PGM測序方法-protocol

1、314芯片測序方法文庫構(gòu)建:PCR擴(kuò)增基因組DNA的目標(biāo)區(qū)域1.選擇下方合適的表格是基于用戶選擇的是2x的引物池還是5x的引物池。對每一個(gè)DNA和引物池的混合，將以下組分加入PCR管內(nèi)。以下表格提供了包含和未包含IonAmpliSeq?SampleIDPanel的反應(yīng)體系。對多個(gè)反應(yīng)可準(zhǔn)備配置混合溶液。2X弓I物池(Cat.nos.4477685,4477686,andcustompanels)成分不包含IDpanel(ul)包含IDpanel(ul)5XIonAmpliSeq?HiFiMix442XIonAmpliSeq?PrimerPool1010可選：20XIonAmpliSeq?Sam

2、pleIDPanel-1gDNA,10ngYYNuclease-freeWater6-Y5-Y總體積20205X弓I物池(Cat.nos.4471262and4475346)2.充分震蕩，簡單離心。3.將PCR管置于PCR儀內(nèi)，運(yùn)行一下程序以擴(kuò)增基因組上目標(biāo)區(qū)域。階段步驟溫度時(shí)間持續(xù)酶活化99c2分鐘循環(huán)數(shù)（根據(jù)下表格設(shè)置）變性99c15秒退火/延伸60c4/8/16*分鐘持續(xù)-10c持續(xù)+*4分鐘是對1536對引物池；8分鐘是對1537-6144對引物池；16分鐘是對6145-24576對弓I物池。+PCR產(chǎn)物可置于10c過夜儲(chǔ)存。引物對數(shù)目循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)DNA石蠟包埋DNA12-2421242

3、5-48202349-96192297-1921821193-3841720385-7681619769-153615181537-307214173073-614413166145-12288121512289-245761114注意:Readytousepanels:當(dāng)加入IonAmpliSeq?SampleIDpanel時(shí)不需要調(diào)整循環(huán)數(shù)。Customprimerpools：如果一個(gè)custom設(shè)計(jì)的panel中包含兩個(gè)引物池，并分別落在不同的循環(huán)數(shù)分類中，請選用更大的循環(huán)數(shù)來擴(kuò)增這兩個(gè)引物池。一般標(biāo)準(zhǔn)樣品可以增加一個(gè)循環(huán)，從而保證其擴(kuò)增效率，石蠟切片樣品可增加2-3個(gè)循環(huán)。如果引物池有

4、兩管及以上，應(yīng)當(dāng)分別擴(kuò)增（10心體系）。擴(kuò)增完后混合取20心進(jìn)行下輪實(shí)驗(yàn)。暫停點(diǎn)-PCR產(chǎn)物可以儲(chǔ)存在10過夜，需要更長時(shí)間儲(chǔ)存，可以置于W0C.部分消化引物序列1 .輕度離心PCR管將反應(yīng)后溶液收集到管底。往每個(gè)混合反應(yīng)液中加入2微升FuPaReagent,總體系達(dá)到22微升。2 .充分振蕩混勻，輕度離心將液體收集到管底。（也可以選擇用槍吸取一半以上的液體上下吹打至少5次來混勻）3 .將PCR管放入PCR儀，按以下程序運(yùn)行。溫度50c時(shí)間10分鐘55c10分鐘60c20分鐘10c持或（取JK至1小時(shí)）將接頭連接至擴(kuò)增產(chǎn)物并純化配置并運(yùn)行連接反應(yīng)1 .如果有可見的沉淀物在Sw讓ch溶液中，通過

5、室溫下震蕩或上下吹吸來溶解并重懸2 .小心PCR管加入以下成分到每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)消化樣本。在加入之前可先混合Switch溶液和接頭Examplebarcodeadaptermixforupto4reactionsComponentVolumeIonPIAdapter2pLIonXpressBarcodeX+2pL4pL8uLNuclease-freeWaterTotalX二barcodechosen成分體積（lL）SwitchSolution4稀釋的barcode接頭混合物2總體積283 .在每個(gè)PCR管內(nèi)加入2微升DNA連接酶4 .充分振蕩混勻，輕度離心將液體收集到管底。（也可以選擇用槍吸取一半

6、以上的液體上下吹打至少5次來混勻）5 .將PCR管放入PCR儀，按以下程序運(yùn)行。溫度時(shí)間22C30分鐘72C10分鐘10c1寸以（取k±1小時(shí)）暫停點(diǎn)-產(chǎn)物可以置于W0°C保存。純化未擴(kuò)增的文庫使用Agencourt?AMPure?XP試齊【J1.5x樣本體積重要事項(xiàng)！<AMPure?XPreagent置于室溫并充分振蕩將磁珠混勻，使用時(shí)緩慢吸取.接下來的步驟需要使用新鮮配置的70%乙醇。對每個(gè)樣品，混合230微升無水乙醇和100微升無核酶水。1.將加完接頭的文庫轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管內(nèi)，加入45微升（1.5x樣本體積）的Agencourt?AMPure?XP試劑。用

7、槍吹打5次使DNA與磁珠懸浮液充分混勻。2.將混合液置于室溫5分鐘3.將1.5ml離心管置于DynaMag?-96SideMagnet（Cat.no.12331D廨力架上,靜置2分鐘或者等溶液變清澈。小心地吸走并棄掉上清，不要擾動(dòng)磁珠。4.向離心管中加入150新鮮配制的70%乙醇，在磁力上來回移動(dòng)1.5ml離心管來洗滌磁珠，然后小心地棄去上清，不要擾動(dòng)磁珠。5.重復(fù)第4步，進(jìn)行第二次洗滌6,確保乙醇液滴已全部從孔中吸走。將1.5ml離心管放置于磁力架上，室溫空氣干燥5分鐘，注意不要過度干燥。7,將1.5ml離心管從磁力架上拿開，在每管中加入50LLowTE充分浸潤磁珠。充分振蕩混勻，輕度離心將

8、液體收集到管底。（也可以選擇用槍吸取一半以上的液體上下吹打至少5次來混勻）8,將1.5ml離心管置于磁力架上2分鐘。上清液中含有文庫。文庫擴(kuò)增：1,將1.5mlEP管從磁力架上取下，力口50仙IPlatinum?PCRSuperMixHighFidelity和2（JofLibraryAmplificationPrimerMix。Platinum?PCRSuperMixHighFidelity和LibraryAmplificationPrimerMix需要事先混合好。充分漩渦震蕩后簡單離心，或者用槍上下吹吸5次。2,將1.5mlEP管放在磁力架上至少2分鐘，將上清約50d轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的200L

9、PCR內(nèi)。3.運(yùn)行一下PCR程序StageTemperatureTimeHold982min5cycles980c15sec641minHold10Hold純化擴(kuò)增后的文庫第一輪純化1.力口入251（0.5X的樣品體積）Agencourt?AMPure?XPReagent到每個(gè)樣品管中，用移液槍吹吸5次。2,室溫下靜置5分鐘3 .將樣品管放在磁力架上至少5分鐘，直至溶液變澄清4 .小心的將上清移入另一個(gè)干凈的PCR管中。第二輪純化1 .在第一輪純化取到的上清中加入60仙lAgencourt?AMPure?XPReagent,用槍頭反復(fù)吹吸5次2 .室溫下靜置5分鐘。3 .將樣品管放在磁力架上至

10、少3分鐘，直至溶液變澄清，將上清吸除。4 .加入150履新鮮配置的70%的酒精，緩慢旋轉(zhuǎn)兩圈，將上清吸除。5 .重復(fù)步驟46 .確保酒精完全被移除，打開管蓋，常溫干燥5分鐘。7 .將樣品管從磁力架上取下，加入50屋LowTE,充分漩渦震蕩，簡單離心，或?qū)⒁埔簶屨{(diào)至40叱l吹吸5次。8 .將樣品管放入磁力架后，靜置兩分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管。Qubit定量1 .制備Qubit?dsDNAHSreagent稀釋液：1lQubit?dsDNAHSreagent力口199仙lQubit?dsDNAHSBuffer02 .在10n的amplifiedIonAmpliSeq?library中

11、加入190仙的dyereagent混合充分后靜置2分鐘。3 .1nL樣品中加入199nLdyereagen®行測樣。定量完成后，不同引物的相同樣品的管合為一管（相同濃度）每管定到300PM,混合后能達(dá)到100PM。IonPGM200bp自動(dòng)模本制備在IonOneTouch2instrument上制備模板ISP1.4.1IonOneTouch2儀器準(zhǔn)備1.4.1.1 打開lonOneTouch2背面的電源開關(guān)；按觸摸屏上OPENLID,等待離心機(jī)蓋打開；1.4.1.2 參照圖1將RecoveryTubes(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200)放置于IonOne

12、Touch2離心收集器的轉(zhuǎn)子中，隨后將RecoveryRouters(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200)放置于相應(yīng)位置，手動(dòng)蓋上離心機(jī)蓋；圖11.4.1.3 參照圖2順序?qū)onOneTouch?2AmplificationPlate(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200)放置于加熱模塊中，將加熱模塊手柄壓向自己身體方向，蓋上IonOneTouch?Lid,導(dǎo)管固定于上端的卡口和正面右上角的支架上，將AmplificationPlate的注射針垂直插入IonOneTouch?DLInjectorHub,直至接觸到底部的RecoveryRout

13、er,然后松開注射針圖21.4.1.410 nOneTouch?Oil和IonPGMOT2RecoverySolution添加1.4.1.4.1 每次開始使用新的IonPGM?TemplateOT2200Kit,丟棄掉前一個(gè)試劑盒使用的IonOneTouch?Sipper和IonOneTouch?Tubes,戴上新的乳膠手套，裝上新的IonOneTouch?Sipper；將IonOneTouch?Oil瓶(IonPGMtmTemplateOT2Solutions200)上下顛倒10次，倒入任意一個(gè)新的IonOneTouch?Tube中，約1/2滿，安裝至標(biāo)示有1人,的下方相應(yīng)位置擰緊；IonP

14、GMOT2RecoverySolution(IonPGMtmTemplateOT2Solutions200)倒入另一個(gè)新的IonOneTouch?Tube中，約1/3滿，安裝至標(biāo)示有6的下方相應(yīng)位置擰緊；1.4.1.4.2 同一個(gè)IonPGM?TemplateOT2200Kit的后續(xù)使用準(zhǔn)備時(shí)，將IonOneTouch?Oil(IonPGMtmTemplateOT2Solutions200)瓶上下顛倒10次，取下有IonOneTouch?Oil的IonOneTouch?Tube,劇烈混勻至產(chǎn)生微小的氣泡(圖3),加入IonOneTouch?Oil,約1/2滿，安裝至標(biāo)示有(人的下方相應(yīng)位置擰緊

15、；將IonPGMOT2RecoverySolution(IonPGMTMTemplateOT2Solutions200)倒入另一個(gè)的含有IonPGMOT2RecoverySolution的IonOneTouch?Tube中，約1/3滿，安裝至標(biāo)示有6的下方相應(yīng)位置擰緊；圖31.4.1.4.3 IonOneTouch反應(yīng)液相準(zhǔn)備及上機(jī)1.4.2.1 按照如下表格順序室溫配置體系，試劑來自IonPGMMTemplateOT2Reagents200順序試劑管蓋顏色體積（ul）處理方式及狀態(tài)1Nuclease-FreeWater252IonPGIMTemplateOT2200ReagentMix紫色5

16、00提前室溫放置，充分溶解至尢沉淀，漩渦混合確保充分溶解，使用后剩余的保fr-f4C3IonPGM?TemplateOT2200PCRReagentB藍(lán)色300充分溶解至無沉淀，漩渦混合確保充分溶解，使用后剩余的保存于室溫4IonPGMTemplateOT2200EnzymeMix褐色50短暫離心后，冰上放置5測序用文庫25將定量好的文庫稀釋至15ng/ml,取2ul稀釋到25ulTotal9001.4.2.2 將上述體系渦旋震蕩5s,稍離心；1.4.2.3 將IonPGM?TemplateOT2200IonSphere?Particles最大速漩渦混勻1min,上下吸打5次后，吸取100ul

17、,加入6.4.2.1的液相體系中，上下吸打混勻，室溫放置備用；1.4.2.4 將IonPGMOneTouch?PlusReactionFilter（IonPGMMTemplateOT2Reactions200）置于15ml離心管上（圖4）,將6.4.2.3種配制好的液相體系漩渦混勻5s,短暫離心2s；用1000ul移液器將所有的液相緩慢從距離另外兩個(gè)孔較遠(yuǎn)的樣品孔（圖4）注入reactionfilter,注意移液頭與樣品孔緊密接觸插緊；圖41.4.2.5 用1000ul移液器從此孔緩慢加入1000ulIonOneTouch?ReactionOil(IonPGITMTemplateOT2Solu

18、tions200),更換一個(gè)新的1000ulUniversalFitFilterTip移液頭(防止交叉污染)，再緩慢加入500ulIonOneTouch?ReactionOil,避免管內(nèi)導(dǎo)管接1.4.2.6 如圖5,將加樣孔置于左側(cè)，順時(shí)針倒轉(zhuǎn)reactionfilter觸反應(yīng)液相;圖51.4.2.7 如圖6,將reactionfilter插入IonOneTouch?相應(yīng)位置，邊緣凸起位置朝向自己;1.4.2.8在系統(tǒng)顯示屏上選擇RUN（圖7）;gtorrent山一4叁<>口4*圖71.4.2.9 選擇IonPGMTMTemplateOT2200kit（圖8）iontorrent.

19、ProtocolPGM:ionPGM*Ttmplatt0T220QKit163.0.00P'SIPGM:gnPGMTHTemplateOT2200ICitProtonIonPPTemplateOT2200KitPGM：IonPGHmTemplateOT2400KrtProtonIonPLTemplateOT2200Kitv2Proton：IonProton"ITemiplateOT2Kit圖81.4.2.10 然后選擇Expert,最后點(diǎn)擊NEXTF始運(yùn)行。1.4.3運(yùn)行結(jié)束及IonOneTouch?清洗6.4.3.1 模板制備程序運(yùn)行結(jié)束，在顯示屏上選擇兩次next鍵，進(jìn)入

20、離心程序，約10min；6.4.3.2 將注射針拔出，放入一個(gè)空的50mL的管子（圖9）;圖96.4.3.3 打開離心收集器蓋，用清潔紙巾將蓋子上的液體擦拭干凈，拿掉RecoveryRouter,小心緩慢將RecoveryTubes取出放于板架上，模板ISP位于RecoveryTubes底部外側(cè)（圖10）圖106.4.3.4 拿掉ReactionFilter,將CleaningAdapter(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200)凸出部分面向自己插入相應(yīng)位置(圖11)圖116.4.3.5 選擇next鍵退出離心程序，回到主界面，在屏幕上選擇Clear,6.4.3.6 根

21、據(jù)提示選擇next,直至程序運(yùn)行，運(yùn)行時(shí)間約10min6.4.3.7 清洗結(jié)束后取下AmplificationPlate和廢液管一起扔進(jìn)專門的垃圾桶,關(guān)閉電源IonOneTouchES的操作及陽性模板富集1.5.1 沿遠(yuǎn)離沉淀一側(cè)，自液面開始小心將兩管RecoveryTubes中的上清液吸掉，各剩余約50uL;1.5.2 取一個(gè)新的1.5mL的Non-StickTube,將RecoveryTubes中剩余50uL液體吹打10次后吸入其中；1.5.3 在兩管RecoveryTubes中各加入100uLWashSolution（IonOneTouch?200SolutionsKitv2）,吹打混勻

22、后，吸入6.4.2的1.5mLNon-StickTube中；1.5.4 在6.5.3的1.5mLNon-StickTubes中再加入1000uL200uLWashSolution,最大轉(zhuǎn)速漩渦振蕩10s混勻，15500g離心3min;1.5.5 沿遠(yuǎn)離沉淀一側(cè)，自液面開始小心吸掉上清液，剩余100uL在管底，低速漩渦振蕩10s混勻；1.5.6 配制好新鮮的1MNaOH（1MNaOHI長可在一周內(nèi)使用）；取一個(gè)1.5mL普通離心管，按如下表格配制Melt-OffSolution（每次新鮮配制）順序試劑體積（ul）1Tweensolution(IonPGMTMTemplateOT2Solution

23、s200)28021MNaOH40Total3201.5.7 吸取130uLMyOne?BeadsWashSolution到一個(gè)新的1.5mL的Non-StickTube中；將Dynabeads?MyOne?StreptavidinC1Beads最大轉(zhuǎn)速漩渦震蕩30s,取13.0uL到上述1.5mL的Non-StickTube,漩渦振蕩混勻30s,短暫離心2s；1.5.8 將6.5.7的離心管置于DynaMag?2magnet上2min或至溶液澄清，小心吸掉上清，避免碰觸沉淀；將離心管從DynaMag?2magnet上取下，吸取130uLMyOne?BeadsWashSolution到離心管中

24、，漩渦振蕩懸浮Dynabeads?MyOne?StreptavidinC1Beads;1.5.9 取一個(gè)8-wellstrip(IonPGMtmTemplateOT2Supplies200),方頭永遠(yuǎn)u.口nnnnnnun放方頭123456I78圓頭在IJIItIIJLJlItI面朝自己的左面，從左到右依次編號為1到8(圖12);圖121.5.10 按如下表格在8-wellstrip中加入相應(yīng)試劑(IonPGMtmTemplateOT2Solutions200)孔編號對應(yīng)孔試劑1（方頭條-個(gè)）6.5.5中的100ul模板ISP(U)26.5.8中130ulDynabeads?MyOne?Str

25、eptavidinC1Beads(B)3300uLIonOneTouch?WashSolution(W)4300uLIonOneTouch?WashSolution(W)5300uLIonOneTouch?WashSolution(W)6空7吸取300uL6.5.6中新鮮配制的Melt-Offsolution(M)8空1.5.11 將8-wellstrip放入IonOneTouch?ES前方白色模塊中的凹槽中，方頭在左，緊靠在凹槽右側(cè)；1.5.12 取一個(gè)新的Tip(IonPGMTMTemplateOT2Supplies200)放入TipLoader中，從支架上取下TipArm插入TipLoa

26、der中，用力向下按緊1s,松開，取下TipArm放回支架上（一定要放到位），新的Tip已裝在TipArm下方（圖13）;圖131.5.13 在TipArm下方的洞中放一個(gè)開口的0.2ml的PCRf，里面加入NeutralizationSolution10ul（IonPGMMTemplateOT2Solutions200）；1.5.14 打開IonOneTouch?ES電源，按Start/Stop鍵，運(yùn)行過程中顯示屏上一直顯示“run"，IonOneTouch?ES自動(dòng)開始陽性模板富集；1.5.15 富集過程結(jié)束是，IonOneTouch?ES會(huì)有蜂鳴提示，并且顯示屏顯示"

27、End',整個(gè)過程約40min；1.5.16 結(jié)束后，將用過的Tip取下，和8-wellstrip一起扔進(jìn)專門的垃圾桶，關(guān)閉電源1.5.17 取出0.2mLPCR管扣上蓋子,15500g離心3min;1.5.18 沿遠(yuǎn)離沉淀一側(cè)，從液面開始小心吸掉上清，剩余10uL在管底；1.5.19 加入200uLIonOneTouch?WashSolution，上下吹打混勻10次，15500g離心3min,沿遠(yuǎn)離沉淀一側(cè)，從液面開始小心吸掉上清，剩余10uL在管底；1.5.20 加入100uLIonOneTouch?WashSolution,上下吹打混勻10次，若不立即進(jìn)行后續(xù)的測序，可置于4c保

28、存2-3天。IonPGM200bp讀長上機(jī)測序操作PGM的清洗1.2.1 氯片清洗（如果PGMS過48個(gè)小時(shí)未使用，請首先用氯片清洗）；1.2.1.1 將W1氯片清洗并每次50ml18MQ去離子水漂洗3次，備用；W1清洗瓶用每次50ml18MQ去離子水漂洗3次后，加滿250mI18MQ去離子水，備用；1.2.1.2 將1L的容器用每次100ml18MD去離子水漂洗3次，裝滿1L18MD去離子水，放入一片PGMIeaningTablet（IonPGMSequencingSolutions200Kitv2）,靜置10min；1.2.1.3 10min后，加入1ml1MNaOH,混勻（該溶液請?jiān)?-

29、3小時(shí)之內(nèi)使用）；1.2.1.4 用0.22m濾器過濾250ml以上氯片溶液到W1氯片清洗瓶中；1.2.1.5 打開PGMfe源，壺C氣輸出氣壓調(diào)至30psi;1.2.1.6 PGM啟動(dòng)完畢后，點(diǎn)擊進(jìn)入Clean菜單，確保芯片座上有一塊舊芯片；1.2.1.7 按屏幕提示，勾選Chloritecleaning，點(diǎn)擊NEXT1.2.1.8 通過后按提示將W1氯片清洗瓶擰上W1位（保證有吸管）；1.2.1.9 將W開口W3青洗瓶擰上相應(yīng)的位置保證有各自的空清洗瓶及吸管，清空廢液瓶的廢液；1.2.1.10 去掉前端四種dNTPs尖底管，不要取下吸管，在吸管下放置廢液缸；1.2.1.11 按next,進(jìn)

30、入清洗程序；1.2.1.12 第一輪清洗結(jié)束后，用18MQ去離子水涮洗W1位的吸管，將含250ml18MD去離子水的W1清洗瓶擰上W1位，按next進(jìn)入第二輪清洗程序；1.2.1.13 第二輪清洗結(jié)束，整個(gè)PGM青洗結(jié)束，可進(jìn)入初始化步驟；1.2.2 18MQ去離子水清洗（兩次初始化之間小于24h）;1.2.2.1 W1清洗瓶用每次50ml18MQ去離子水漂洗3次后，加滿250ml18MQ去離子水，備用；1.2.2.2 打開PGMfe源，壺C氣輸出氣壓調(diào)至30psi;1.2.2.3 PGM啟動(dòng)完畢后，點(diǎn)擊進(jìn)入Clean菜單，確保芯片座上有一塊舊芯片；1.2.2.4 按屏幕提示，勾選18-MOh

31、mwatercleaning，點(diǎn)擊NEXT1.2.2.5 通過后按提示將W1清洗瓶擰上W1位（保證有吸管）；1.2.2.6 將W開口W3青洗瓶擰上相應(yīng)的位置保證有各自的空清洗瓶及吸管，清空廢液瓶的廢液；1.2.2.7 去掉前端四種dNTPs尖底管，不要取下吸管，在吸管下放置廢液缸；1.2.2.8 按next,進(jìn)入清洗程序，18MQ去離子水清洗只進(jìn)行一輪，結(jié)束后可以開始6.3PGM初始化。PGM初始化1.3.1 將試劑盒中dNTPs(IonPGM?SequencingReagents200Kitv2)取出,在冰上融化備用；）用每次200ml18M1,如果有兩條接縫1.3.2 將W2式劑瓶（Ion

32、PGM?SequencingSupplies200Kitv2Q去離子水漂洗3次，在上部接線處用記號筆標(biāo)記（見圖線，標(biāo)記下面的那條），加入18MQ去離子水至標(biāo)記處;M口上UMrru-Ka：圖11.3.3 將整瓶IonPGM?Sequencing200v2W2Solution倒如6.3.2的加了18MQ去離子水的W2式劑瓶中；1.3.4 力口100mMNaOH140ul到W2試劑瓶中，蓋上瓶蓋，上下倒置數(shù)次混勻后備用；1.3.5 W1,W3（IonPGM?SequencingSupplies200Kitv2）試劑瓶用18MQ去離子水漂洗，每次50ml,漂洗3次；1.3.6 在W1試劑瓶中加入350

33、ul100mMNaOH溶液，蓋上瓶蓋備用;1.3.7 在W3式劑并中1XW3Solution至50ml刻度處，蓋上瓶蓋備用；1.3.8 在主菜單界面中選擇Initialize，保持芯片座上有一塊舊芯片，按Next檢測是否有漏氣；1.3.9 按Next,根據(jù)屏幕提示，穿戴新的乳膠手套，將新的長吸管（IonPGM?SequencingSupplies200Kitv2）換到W2位置的蓋上（避免碰觸其它表面），擰上制備好的W2式劑瓶（見圖2）;圖21.3.10 按Next,同樣將制備好的W1和W3試劑瓶擰上各自的位置（用新的短吸管），確認(rèn)密封無誤；1.3.11 按Next,開始第一階段的初始化過程，大

34、約需要30min；1.3.12 將冰上融化的四種dNTPs漩渦振蕩混勻，短暫離心后放置于冰上；1.3.13 在四個(gè)50ml的尖底離心管（試劑盒提供）標(biāo)記上dGTP,dCTP,dATP和dTTP;1.3.14 用帶濾芯的移液頭在每管中加入相應(yīng)的dNTP20ul,冰上放置備用；1.3.15 第一階段的初始化成功后，拔去前面dNTP容液管位置上的舊的吸管，移走廢液缸；1.3.16 穿戴新的乳膠手套，在4個(gè)dNTP溶液管位置插上新的吸管（尾部為深藍(lán)色），見圖3;1.3.17 對應(yīng)符號，擰上相應(yīng)的dNTP溶液管（。為dGTPX為dCTP為dATP,+為dTTP）,確保密封;1.3.18 按Next,進(jìn)行

35、最后的初始化1.3.19 在所有初始化程序成功后，按Next結(jié)束初始化，可進(jìn)入最后的測序反應(yīng)測序上樣準(zhǔn)備及測序1.4.1 測序程序設(shè)定1.4.1 瀏覽器地址欄輸入2mnnq1,進(jìn)入TorrentBrower;1.4.2 點(diǎn)擊進(jìn)入Planning頁；1.4.3 根據(jù)測序類型點(diǎn)擊相應(yīng)類型的PLANNEWRUN項(xiàng)，進(jìn)入設(shè)定頁面，第一部分是Application,可以在此修改需要的測序類型（圖4）；NewGenericSequencingRunPlanAppllCltlM.OAirpuseqDF4AGerffincSequendng0TargetSeqOGenomeqAi伊與eqRHA©RH

36、Am&peMi%Mciat1.4.4 點(diǎn)擊NEXT進(jìn)入KIT設(shè)定，選擇正確的librarykit,Templatingkit,sequencingkit(200bpDN位庫為例，選擇IonPlusFragmentkit,IonPGMTemplatingOT2200kit,IonPGMsequencing200kitv2)；Flows:200NewGenericSequencingRunPlanL4M巧KIC力MDrM*tanVHyfiFragmentU;»t«mpMxigiKrtWOfieTCrtKnTempiale-5aqu門“Mrt讀長選擇500、400讀長選擇

37、850;如果使用Barcode,在BarcodeSet里選擇相應(yīng)的Barcode數(shù)據(jù)庫；最后選擇相應(yīng)的ChipType(圖5);AetafefKnRbgniEiporiEll同小。2|:ControlMruHS但的舊間:ChipTypa(optMnall'：1.4.5直接點(diǎn)擊Reference,如果有參考序列選擇相應(yīng)的參考序列（圖6）Nev/GenericSequencingRunPlanMfe-rt-nte'fiparrPLmTlffMEt臚mBEDFlit!HaEspolRegionsBfD戶*.圖61.4.6直接點(diǎn)擊Plan,輸入RUNNamBSampleName最后點(diǎn)擊

38、Plan完成程序設(shè)定（圖7)。NewGenericSequencingRunPlaniWiciiDanKJOPnsiwlExportPIMRunPlanName“Etquined，:Emerrnnple由跑力時(shí)制代儀力加加獷？3HlMrequire可.MtA*not#:口rsg悔rewort)Rwlbm314芯片的上樣準(zhǔn)備及測序1.5.1 轉(zhuǎn)移一半的模板ISP至200ulPCR管中；1.5.2 如果轉(zhuǎn)移過來的樣本ISP模板體積大于50ul,則15,500xg離心后，移去多余的上清，剩余50ul;小于等于50ul則直接到下一步；1.5.3 漩渦振蕩Contr0110nSphere1min,短暫離

39、心2s,然后加5ul到樣本模板ISP的PCR管中；1.5.4 再力口AnnealingBuffer150ul,漩渦振蕩混勻，15,500xg離心2min；1.5.5 避開離心外側(cè)，自上而下小心移去上清，剩3ul的溶液于管底；1.5.6 加入3ul的SequencingPrimer到含3ul模板ISP的PCRt中，用移液器吸打充分混勻；1.5.7 熱循環(huán)儀上，95C2min,37C2min處理，室溫放置備用；1.5.8 在PGMfc菜單按RUN確保舊的芯片在芯片座上，按Next選擇測序試劑盒類型，繼續(xù)按NEXT僉測通路是否密封；1.5.9 檢測通過后，脫掉乳膠手套將手指在接地金屬板上碰觸一下，取

40、下舊芯片，將新的314芯片（400bp讀長請一定使用314V2chip）從包裝袋中取出，放置于芯片座上（避免乳膠手套產(chǎn)生靜電效應(yīng)擊穿芯片底座）；1.5.10 合上芯片上模塊，操作屏上按Next,按提示掃描芯片包裝袋的條形碼，確認(rèn)后按CHIPCHEC港行芯片檢測；1.5.11 檢測通過后，將彳事則芯片置于Ioncentrifugeadapter上（不要將芯片置于其它表面），重新替代入舊芯片，合上芯片上模塊；1.5.12 在引物雜交反應(yīng)結(jié)束后的含樣本ISP模板的PCRt中加入1ul的SequencingPolymerase,混勻室溫靜置5min；1.5.13 45度手持芯片，用RaininSR-L10