DB15∕T 2504-2022 羊胃腸道線蟲耐驅(qū)蟲藥的測定——糞便蟲卵減少試驗

1、ICS65.020.30CCSB4115內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB15/T 25042022羊胃腸道線蟲耐驅(qū)蟲藥的測定糞便蟲卵減少試驗Test method of anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes of sheep and goat（faecal egg count reduction test）2022-01-25 發(fā)布2022-02-25 實施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB15/T 25042022前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古

2、畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC 19）歸口。IDB15/T 25042022羊胃腸道線蟲耐驅(qū)蟲藥的測定-糞便蟲卵減少試驗D 范圍本文件規(guī)定了臨床檢測和評價羊胃腸道線蟲對驅(qū)蟲藥耐藥性的糞便蟲卵減少試驗。本文件適用于臨床檢測和評價不同飼養(yǎng)條件下羊胃腸道線蟲對驅(qū)蟲藥的耐藥性。E 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 19526羊寄生蟲病防治技術(shù)規(guī)范F 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。胃腸道線蟲gastrointesti

3、nal nematode寄生于羊胃腸道內(nèi)的線蟲。驅(qū)蟲藥anthelmintics用于防治羊胃腸道寄生線蟲感染所使用的化學(xué)制劑或藥物。敏感sensitivity寄生蟲種群對某一驅(qū)蟲藥物的耐受量低于常規(guī)劑量。中介 intermediary寄生蟲種群中部分群體對某一驅(qū)蟲藥物的耐受量超過了常規(guī)劑量。耐藥resistance寄生蟲種群對某一驅(qū)蟲藥物的耐受量超過了常規(guī)劑量，且可以遺傳。9克糞便蟲卵數(shù)eggs per gram of feces（EPG）1 g糞便中某種寄生蟲蟲卵的數(shù)目，是用來表示感染強(qiáng)度的指標(biāo)。G 糞便蟲卵減少試驗 原理通過糞便蟲卵減少試驗，依據(jù)羊驅(qū)蟲前后糞便胃腸道線蟲蟲卵減少率，結(jié)合統(tǒng)計

4、學(xué)中95 %置信域綜合評價蟲體耐藥性。 試驗動物及分組C.1.1 試驗動物8周內(nèi)未驅(qū)蟲且EPG不小于300的羊只。C.1.2 試驗分組依據(jù)糞便蟲卵數(shù)或者隨機(jī)將試驗動物分成對照組和不同藥物試驗組，每組15只羊。 試驗藥品B.1.1 應(yīng)使用經(jīng)國家批準(zhǔn)上市的藥物。B.1.2 該方法適用于所有類型驅(qū)蟲藥。 試驗方法6.2.1 在同等條件下飼養(yǎng)試驗動物，試驗組羊按驅(qū)蟲藥說明書用藥，對照組羊不用藥，具體操作依據(jù)GB/T 19526 相應(yīng)部分的規(guī)定執(zhí)行。6.2.2 通過直腸采集對照組和試驗組羊的糞便樣本，每只羊 5 g 左右。6.2.3 對照組和試驗組羊第一次糞便樣本采集時間為用藥 0 小時。單一類型驅(qū)蟲藥

5、耐藥性檢測時，第二次糞便樣本采集時間針對不同藥物有所差異按照附錄 A 的規(guī)定。對多種類型驅(qū)蟲藥同時進(jìn)行耐藥性檢測時，第二次糞便樣本采集應(yīng)在用藥 7 d 后。6.2.4 對照羊寄生線蟲蟲卵特征圖譜見附錄 E，通過稀釋蟲卵計數(shù)法按照附錄 B 的規(guī)定或改良麥克馬斯特蟲卵計數(shù)法按照附錄 C 的規(guī)定計數(shù)驅(qū)蟲前后 EPG。H 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用EXCEL整理數(shù)據(jù)，利用內(nèi)嵌公式統(tǒng)計試驗組和對照組用驅(qū)蟲藥前后EPG的算數(shù)平均數(shù)、糞便蟲卵減少率；統(tǒng)計分析確定95 %的置信域，統(tǒng)計方法按照附錄D的規(guī)定。I 羊胃腸道線蟲耐藥性評價指標(biāo) 敏感試驗組糞便蟲卵減少率大于95 %且95 %的置信域下限大于90 %。 中介以下兩種

6、情況視為羊胃腸道線蟲對驅(qū)蟲藥存在疑似耐藥，即中介。4.4.1 試驗組糞便蟲卵減少率小于 95 %且 95 %的置信域下限大于 90 %。4.4.2 試驗組糞便蟲卵減少率大于 95 %且 95 %的置信域下限小于 90 %。 耐藥試驗組糞便蟲卵減少率小于95 %且95 %的置信域下限小于90 %。DB15/T 25042022AA附 錄 A（規(guī)范性）不同類驅(qū)蟲藥第二次采樣時間常用驅(qū)蟲藥類型及耐藥性檢測中第二次采樣時間見表A.1。表A.1 常用驅(qū)蟲藥類型及耐藥性檢測中第二次采樣時間驅(qū)蟲藥類型有效成份劑量第二次采樣時間咪唑并噻唑類鹽酸左旋咪唑7.5 mg/kg；內(nèi)服3 d 7 d苯并咪唑類阿苯達(dá)唑1

7、0-15 mg/kg；內(nèi)服8 d 10 d大環(huán)內(nèi)酯類伊維菌素0.2 mg/kg；皮下注射10 d 14 d水楊酸類氯氰碘柳胺鈉5-10 mg/kg；皮下或肌肉3 d 7 dBB附 錄 B（規(guī)范性） 稀釋蟲卵計數(shù)法4.3 實驗設(shè)備、耗材及試劑普通光學(xué)顯微鏡、移液器、天平、燒杯、鑷子、量筒、凹玻片、蓋玻片、40目篩網(wǎng)、吸管、電磁爐、蔗糖、甲醛、純凈水。4.4 飽和蔗糖水配置向沸水中加入蔗糖顆粒并不斷攪拌，直至不再溶解。冷卻后，加入適量石炭酸以阻止霉菌生長。4.5 糞便稀釋液配置取2 mL甲醛溶于98 mL純凈水中。4.6 實驗方法4.6.1 樣本處理取新鮮糞便樣品2 g于100 mL燒杯中，加入3

8、0 mL純凈水（按1 g糞便加入15 mL純凈水計），用鑷子將糞便壓碎、充分?jǐn)嚢杈鶆颍?0目篩網(wǎng)過濾，將濾液攪拌混勻后，用移液器立即吸取中心處的液體0.3mL與等體積飽和蔗糖水混勻于凹玻片中，同時加蓋蓋玻片，做兩個重復(fù)。4.6.2 觀察靜置15 min后，通過顯微鏡計數(shù)兩個室內(nèi)的蟲卵（注意計數(shù)位于暗區(qū)邊緣的蟲卵），并記錄。4.6.3 統(tǒng)計將兩個計數(shù)室的蟲卵數(shù)取平均值，乘以100，可得到EPG。CC附 錄 C（規(guī)范性）改良麥克馬斯特蟲卵計數(shù)法4.2 實驗設(shè)備、耗材及試劑：普通光學(xué)顯微鏡、麥克馬斯特蟲卵計數(shù)板、天平、燒杯、鑷子、量筒、40目篩網(wǎng)、吸管、熱水壺、食用鹽、純凈水。4.3 飽和鹽水配置取

9、400 g食用鹽溶于1000 mL煮沸的純凈水中，充分?jǐn)嚢瑁鋮s后使用。4.4 實驗方法：4.4.1 樣本處理：取新鮮糞便樣品2 g于100 mL燒杯中，加入58 mL飽和食鹽水并用鑷子將糞便壓碎、攪拌均勻，用40目篩網(wǎng)過濾，將濾液攪拌混勻后，用吸管立即吸取中心處的液體于麥克馬斯特蟲卵計數(shù)板的計數(shù)室內(nèi)。4.4.2 觀察：靜置2 min后，通過顯微鏡計數(shù)兩個計數(shù)室內(nèi)的蟲卵，并記錄。4.4.3 統(tǒng)計：將兩個計數(shù)室的蟲卵數(shù)取平均值，乘以200，可得到EPG。DD附 錄 D（規(guī)范性） 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法 采用下式計算試驗組驅(qū)蟲后糞便蟲卵減少率FECRR = 1001 - ( X t / X c )%（D

10、.1）式中：FECRR 試驗組驅(qū)蟲后糞便蟲卵減少率；X t 試驗組驅(qū)蟲后克糞便平均蟲卵數(shù)；X c 對照組試驗后克糞便平均蟲卵數(shù)。 采用下式計算驅(qū)蟲后各組克糞便蟲卵數(shù)的方差（算術(shù)級別）ååS 2 = X 2 - (X )2 / n /(n - 1)ijijjijii （D.2）式中：iS 2 驅(qū)蟲后對照組或試驗組克糞便蟲卵數(shù)方差（算術(shù)級別）；j 組內(nèi)每一只羊；Xij 對照組或試驗組驅(qū)蟲后，組內(nèi)每只羊的克糞便蟲卵數(shù)（EPG）；ni 試驗組或?qū)φ战M組內(nèi)動物數(shù)。Y 2 =2222 采用下式計算各試驗組驅(qū)蟲后克糞便平均蟲卵數(shù)減少的方差（對數(shù)級別）St /(nt X t ) + Sc

11、/(nc X c )（D.3）式中：Y2 試驗組驅(qū)蟲后克糞便平均蟲卵數(shù)減少的方差（對數(shù)級別）；nt 各試驗組組內(nèi)試驗動物數(shù)；nc 對照組組內(nèi)動物數(shù)。 采用下式計算各試驗組糞便蟲卵減少率 95%置信域上限、下限。（D.4）式中：X t 試驗組驅(qū)蟲后克糞便平均蟲卵數(shù)；X c 對照組試驗后克糞便平均蟲卵數(shù)；Y2 試驗組驅(qū)蟲后克糞便平均蟲卵數(shù)減少的方差（對數(shù)級別）。EE附 錄 E（資料性）羊常見胃腸道線蟲蟲卵特征羊常見胃腸道線蟲蟲卵特征見表E.1。表E.1 羊常見胃腸道線蟲蟲卵特征蟲種名稱寄生部位蟲體大小(mm)蟲卵圖譜形態(tài)描述長徑(m)輻徑(m)綿羊毛首線蟲Trichuris ovis盲腸50.08

12、0.035.070.0蟲卵腰鼓形，黃褐色，兩端具塞。70803040奧利春細(xì)頸線蟲Nematodirus oiratianus小腸9.012.012.016.0蟲卵很大，卵內(nèi)細(xì)胞色黑較大。255272119153蒙古馬歇爾線蟲Marshallagia mongolica皺胃10.714.012.316.8蟲卵很大，卵細(xì)胞色較淡、較小且密集轉(zhuǎn)血矛線蟲Hcemonchus contortus皺胃18.022.018.030.0蟲卵橢圓形，卵殼略帶黃色。66954346環(huán)紋奧斯特線蟲Ostertagia circumcincta皺胃7.512.010.312.8蟲卵橢圓形，系典型的圓線蟲類蟲卵。89954659表E.1 羊常見胃腸道線蟲蟲卵特征（續(xù)）蟲種名稱寄生部位蟲體大小(mm)蟲卵圖譜形態(tài)描述長徑(m)輻徑(m)葉氏古柏線蟲Cooperia erschovi皺胃小腸胰臟4.711.18.811.4蟲卵橢圓形。67732241蛇形毛圓線蟲Trichostrongylus colubriformis小腸4.55.05.06.0蟲卵橢圓形。73764043羊仰口線蟲Bunostomum trigonocephalum小腸12.017.019.026.0蟲卵兩端鈍圓，兩側(cè)平直，胚細(xì)胞大而數(shù)少，內(nèi)含暗色顆粒。8