發(fā)酵工程_青霉素的制備

1、 -青霉素類抗生素青霉素類抗生素青霉素簡介青霉素簡介 化學結(jié)構(gòu)化學結(jié)構(gòu) 理化性質(zhì)理化性質(zhì) 青霉素合成及調(diào)控青霉素合成及調(diào)控 生物合成生物合成 生物合成的調(diào)控生物合成的調(diào)控青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝 菌種菌種 發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝流程 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)控制發(fā)酵培養(yǎng)控制 青霉素簡介青霉素簡介青霉素的發(fā)現(xiàn)青霉素的發(fā)現(xiàn) 19291929年英國學者年英國學者弗萊明首先在抗弗萊明首先在抗生素中發(fā)現(xiàn)了青生素中發(fā)現(xiàn)了青霉素，英國謝菲霉素，英國謝菲爾德大學病理學爾德大學病理學家弗洛里實現(xiàn)對家弗洛里實現(xiàn)對青霉素的分離與青霉素的分離與純化。純化。青霉素的化學結(jié)構(gòu)青霉素的化學結(jié)構(gòu) 青霉素是含有青霉素母

2、核的多種化青霉素是含有青霉素母核的多種化合物的總稱，青霉素發(fā)酵液中至少含有合物的總稱，青霉素發(fā)酵液中至少含有5 5種以上的不同的青霉素：青霉素種以上的不同的青霉素：青霉素F F、青、青霉素霉素X X、青霉素、青霉素K K及二氫青霉素及二氫青霉素F F等。等。青霉素分子結(jié)構(gòu)球棍模型青霉素分子結(jié)構(gòu)球棍模型青霉素合成及調(diào)控青霉素合成及調(diào)控青霉素的生物合成青霉素的生物合成青霉素的生物合成與賴氨酸的反饋調(diào)節(jié)青霉素的生物合成與賴氨酸的反饋調(diào)節(jié) 用產(chǎn)黃霉菌生產(chǎn)青霉素要受到賴氨酸的阻用產(chǎn)黃霉菌生產(chǎn)青霉素要受到賴氨酸的阻遏，這是由于其賴氨酸生物合成途徑的初始遏，這是由于其賴氨酸生物合成途徑的初始酶酶高檸檬酸合成

3、酶受到了賴氨酸反饋阻遏。高檸檬酸合成酶受到了賴氨酸反饋阻遏。 在賴氨酸生物合成途徑中，從氨基己二酸在賴氨酸生物合成途徑中，從氨基己二酸分支而產(chǎn)生青霉素，這種賴氨酸阻遏是初級代分支而產(chǎn)生青霉素，這種賴氨酸阻遏是初級代謝調(diào)節(jié)的效果用到次級代謝上的最好的例子。謝調(diào)節(jié)的效果用到次級代謝上的最好的例子。青霉素的生物合成與糖分解代謝青霉素的生物合成與糖分解代謝的關(guān)系的關(guān)系 青霉素的生物合成受糖分解代謝產(chǎn)物青霉素的生物合成受糖分解代謝產(chǎn)物的阻遏，如合成青霉素的酰基轉(zhuǎn)移酶就會的阻遏，如合成青霉素的?；D(zhuǎn)移酶就會被阻遏。在青霉素發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)能被被阻遏。在青霉素發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)能被青霉素迅速利用的葡萄糖有利于

4、菌體生長，青霉素迅速利用的葡萄糖有利于菌體生長，但抑制青霉素的合成，而被緩慢利用的乳但抑制青霉素的合成，而被緩慢利用的乳糖，卻是生產(chǎn)青霉素的最好碳源。糖，卻是生產(chǎn)青霉素的最好碳源。 乳糖比葡萄糖優(yōu)越的主要原因乳糖比葡萄糖優(yōu)越的主要原因是乳糖是乳糖被水解成單糖的速度正好符合青霉素生產(chǎn)被水解成單糖的速度正好符合青霉素生產(chǎn)期合成青霉素的需要，而又不會產(chǎn)生高濃期合成青霉素的需要，而又不會產(chǎn)生高濃度的分解產(chǎn)物來抑制青霉素的合成，因此，度的分解產(chǎn)物來抑制青霉素的合成，因此，碳源多用葡萄糖加乳糖或利用某些非糖原碳源多用葡萄糖加乳糖或利用某些非糖原料如植物油等。但由于乳糖價格較貴，成料如植物油等。但由于乳糖價

5、格較貴，成本較高，故在生產(chǎn)實踐中常通過間隙或滴本較高，故在生產(chǎn)實踐中常通過間隙或滴加葡萄糖的方法控制培養(yǎng)液中糖的含量，加葡萄糖的方法控制培養(yǎng)液中糖的含量，以符合菌體生長和青霉素生物合成的需要。以符合菌體生長和青霉素生物合成的需要。這樣，可以降低成本，提高產(chǎn)量。這樣，可以降低成本，提高產(chǎn)量。青霉素生產(chǎn)發(fā)酵工藝青霉素生產(chǎn)發(fā)酵工藝菌種菌種 目前國內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培目前國內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種，養(yǎng)中菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種，根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，常用菌種為綠孢絲狀菌和綠孢子絲

6、狀菌，常用菌種為綠孢子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉素。子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉素。青霉素產(chǎn)生菌的生長過程青霉素產(chǎn)生菌的生長過程分生孢子發(fā)芽期分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒形成期脂肪粒減少，小空孢脂肪粒減少，小空孢大空孢大空孢自溶自溶菌絲生長期菌絲生長期青霉素分泌期青霉素分泌期菌絲自溶期菌絲自溶期培養(yǎng)基培養(yǎng)基碳源青霉菌能利用多種碳源如乳糖、蔗糖、葡萄碳源青霉菌能利用多種碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液進行流加。糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液進行流加。氮源可采用玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或氮源可采用玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮粉等有機氮源，及氯化氨、硫酸

7、氨、硝酸氨麩皮粉等有機氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等無機氮源。等無機氮源。前體為生物合成含有芐基基團的青霉素前體為生物合成含有芐基基團的青霉素G，需要，需要在發(fā)酵中加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它在發(fā)酵中加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它們對青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于們對青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次加入方式。，并采用多次加入方式。無機鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類。鐵離子無機鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類。鐵離子對青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴格控制發(fā)酵液中鐵含對青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴格控制發(fā)酵液中鐵含量在量在30ug/mL以下。以下。青霉素生產(chǎn)工藝過程青

8、霉素生產(chǎn)工藝過程 抗生素制備的一般流程圖抗生素制備的一般流程圖菌種菌種孢子制備孢子制備種子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾提取及精制提取及精制成品檢驗成品檢驗成品包裝成品包裝前體前體發(fā)酵階段發(fā)酵階段提取階段提取階段發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝流程一、總述一、總述 青霉素發(fā)酵青霉素發(fā)酵將青霉菌接種到將青霉菌接種到固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上基上培養(yǎng)一段時間，得到培養(yǎng)一段時間，得到青霉菌孢子培養(yǎng)青霉菌孢子培養(yǎng)物物。用無菌水將孢子制成懸浮液接種到。用無菌水將孢子制成懸浮液接種到種種子罐子罐內(nèi)已滅菌的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣內(nèi)已滅菌的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣攪拌，培養(yǎng)。然后將種子培養(yǎng)液接種

9、到攪拌，培養(yǎng)。然后將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)發(fā)酵罐酵罐已滅菌的含有已滅菌的含有苯乙酸前體苯乙酸前體的培養(yǎng)基中，的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣攪拌，培養(yǎng)。通入無菌空氣攪拌，培養(yǎng)。 青霉素菌種發(fā)酵工藝的原理青霉素菌種發(fā)酵工藝的原理 二、二、 青青霉素發(fā)酵過程霉素發(fā)酵過程 青霉素發(fā)酵時，青霉素生產(chǎn)菌在青霉素發(fā)酵時，青霉素生產(chǎn)菌在合適的培養(yǎng)基、合適的培養(yǎng)基、PHPH、溫度、溫度和通氣攪拌和通氣攪拌等發(fā)酵條件下進行生長并合成青霉素。等發(fā)酵條件下進行生長并合成青霉素。 發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前體和無機鹽等）必須先經(jīng)過體和無機鹽等）必須先經(jīng)過滅

10、菌滅菌，后接入種子。，后接入種子。 在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，在發(fā)酵過程中往往要加入罐壓，在發(fā)酵過程中往往要加入泡沫劑泡沫劑，假如酸堿控制發(fā)，假如酸堿控制發(fā)酵液的酵液的PHPH，還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨鹽等化合，還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補充物以補充碳源及氮源碳源及氮源，或補進其他料液和前體等以促進青，或補進其他料液和前體等以促進青霉素的生產(chǎn)。霉素的生產(chǎn)。青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、菌體生長、青霉素合成和菌體自溶青霉素合成和菌體自溶三個階段。三個階

11、段。菌體生長階段菌體生長階段：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應(yīng)，即開始發(fā)育、適的環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應(yīng)，即開始發(fā)育、生長和繁殖，直至達到菌體的臨界濃度。生長和繁殖，直至達到菌體的臨界濃度。 青霉素合成階段青霉素合成階段：這個階段主要合成青霉素，：這個階段主要合成青霉素，青霉素的生產(chǎn)速率達到最大，并一直維持到青青霉素的生產(chǎn)速率達到最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個階段，菌體重量有霉素合成能力衰退。在這個階段，菌體重量有所增加，但產(chǎn)生菌的呼吸強度一般無顯著變化。所增加，但產(chǎn)生菌的呼吸強度一般無顯著變化。菌體自溶階段菌體自溶階段：這個階段菌體

12、衰老，細胞開始：這個階段菌體衰老，細胞開始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率下降，氨基氮增加，下降，氨基氮增加，PHPH上升。上升。發(fā)酵培養(yǎng)控制發(fā)酵培養(yǎng)控制加糖控制。殘?zhí)墙抵良犹强刂?。殘?zhí)墙抵?.6%0.6%，pHpH上升時加糖上升時加糖補氮及加前體。補氮：硫酸銨、氨、尿素，使發(fā)補氮及加前體。補氮：硫酸銨、氨、尿素，使發(fā)酵液氨氮量控制在酵液氨氮量控制在0.01%0.05%0.01%0.05%。前體：發(fā)酵液中。前體：發(fā)酵液中殘存乙酰胺濃度為殘存乙酰胺濃度為0.05%0.08%0.05%0.08%。pHpH控制?？刂啤?.66.46.66.4溫度。前期

13、溫度。前期2525 2626 ，后期，后期2323 。溶解氧。不低于飽和溶解氧的溶解氧。不低于飽和溶解氧的30%30%。泡沫的控制。泡沫的控制。 基質(zhì)濃度：在分批發(fā)酵中，常常因為前期基質(zhì)濃度：在分批發(fā)酵中，常常因為前期基質(zhì)量濃度過高，后期基質(zhì)濃度低，對生基質(zhì)量濃度過高，后期基質(zhì)濃度低，對生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長產(chǎn)生抑物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長產(chǎn)生抑制。為了避免這一現(xiàn)象制。為了避免這一現(xiàn)象, ,在青霉素發(fā)酵中在青霉素發(fā)酵中通常采用通常采用補料分批操作法補料分批操作法, ,即對容易產(chǎn)生即對容易產(chǎn)生抑制和限制作用的基質(zhì)維持一定的最適濃抑制和限制作用的基質(zhì)維持一定的最適濃度。度。溫度：青霉

14、素發(fā)酵的最適溫度一般認為應(yīng)溫度：青霉素發(fā)酵的最適溫度一般認為應(yīng)在在25 25 C C 左右。溫度過高將明顯降低發(fā)左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率酵產(chǎn)率, ,同時增加葡萄糖的維持消耗同時增加葡萄糖的維持消耗, , 降降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。pHpH值：青霉素發(fā)酵的最適值：青霉素發(fā)酵的最適pH pH 值一般認為值一般認為在在6.56.5左右左右, , 應(yīng)盡量避免應(yīng)盡量避免 pH pH 值超過值超過7.07.0。因為青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定因為青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定, ,容易加容易加速其水解。速其水解。溶氧溶氧: :對于好氧的青霉素發(fā)酵來說對于好氧的青霉素發(fā)酵來說,

15、,溶氧溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個重要因素。濃度是影響發(fā)酵過程的一個重要因素。當溶氧濃度降到當溶氧濃度降到30%30%飽和度以下時飽和度以下時, ,青霉青霉素產(chǎn)率急劇下降素產(chǎn)率急劇下降, ,低于低于10%10%飽和度時飽和度時, ,則造則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高成不可逆的損害。溶氧濃度過高, ,說明菌說明菌絲生長不良或加糖率過低絲生長不良或加糖率過低, ,造成呼吸強度造成呼吸強度下降下降, ,同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。 菌絲濃度：發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不菌絲濃度：發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過超過臨界菌體濃度臨界菌體濃度, , 從而使氧傳遞速率與氧從而使氧傳遞

16、速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達到平衡。消耗速率在某一溶氧水平上達到平衡。菌絲生長速度：在葡萄糖限制生長的條件下，菌絲生長速度：在葡萄糖限制生長的條件下，當比生長速率低于當比生長速率低于0.015h-10.015h-1時，比生產(chǎn)速率時，比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比。因此與比生長速率成正比。因此, , 要在發(fā)酵過程要在發(fā)酵過程中達到并維持最大比生產(chǎn)速率中達到并維持最大比生產(chǎn)速率, ,必須使比生長必須使比生長速率速率不低不低0.015h-10.015h-1。菌絲形態(tài)：青霉素產(chǎn)生菌分化主要呈絲狀生菌絲形態(tài)：青霉素產(chǎn)生菌分化主要呈絲狀生長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。在絲狀菌發(fā)酵中長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。在絲狀

17、菌發(fā)酵中, , 控制菌絲形態(tài)使其保持適當?shù)姆种Ш烷L度控制菌絲形態(tài)使其保持適當?shù)姆种Ш烷L度, , 并避免結(jié)球并避免結(jié)球 , , 是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中而在球狀菌發(fā)酵中, , 使菌絲球保持適當大小使菌絲球保持適當大小和松緊和松緊, ,并盡量減少游離菌絲的含量并盡量減少游離菌絲的含量, , 也是充也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。 碳酸鈣：用來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的碳酸鈣：用來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雜酸，并控制發(fā)酵液的雜酸，并控制發(fā)酵液的pHpH值值。苯乙酸苯乙酸/ /苯乙酰胺：可以借?；D(zhuǎn)移的苯乙酰胺：可以借酰基轉(zhuǎn)移的作用，

18、將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，作用，將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提提高青霉素的生產(chǎn)強度高青霉素的生產(chǎn)強度。P P和和S S：為菌體提供營養(yǎng)的無機磷源一：為菌體提供營養(yǎng)的無機磷源一般采用般采用磷酸二氫鉀磷酸二氫鉀。另外加入硫代硫。另外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需的硫。需的硫。 另外，由于在發(fā)酵過程中二氧化碳的不斷產(chǎn)另外，由于在發(fā)酵過程中二氧化碳的不斷產(chǎn)生，加上培養(yǎng)基中有很多有機氮源含有蛋白生，加上培養(yǎng)基中有很多有機氮源含有蛋白質(zhì)，因此在發(fā)酵罐內(nèi)會產(chǎn)生大量泡沫，如不質(zhì)，因此在發(fā)酵罐內(nèi)會產(chǎn)生大量泡沫，如不嚴加控制，就會產(chǎn)生發(fā)酵液逃液，導致染菌嚴加控制，就會產(chǎn)生發(fā)酵液逃液，導致染菌的后果。采用的后果。采用植物油消沫植物油消沫