類從多核苷酸鏈的一頭開(kāi)始按序催化降解核苷酸的酶。常見(jiàn)的核酸外催化降解核苷酸的酶。常見(jiàn)的核酸外切酶切酶 核酸外切酶（核酸外切酶（exonucleasesexonucleases）由大腸桿菌由大腸桿菌xthAxthA基因編碼的單體蛋白基因編碼的單體蛋白質(zhì)。能夠按質(zhì)。能夠按3535的方向催化雙鏈的方向催化雙鏈DNADNA自自3-OH3-OH末端

34、釋放末端釋放5-5-單核苷酸。單核苷酸。主要應(yīng)用是：通過(guò)其主要應(yīng)用是：通過(guò)其3535活性使活性使雙鏈雙鏈DNADNA分子產(chǎn)生出單鏈區(qū)。分子產(chǎn)生出單鏈區(qū)。核酸外切酶核酸外切酶（exoexo）核酸外切酶最初是從感染了核酸外切酶最初是從感染了噬菌體噬菌體的大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的。能夠催的大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的。能夠催化雙鏈化雙鏈DNADNA分子自分子自5-P5-P末端進(jìn)行逐步的末端進(jìn)行逐步的加工和水解，釋放出加工和水解，釋放出55單核苷酸，但它單核苷酸，但它不能降解不能降解5-OH5-OH末端。末端。核酸外切酶（核酸外切酶（exoexo）l將雙鏈將雙鏈DNADNA轉(zhuǎn)變成單鏈的轉(zhuǎn)變成單鏈的DNAD

35、NA，供按，供按雙脫氧法進(jìn)行雙脫氧法進(jìn)行DNADNA序列分析使用；序列分析使用；l從雙鏈從雙鏈DNADNA中移去中移去55突出末端，以突出末端，以便用末端轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行加尾。便用末端轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行加尾。核酸外切酶的用途核酸外切酶的用途是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，在是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，在最適的酶催反應(yīng)條件下，降解單鏈最適的酶催反應(yīng)條件下，降解單鏈DNADNA的的速率要比雙鏈速率要比雙鏈DNADNA的快的快75 00075 000倍倍。其活性其活性表現(xiàn)需要低水平的表現(xiàn)需要低水平的ZnZn2+2+離子的存在，最離子的存在，最適適pHpH值范圍為值范圍為4.04.04.34.3。 單鏈核酸內(nèi)切

36、酶單鏈核酸內(nèi)切酶S1S1核酸酶與核酸酶與RNARNA分子定位分子定位催化催化RNARNA和單鏈和單鏈DNADNA分子降解成為分子降解成為55單核苷酸。同時(shí)它也能作用于雙鏈單核苷酸。同時(shí)它也能作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從此處切斷核酸分子的單鏈區(qū)，并從此處切斷核酸分子。核酸分子。S1S1核酸酶的主要功能核酸酶的主要功能S1S1核酸酶在分子生物學(xué)研究中的一個(gè)核酸酶在分子生物學(xué)研究中的一個(gè)最主要的功用是給最主要的功用是給RNARNA分子定位。分子定位。既具有單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性，同時(shí)也具有雙鏈特異的核酸外切酶活性。Bal31核酸酶與限制位點(diǎn)的確定l誘發(fā)誘發(fā)DNADNA發(fā)發(fā)生缺失突生缺失突變；變；主要用途主要用途從從DNADNA片段的兩端限定降解（制作缺失）。片段的兩端限