生物技術(shù)制藥第三章--基因工程制藥doc資料

1、生物技術(shù)制藥第三章-基因工程制藥 生物技術(shù)的核心是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的成就是用于新生物技術(shù)的核心是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的成就是用于新型生物藥物的研制。之前，許多在疾病診斷、治療和預(yù)防中有重要價(jià)值型生物藥物的研制。之前，許多在疾病診斷、治療和預(yù)防中有重要價(jià)值的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)（激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)多肽、調(diào)節(jié)蛋白、酶類的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)（激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)多肽、調(diào)節(jié)蛋白、酶類、凝血因子等）以及某些疫苗，由于、凝血因子等）以及某些疫苗，由于材料來(lái)源困難材料來(lái)源困難；提取技術(shù)提取技術(shù)問題問題；或；或因?yàn)橐驗(yàn)樵靸r(jià)太高造價(jià)太高使患者望而卻步；或使患者望而卻步；或由于由于免疫抗原免疫

2、抗原等緣故使傳統(tǒng)等緣故使傳統(tǒng)生物藥物的使用受到限制生物藥物的使用受到限制 而應(yīng)用基因工程技術(shù)就可以從根本上解決上述問題，它的應(yīng)用使人們而應(yīng)用基因工程技術(shù)就可以從根本上解決上述問題，它的應(yīng)用使人們?cè)诮鉀Q癌癥、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病等方面取得明顯效果，它為上述在解決癌癥、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病等方面取得明顯效果，它為上述疾病的預(yù)防、治療和診斷提供了新型疫苗、新型藥物和新型診斷試劑疾病的預(yù)防、治療和診斷提供了新型疫苗、新型藥物和新型診斷試劑 基因工程技術(shù)在醫(yī)藥行業(yè)中為預(yù)防、診斷、治療癌癥、病毒性疾病、基因工程技術(shù)在醫(yī)藥行業(yè)中為預(yù)防、診斷、治療癌癥、病毒性疾病、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病等疑難病方面提供了

3、新型疫苗、新型藥物和新型心血管疾病和內(nèi)分泌疾病等疑難病方面提供了新型疫苗、新型藥物和新型診斷試劑；利用基因工程生產(chǎn)的藥物主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽診斷試劑；利用基因工程生產(chǎn)的藥物主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽免疫性蛋白：免疫性蛋白：如各種抗原和單克隆抗體如各種抗原和單克隆抗體細(xì)胞因子：細(xì)胞因子：如干擾素、白介素、生長(zhǎng)因子如干擾素、白介素、生長(zhǎng)因子激素：激素：如胰島素、生長(zhǎng)激素如胰島素、生長(zhǎng)激素酶類：酶類：如尿激酶、鏈激酶、超氧化物歧化酶如尿激酶、鏈激酶、超氧化物歧化酶 一、基因工程藥物的類型一、基因工程藥物的類型二、利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)二、利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn) 1.1.可大量生產(chǎn)（

4、過去難以獲得的）生理活性蛋白和多肽，以?？纱罅可a(chǎn)（過去難以獲得的）生理活性蛋白和多肽，以保障臨床供應(yīng)障臨床供應(yīng)2.2.可提供足量的生理活性物質(zhì)，以便進(jìn)行深入研究，從而擴(kuò)大可提供足量的生理活性物質(zhì)，以便進(jìn)行深入研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍3.3.可以發(fā)現(xiàn)、挖掘出更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘出更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)4.4.可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)內(nèi)源生理活性物質(zhì)的不可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)內(nèi)源生理活性物質(zhì)的不足之處進(jìn)行改造和去除足之處進(jìn)行改造和去除5.5.可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源 我國(guó)基因工程藥物研究和

5、開發(fā)起步較晚，基礎(chǔ)較差，我國(guó)基因工程藥物研究和開發(fā)起步較晚，基礎(chǔ)較差，重點(diǎn)放在運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)手段開發(fā)化學(xué)合成法難以生產(chǎn)重點(diǎn)放在運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)手段開發(fā)化學(xué)合成法難以生產(chǎn)的醫(yī)藥產(chǎn)品，如的醫(yī)藥產(chǎn)品，如19971997年，我國(guó)自行研制開發(fā)的具有國(guó)際先年，我國(guó)自行研制開發(fā)的具有國(guó)際先進(jìn)水平的生物高科技產(chǎn)品進(jìn)水平的生物高科技產(chǎn)品1b1b性干擾素性干擾素三、國(guó)內(nèi)基因工程制藥現(xiàn)狀三、國(guó)內(nèi)基因工程制藥現(xiàn)狀第二節(jié)第二節(jié) 基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程 就是將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的就是將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新

6、組合，并使宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù) 通過基因工程技術(shù)，可以大規(guī)模生產(chǎn)很多從自然界很難通過基因工程技術(shù)，可以大規(guī)模生產(chǎn)很多從自然界很難或不能獲得的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)。如以或不能獲得的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)。如以E.ColiE.Coli為宿主，表為宿主，表達(dá)病毒抗原基因，獲得病毒抗原，再通過一定手段除去抗原達(dá)病毒抗原基因，獲得病毒抗原，再通過一定手段除去抗原的反應(yīng)性，而保留抗原原性，就得到了病毒疫苗的反應(yīng)性，而保留抗原原性，就得到了病毒疫苗 一、基因工程技術(shù)的概念一、基因工程技術(shù)的概念二、基因工程藥

7、物生產(chǎn)的主要程序二、基因工程藥物生產(chǎn)的主要程序目的基因的分離與克?。康幕騺?lái)源于人體或病原體）目的基因的分離與克隆（目的基因來(lái)源于人體或病原體）構(gòu)建構(gòu)建DNADNA重組體（通常將目的基因與質(zhì)粒重組體（通常將目的基因與質(zhì)粒DNADNA整合，組建重組質(zhì)粒）整合，組建重組質(zhì)粒）將將DNADNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌工程菌的發(fā)酵（在工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，目的基因同時(shí)表達(dá)）工程菌的發(fā)酵（在工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，目的基因同時(shí)表達(dá)）外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（用生物技術(shù)及化學(xué)、化學(xué)方法）外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（用生物技術(shù)及化學(xué)、化學(xué)方法）成品的檢驗(yàn)成品的檢驗(yàn) 及包裝等

8、及包裝等附：制備基因工程藥物的一般程序附：制備基因工程藥物的一般程序 目的基因目的基因 組建重組質(zhì)粒組建重組質(zhì)粒 構(gòu)建基因工程菌構(gòu)建基因工程菌 培養(yǎng)工程菌培養(yǎng)工程菌 除菌過濾除菌過濾 產(chǎn)物分離純化產(chǎn)物分離純化 半成品檢定半成品檢定 成品檢定成品檢定 包裝包裝u表達(dá)系統(tǒng)：原核生物系統(tǒng)和真核生物系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)：原核生物系統(tǒng)和真核生物系統(tǒng)。u選擇表達(dá)系統(tǒng)主要考慮：選擇表達(dá)系統(tǒng)主要考慮：保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能 其次是表達(dá)量的多少和分離純化的難易其次是表達(dá)量的多少和分離純化的難易說(shuō)說(shuō) 明明u上游階段：上游階段：在實(shí)驗(yàn)室完成，獲得目的基因后，用限制性內(nèi)切在實(shí)驗(yàn)室完成，獲得目的基因后，

9、用限制性內(nèi)切酶和連接酶將目的基因插入載體，并轉(zhuǎn)入宿主菌酶和連接酶將目的基因插入載體，并轉(zhuǎn)入宿主菌u下游階段：下游階段：將實(shí)驗(yàn)室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，為獲得高質(zhì)量、將實(shí)驗(yàn)室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，為獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量的表達(dá)產(chǎn)物，需對(duì)影響表達(dá)及分離純化的因素進(jìn)行分析高產(chǎn)量的表達(dá)產(chǎn)物，需對(duì)影響表達(dá)及分離純化的因素進(jìn)行分析（如新型生物反應(yīng)器、高效分離介質(zhì)及裝置、分離純化的優(yōu)化（如新型生物反應(yīng)器、高效分離介質(zhì)及裝置、分離純化的優(yōu)化控制、高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)等）控制、高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)等）第三節(jié)第三節(jié) 目的基因的獲得目的基因的獲得 對(duì)于原核生物，其基因總量不大，可以選用合適的限制性對(duì)于原核生物，其基因總量不大

10、，可以選用合適的限制性核酸內(nèi)切酶切下目的基因，而核酸內(nèi)切酶切下目的基因，而真核生物的目的基因不能進(jìn)行直真核生物的目的基因不能進(jìn)行直接分離接分離 真核細(xì)胞中基因總量較大，單拷貝目的基因只是染色體真核細(xì)胞中基因總量較大，單拷貝目的基因只是染色體DNADNA中很小的一部分，直接分離純化極為困難；中很小的一部分，直接分離純化極為困難；另外，另外，真核真核基因一般都有內(nèi)含子，若以原核細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，即使分離基因一般都有內(nèi)含子，若以原核細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，即使分離出真核基因，由于原核細(xì)胞缺乏出真核基因，由于原核細(xì)胞缺乏mRNAmRNA轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)，真核轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)，真核基因轉(zhuǎn)錄的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA

11、mRNA也不能被加工、拼接成為成熟的也不能被加工、拼接成為成熟的mRNA mRNA ，因此，因此不能直接克隆真核基因。不能直接克隆真核基因。 克隆真核基因常用的方法有克隆真核基因常用的方法有逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法和和化學(xué)合成法化學(xué)合成法 一、逆轉(zhuǎn)錄法一、逆轉(zhuǎn)錄法 逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNAmRNA，再反轉(zhuǎn)錄，再反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)成互補(bǔ)DNADNA，然后進(jìn)行互補(bǔ)，然后進(jìn)行互補(bǔ)DNADNA的克隆表達(dá)。從產(chǎn)生該蛋白的克隆表達(dá)。從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNAmRNA，以其為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作，以其為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白

12、質(zhì)用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNAmRNA的互補(bǔ)的互補(bǔ)DNADNA，再以互補(bǔ)，再以互補(bǔ)DNADNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶或?yàn)槟０?，在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNADNA聚合酶作用下，最終合成編碼聚合酶作用下，最終合成編碼該蛋白質(zhì)的雙鏈該蛋白質(zhì)的雙鏈DNADNA序列，該序列序列，該序列不含內(nèi)含子不含內(nèi)含子 細(xì)胞內(nèi)含有三種細(xì)胞內(nèi)含有三種RNARNA，mRNAmRNA占占RNARNA總量的總量的2%-5%2%-5%，相對(duì)分，相對(duì)分子量大小不一致，分離也有很大的困難，但是子量大小不一致，分離也有很大的困難，但是mRNAmRNA的的33末末端常含有一多聚腺苷酸端常含有一多聚腺苷酸(polyA)(polyA)組成的末端，長(zhǎng)

13、達(dá)組成的末端，長(zhǎng)達(dá)20-25020-250個(gè)個(gè)腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸- -纖維素上，從而可以用纖維素上，從而可以用親親和層析法和層析法將將mRNAmRNA從細(xì)胞總從細(xì)胞總RNARNA上分離出來(lái)，可得到純度較高上分離出來(lái)，可得到純度較高的的mRNAmRNA1.mRNA1.mRNA的純化的純化 mRNAmRNA的的33末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脫末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脫氧胸苷酸為引物，在氧胸苷酸為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始互補(bǔ)下，開始互補(bǔ)DNADNA的合的合成。在合成反應(yīng)體系中加入一種放射性標(biāo)記的成。在合成反應(yīng)體系中加入一

14、種放射性標(biāo)記的dNTPdNTP，在反，在反應(yīng)中以及反應(yīng)后可通過測(cè)定放射性標(biāo)記的應(yīng)中以及反應(yīng)后可通過測(cè)定放射性標(biāo)記的dNTPdNTP摻入量，計(jì)摻入量，計(jì)算出互補(bǔ)算出互補(bǔ)DNADNA的合成效率，在凝膠電泳后，進(jìn)行放射自顯影的合成效率，在凝膠電泳后，進(jìn)行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小，探索最佳反應(yīng)條件分析產(chǎn)物的分子大小，探索最佳反應(yīng)條件2.2.互補(bǔ)互補(bǔ)DNADNA第一鏈的合成第一鏈的合成 先用堿解或核酸酶酶解先用堿解或核酸酶酶解(RNaseH (RNaseH 酶活性酶活性) )的方法除去的方法除去互補(bǔ)互補(bǔ)DNA-mRNADNA-mRNA雜交鏈中的雜交鏈中的mRNAmRNA鏈，然后以互補(bǔ)鏈，然后以互補(bǔ)D

15、NADNA第一鏈第一鏈為模板合成第二鏈，并用核酸酶為模板合成第二鏈，并用核酸酶S1S1專一性切除單鏈專一性切除單鏈DNADNA 3.3.互補(bǔ)互補(bǔ)DNADNA第二條鏈的合成第二條鏈的合成 載體有兩種質(zhì)粒和噬菌體，根據(jù)重組后插入的互補(bǔ)載體有兩種質(zhì)粒和噬菌體，根據(jù)重組后插入的互補(bǔ)DNADNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯 合成蛋白質(zhì)，又將載體合成蛋白質(zhì)，又將載體分為表達(dá)型載體和非表達(dá)型載體?；パa(bǔ)分為表達(dá)型載體和非表達(dá)型載體。互補(bǔ)DNADNA插入片段小于插入片段小于1010千堿基對(duì)，可選用質(zhì)粒載體，如大于千堿基對(duì)，可選用質(zhì)粒載體，如大于1010千堿基對(duì)則選用噬菌千堿基對(duì)則

16、選用噬菌體作為載體體作為載體 4.4.互補(bǔ)互補(bǔ)DNADNA克隆克?。? 1）載體的分類）載體的分類用于用于cDNAcDNA克隆的載體克隆的載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA，如，如 PUCPUC、PBR322PBR322等等噬菌體噬菌體DNADNA，如，如 gt 10gt 10、 gt 11gt 11等等（2 2）載體的特點(diǎn)）載體的特點(diǎn) PUC PUC和和gt 11gt 11屬于表達(dá)型載體，而屬于表達(dá)型載體，而PBR322PBR322和和gt 10gt 10屬于非表達(dá)型載體屬于非表達(dá)型載體表達(dá)型載體：表達(dá)型載體：在在cDNAcDNA插入位置的上游具有啟動(dòng)子序列，重組后插入的插入位置的上游具有啟動(dòng)子序列，

17、重組后插入的cDNAcDNA能夠表達(dá)，并經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成相應(yīng)蛋白質(zhì)的載體能夠表達(dá)，并經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成相應(yīng)蛋白質(zhì)的載體非表達(dá)型載體：非表達(dá)型載體：在在cDNAcDNA插入位置的上游無(wú)啟動(dòng)子序列，重組后插入的插入位置的上游無(wú)啟動(dòng)子序列，重組后插入的cDNAcDNA不能表達(dá)，不能經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成相應(yīng)蛋白質(zhì)的載體不能表達(dá)，不能經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成相應(yīng)蛋白質(zhì)的載體質(zhì)粒載體容量?。ㄖ荒懿迦胄∮谫|(zhì)粒載體容量?。ㄖ荒懿迦胄∮?0kb10kb的的cDNAcDNA 片段）；而要插入大于片段）；而要插入大于10kb10kb的外源的外源cDNAcDNA 片段時(shí)，只能選用噬菌體作為載體片段時(shí)，只能選用噬菌體作為載體（噬菌體

18、作為載體，克隆效率噬菌體作為載體，克隆效率高，容量大高，容量大）（3 3）cDNAcDNA與載體的連接與載體的連接加同聚尾連接法加同聚尾連接法在在3-3-末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將載體和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將載體和cDNAcDNA的的3-3-端加上互補(bǔ)端加上互補(bǔ)的同型多聚體序列（的同型多聚體序列（A-TA-T、G-CG-C），借助同型多聚體的退火作用形成重組分子），借助同型多聚體的退火作用形成重組分子在在T T4 4DNADNA連接酶作用下，封口環(huán)化連接酶作用下，封口環(huán)化加人工接頭連接法加人工接頭連接法 在在T T4 4DNADNA連接酶作用下，人為地在目的基因兩端接上人工接頭

19、，使連接酶作用下，人為地在目的基因兩端接上人工接頭，使DNADNA發(fā)生發(fā)生連接的方法連接的方法u人工接頭：人工接頭：由人工合成的、連接在目的基因兩端的含有某些限制酶切點(diǎn)的由人工合成的、連接在目的基因兩端的含有某些限制酶切點(diǎn)的寡聚核苷酸片段。它能使目的基因產(chǎn)生粘性末端，從而與載體連接寡聚核苷酸片段。它能使目的基因產(chǎn)生粘性末端，從而與載體連接5.將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 此過程是一個(gè)非同源此過程是一個(gè)非同源DNADNA重組的過程；即讓質(zhì)?；蚴删亟M的過程；即讓質(zhì)粒或噬菌體轉(zhuǎn)化或感染感受態(tài)的大腸桿菌，從而將重組體引入宿主體轉(zhuǎn)化或感染感受態(tài)的大腸桿菌，從而將重組體引入宿主（E.Coli

20、E.Coli）細(xì)胞內(nèi)）細(xì)胞內(nèi)6.cDNA6.cDNA文庫(kù)的鑒定文庫(kù)的鑒定根據(jù)重組體表型進(jìn)行初步篩選根據(jù)重組體表型進(jìn)行初步篩選然后采用凝膠電泳、分子雜交、然后采用凝膠電泳、分子雜交、DNADNA序列分析等方法進(jìn)一步篩選和鑒定序列分析等方法進(jìn)一步篩選和鑒定抗性基因失活法抗性基因失活法菌落或噬菌體顏色改變法菌落或噬菌體顏色改變法7.7.目的目的cDNAcDNA克隆的分離純化克隆的分離純化核酸探針雜交法核酸探針雜交法 用層析和電泳技術(shù)純化目的蛋白，根據(jù)目的蛋白的氨基酸序列分析用層析和電泳技術(shù)純化目的蛋白，根據(jù)目的蛋白的氨基酸序列分析結(jié)果人工合成相應(yīng)的單鏈寡聚核苷酸序列作為探針；然后從結(jié)果人工合成相應(yīng)的

21、單鏈寡聚核苷酸序列作為探針；然后從cDNAcDNA文庫(kù)中文庫(kù)中分離出特異分離出特異cDNAcDNA克隆克隆免疫反應(yīng)鑒定法免疫反應(yīng)鑒定法 在無(wú)目的基因表型特征和核酸探針的情況下，本法是篩選特異在無(wú)目的基因表型特征和核酸探針的情況下，本法是篩選特異cDNAcDNA克隆的重要途徑，即用目的蛋白的抗體尋找相應(yīng)的特異克隆的重要途徑，即用目的蛋白的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNAcDNA克隆克隆二、化學(xué)合成法二、化學(xué)合成法 1.1.適用條件：適用條件：只能合成較小蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因只能合成較小蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因 目的基因的核苷酸序列必須清楚；或目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列清目的基因的核苷酸序列必須清楚；或目的

22、蛋白質(zhì)的氨基酸序列清 楚，然后按相應(yīng)的密碼子反推楚，然后按相應(yīng)的密碼子反推DNADNA堿基序列堿基序列2.2.過程：過程：用化學(xué)方法合成目的基因不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火用化學(xué)方法合成目的基因不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火 成為兩端形成粘末端的成為兩端形成粘末端的DNADNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次 序進(jìn)行退火使連接成較長(zhǎng)的序進(jìn)行退火使連接成較長(zhǎng)的DNADNA片段，再用連接酶連接成完整的基因片段，再用連接酶連接成完整的基因3.3. 局限性：局限性：1.1.不能合成太長(zhǎng)的基因，不能合成太長(zhǎng)的基因，50-6050-60個(gè)堿

23、基對(duì)個(gè)堿基對(duì) 2. 2.人工合成堿基對(duì)時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性為選擇密碼子帶來(lái)很大的困難人工合成堿基對(duì)時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性為選擇密碼子帶來(lái)很大的困難 3.3.費(fèi)用較高費(fèi)用較高 第四節(jié)第四節(jié) 基基 因因 表表 達(dá)達(dá) 是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程用基因工程制備藥物，必須使目的基因進(jìn)行高效表達(dá)用基因工程制備藥物，必須使目的基因進(jìn)行高效表達(dá) 一、基因表達(dá)一、基因表達(dá)目的產(chǎn)物產(chǎn)量高目的產(chǎn)物產(chǎn)量高目的產(chǎn)物質(zhì)量高目的產(chǎn)物質(zhì)量高表達(dá)產(chǎn)量表達(dá)產(chǎn)量分離純化分離純化產(chǎn)物的穩(wěn)定性產(chǎn)物的穩(wěn)定性產(chǎn)物的生物學(xué)活性產(chǎn)物的生物學(xué)活性高效表達(dá)高效表達(dá)二、宿主細(xì)胞

24、的選擇二、宿主細(xì)胞的選擇 （一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足以下要求（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足以下要求 1. 1.容易獲得較高濃度的細(xì)胞容易獲得較高濃度的細(xì)胞 2. 2.能利用廉價(jià)易得的原料培養(yǎng)能利用廉價(jià)易得的原料培養(yǎng) 3. 3.不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素 4. 4.發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài) 5. 5.容易進(jìn)行代謝調(diào)控容易進(jìn)行代謝調(diào)控 6. 6.容易進(jìn)行容易進(jìn)行DNADNA重組技術(shù)操作重組技術(shù)操作 7. 7.產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取 （二）宿主細(xì)胞的分類（二）宿主細(xì)胞的分類 1.1.原核細(xì)胞：原核細(xì)胞

25、：如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌2.2.真核細(xì)胞：真核細(xì)胞：如酵母菌、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞如酵母菌、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞 （1）大腸桿菌）大腸桿菌 生長(zhǎng)迅速、對(duì)其遺傳學(xué)背景研究比較深入、透徹，所以是目前基因工程研究生長(zhǎng)迅速、對(duì)其遺傳學(xué)背景研究比較深入、透徹，所以是目前基因工程研究中最常用的原核表達(dá)體系中最常用的原核表達(dá)體系特點(diǎn)：特點(diǎn)：產(chǎn)物多為胞內(nèi)產(chǎn)物（因?yàn)榇竽c桿菌的表達(dá)產(chǎn)物不存在產(chǎn)物多為胞內(nèi)產(chǎn)物（因?yàn)榇竽c桿菌的表達(dá)產(chǎn)物不存在信號(hào)肽信號(hào)肽） 真核蛋白質(zhì)常以不溶性真核蛋白質(zhì)常以不溶性包含體包含體的形式存在（故下游處理過程必須經(jīng)過復(fù)的形式存在（故下游處理過程必須

26、經(jīng)過復(fù) 雜的變性和復(fù)性等工藝才能恢復(fù)其生理活性）雜的變性和復(fù)性等工藝才能恢復(fù)其生理活性） 蛋白質(zhì)產(chǎn)物不能糖基化（因?yàn)榇竽c桿菌的表達(dá)不存在翻譯后修飾作用）蛋白質(zhì)產(chǎn)物不能糖基化（因?yàn)榇竽c桿菌的表達(dá)不存在翻譯后修飾作用） 目的蛋白的目的蛋白的N-端常帶有一個(gè)多余的端常帶有一個(gè)多余的Met殘基，易引起免疫反應(yīng)殘基，易引起免疫反應(yīng) 有時(shí)會(huì)產(chǎn)生很難除去的內(nèi)毒素（陰性桿菌的細(xì)胞壁成分）有時(shí)會(huì)產(chǎn)生很難除去的內(nèi)毒素（陰性桿菌的細(xì)胞壁成分） 有時(shí)會(huì)產(chǎn)生蛋白酶破壞目的蛋白有時(shí)會(huì)產(chǎn)生蛋白酶破壞目的蛋白1.1.原核細(xì)胞原核細(xì)胞（2 2）枯草芽孢桿菌）枯草芽孢桿菌 特點(diǎn)：特點(diǎn)：分泌能力強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中

27、分泌能力強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中 不形成包含體不形成包含體 不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化 有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行降解有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行降解 鏈霉菌作為外源基因的表達(dá)體系，目前正逐步受到人們的鏈霉菌作為外源基因的表達(dá)體系，目前正逐步受到人們的重視重視主要特點(diǎn)：主要特點(diǎn)：不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、可將表達(dá)產(chǎn)物直不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、可將表達(dá)產(chǎn)物直 接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力 （3 3）鏈霉菌）鏈霉菌2.2.真核細(xì)胞真核細(xì)胞 （1 1）酵母）酵母 是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核微生物是研究基因

28、表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核微生物特點(diǎn)特點(diǎn) 繁殖迅速繁殖迅速 基因工程操作簡(jiǎn)單（可以廉價(jià)地大規(guī)模培養(yǎng)，沒有毒性）基因工程操作簡(jiǎn)單（可以廉價(jià)地大規(guī)模培養(yǎng)，沒有毒性） 能將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到胞外能將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到胞外 表達(dá)產(chǎn)物能糖基化表達(dá)產(chǎn)物能糖基化 特點(diǎn)特點(diǎn) 有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌功能有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌功能 能正確進(jìn)行翻譯后加工（包括肽剪切和糖基化等）能正確進(jìn)行翻譯后加工（包括肽剪切和糖基化等） 糖基化方式與高等真核生物相似糖基化方式與高等真核生物相似 為無(wú)毒安全菌株為無(wú)毒安全菌株 如：胰島素原在分泌貯備小泡中向細(xì)胞外運(yùn)送時(shí)，其中的如：胰島素原在分泌貯備小泡中向細(xì)胞外運(yùn)送時(shí)，其中的C-C-肽被切肽

29、被切除后才變成具有活性的胰島素除后才變成具有活性的胰島素（2 2）絲狀真菌（如霉菌）絲狀真菌（如霉菌）（3 3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞）哺乳動(dòng)物細(xì)胞 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 產(chǎn)物可分泌到胞外，細(xì)胞培養(yǎng)液成分完全可控制，使產(chǎn)物純化較容易產(chǎn)物可分泌到胞外，細(xì)胞培養(yǎng)液成分完全可控制，使產(chǎn)物純化較容易 表達(dá)產(chǎn)物能糖基化，接近或類似與天然產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)物能糖基化，接近或類似與天然產(chǎn)物 動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度較稀動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度較稀 綜上所述，目前使用最廣泛的宿主仍然是大腸桿菌和釀酒酵母。因?yàn)閷?duì)綜上所述，目前使用最廣泛的宿主仍然是大腸桿菌和釀酒酵母。因

30、為對(duì)它們的遺傳背景研究得比較清楚，建立了許多適合于它們的克隆載體和它們的遺傳背景研究得比較清楚，建立了許多適合于它們的克隆載體和DNADNA導(dǎo)導(dǎo)入方式，并且許多外源基因在這兩種宿主菌中得到表達(dá)成功入方式，并且許多外源基因在這兩種宿主菌中得到表達(dá)成功 三、不同宿主菌中的基因表達(dá)三、不同宿主菌中的基因表達(dá) （一）大腸桿菌中的基因表達(dá)（一）大腸桿菌中的基因表達(dá) 1.1.載體載體根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)，根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)，表達(dá)載體應(yīng)具備下列條件：表達(dá)載體應(yīng)具備下列條件：載體能夠獨(dú)立復(fù)制載體能夠獨(dú)立復(fù)制，有復(fù)制起點(diǎn)，有嚴(yán)緊型和松弛型，有復(fù)制起點(diǎn)，有嚴(yán)緊型和松弛型嚴(yán)緊型載體：嚴(yán)

31、緊型載體：伴隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制，在宿主細(xì)胞中拷貝少（伴隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制，在宿主細(xì)胞中拷貝少（1-31-3）松弛型載體：松弛型載體：其復(fù)制可不依賴于宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中拷貝多達(dá)其復(fù)制可不依賴于宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中拷貝多達(dá)30003000個(gè)個(gè)應(yīng)有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記應(yīng)有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，利于外源基因的克隆、鑒定和篩選應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的，能為大腸桿菌的RNARNA聚合酶所識(shí)別聚合酶所識(shí)別應(yīng)具有阻遏子應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行

32、轉(zhuǎn)錄應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使，以便使RNARNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無(wú)關(guān)的基因，同時(shí)很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的錄其他無(wú)關(guān)的基因，同時(shí)很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNAmRNA較為穩(wěn)定較為穩(wěn)定所產(chǎn)生的所產(chǎn)生的mRNAmRNA必須具有翻譯起始信號(hào)必須具有翻譯起始信號(hào) 2.2.影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素 外源基因在宿主中的表達(dá)受許多因素影響的，所以在建立表達(dá)體系外源基因在宿主中的表達(dá)受許多因素影響的，所以在建立表達(dá)體系時(shí)要綜合考慮各種因素的作用，建立一個(gè)合適的表達(dá)體系，從而使外源時(shí)要綜

33、合考慮各種因素的作用，建立一個(gè)合適的表達(dá)體系，從而使外源基因得到最大的表達(dá)量，獲得最多的表達(dá)產(chǎn)物基因得到最大的表達(dá)量，獲得最多的表達(dá)產(chǎn)物（1 1）外源基因的拷貝數(shù)）外源基因的拷貝數(shù) 外源基因是克隆到載體上的，所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因是克隆到載體上的，所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因的表達(dá)相關(guān)，應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上，這對(duì)外源基因的表達(dá)相關(guān)，應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上，這對(duì)于提高外源基因的總體表達(dá)水平非常有利于提高外源基因的總體表達(dá)水平非常有利（2 2）外源基因的表達(dá)效率）外源基因的表達(dá)效率 啟動(dòng)子的強(qiáng)弱啟動(dòng)子的強(qiáng)弱在轉(zhuǎn)錄水平上直接影響基因的表達(dá)、

34、在轉(zhuǎn)錄水平上直接影響基因的表達(dá)、核糖體結(jié)合位核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性點(diǎn)的有效性、SDSD序列和起始序列和起始ATGATG的間距的間距、密碼子的組成密碼子的組成等都會(huì)不同程度等都會(huì)不同程度地影響外源基因的表達(dá)地影響外源基因的表達(dá) 基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄，要實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，首基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄，要實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，首先必須保證外源先必須保證外源DNADNA向向mRNAmRNA的高效轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)錄的順利進(jìn)行，必須依靠的高效轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)錄的順利進(jìn)行，必須依靠強(qiáng)強(qiáng)有效的啟動(dòng)子有效的啟動(dòng)子，因此在載體的目的基因上游必須連有一個(gè)適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，因此在載體的目的基因上游必須連有一個(gè)適當(dāng)?shù)?/p>

35、啟動(dòng)子；另外，真核基因的啟動(dòng)子不能被大腸桿菌的；另外，真核基因的啟動(dòng)子不能被大腸桿菌的RNA-polRNA-pol識(shí)別，故將真核基識(shí)別，故將真核基因的編碼區(qū)置于大腸桿菌因的編碼區(qū)置于大腸桿菌RNA-polRNA-pol能識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子（如能識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子（如 laclac、trptrp等）等）控制下，并將其控制下，并將其插入表達(dá)載體啟動(dòng)子的下游插入表達(dá)載體啟動(dòng)子的下游，以增加表達(dá)的機(jī)會(huì)，以增加表達(dá)的機(jī)會(huì)啟動(dòng)子的強(qiáng)弱啟動(dòng)子的強(qiáng)弱核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性 核糖體結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)真核基因在細(xì)菌中的高效表達(dá)十分核糖體結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)真核基因在細(xì)菌中的高效表達(dá)十分重要；必須通過消除空間位阻等

36、的影響增加其有效性重要；必須通過消除空間位阻等的影響增加其有效性SDSD序列和起始序列和起始ATGATG的間距的間距 SDSD序列與起始密碼間的間距對(duì)非融合蛋白的合成水平有序列與起始密碼間的間距對(duì)非融合蛋白的合成水平有很大影響；距離過長(zhǎng)或過短都不利于真核基因的表達(dá)（一很大影響；距離過長(zhǎng)或過短都不利于真核基因的表達(dá)（一般距離般距離1010 35bp35bp較合適）較合適）密碼子的組成密碼子的組成 tRNAtRNA對(duì)密碼子的對(duì)密碼子的“偏愛性偏愛性”也是影響翻譯效率的因素之一。也是影響翻譯效率的因素之一。真核基因與原核基因在編碼同一氨基酸時(shí)所偏愛使用的密碼子真核基因與原核基因在編碼同一氨基酸時(shí)所偏

37、愛使用的密碼子不盡相同，為了實(shí)現(xiàn)真核基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，在設(shè)不盡相同，為了實(shí)現(xiàn)真核基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，在設(shè)計(jì)引物和合成基因時(shí)，應(yīng)選擇使用大腸桿菌計(jì)引物和合成基因時(shí)，應(yīng)選擇使用大腸桿菌“偏愛偏愛”的密碼子的密碼子（3 3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 當(dāng)外源基因大量表達(dá)時(shí)，由于應(yīng)急反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)迅速分泌大量降解當(dāng)外源基因大量表達(dá)時(shí)，由于應(yīng)急反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)迅速分泌大量降解該蛋白質(zhì)的酶，所以即使原始表達(dá)量很高，實(shí)際產(chǎn)量也不一定高，那就得該蛋白質(zhì)的酶，所以即使原始表達(dá)量很高，實(shí)際產(chǎn)量也不一定高，那就得看被酶降解的程度。為了提高產(chǎn)量，必須提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。具體措看被酶降解的程度

38、。為了提高產(chǎn)量，必須提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。具體措施如下：施如下：組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白利用大腸桿菌的信號(hào)肽或某些真核多肽中自身的信號(hào)肽，把真核基因產(chǎn)利用大腸桿菌的信號(hào)肽或某些真核多肽中自身的信號(hào)肽，把真核基因產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解物運(yùn)輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解采用位點(diǎn)特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋采用位點(diǎn)特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性白質(zhì)的穩(wěn)定性選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞 （4 4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷）細(xì)胞的代謝負(fù)荷

39、外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的大量表達(dá)，必然會(huì)影響宿主細(xì)胞正常的生長(zhǎng)外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的大量表達(dá)，必然會(huì)影響宿主細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝，有些產(chǎn)物對(duì)宿主還會(huì)有毒害作用，將細(xì)胞殺死，為了減輕宿主細(xì)胞的代謝，有些產(chǎn)物對(duì)宿主還會(huì)有毒害作用，將細(xì)胞殺死，為了減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，同時(shí)還得提高外源基因的表達(dá)水平，可采用代謝負(fù)荷，同時(shí)還得提高外源基因的表達(dá)水平，可采用兩步培養(yǎng)法兩步培養(yǎng)法 方法一方法一 將細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，當(dāng)宿主細(xì)胞的生將細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，當(dāng)宿主細(xì)胞的生物量達(dá)到飽和時(shí)，再進(jìn)行基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)合成，以減低宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷物量達(dá)到飽和時(shí)，再進(jìn)行基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)合

40、成，以減低宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 方法二方法二 將宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開，當(dāng)宿主細(xì)胞迅速生長(zhǎng)將宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開，當(dāng)宿主細(xì)胞迅速生長(zhǎng)時(shí)，抑制重組質(zhì)粒的復(fù)制，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)量累積到一定水平后，再誘導(dǎo)細(xì)胞中時(shí)，抑制重組質(zhì)粒的復(fù)制，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)量累積到一定水平后，再誘導(dǎo)細(xì)胞中重組質(zhì)粒的復(fù)制，增加質(zhì)?？截悢?shù)重組質(zhì)粒的復(fù)制，增加質(zhì)粒拷貝數(shù) （5 5）工程菌的培養(yǎng)條件）工程菌的培養(yǎng)條件 優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達(dá)優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達(dá) （1）融合蛋白）融合蛋白（2）非融合蛋白）非融合蛋白（3）分泌型）分泌型 3.3.真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式

41、（1 1）融合蛋白）融合蛋白 概念：概念：是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起所形成的蛋白質(zhì)；其氨是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起所形成的蛋白質(zhì)；其氨基基 端是原核序列，羧基端是真核序列端是原核序列，羧基端是真核序列優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：基因操作簡(jiǎn)便基因操作簡(jiǎn)便 蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定 蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)穩(wěn)定性好，不易被細(xì)菌酶類所降解蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)穩(wěn)定性好，不易被細(xì)菌酶類所降解 容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：不能作抗原使用（因?yàn)樵硕嚯男蛄锌赡軙?huì)影響真核蛋白的免疫原不能作抗原使用（因?yàn)樵硕嚯男蛄锌赡軙?huì)影響真核蛋白的免疫原 性；目的蛋白需要回收性；目的蛋白需要

42、回收 融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲 目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段 ） （2 2）非融合蛋白）非融合蛋白 表達(dá)非融合蛋白的操縱子必須改建成表達(dá)非融合蛋白的操縱子必須改建成 細(xì)菌或噬菌體的啟動(dòng)子細(xì)菌或噬菌體的啟動(dòng)子細(xì)菌的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（細(xì)菌的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SDSD序列）序列）真核基真核基因的起始密碼子因的起始密碼子結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因終止密碼終止密碼（要求核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列與翻譯（要求核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列與翻譯起始密碼之間的距離要合適，稍有不適就會(huì)影響表達(dá)效率）起始密碼之間的距離要合

43、適，稍有不適就會(huì)影響表達(dá)效率）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：能夠較好地保持原來(lái)的蛋白活性；能夠較好地保持原來(lái)的蛋白活性；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：容易被蛋白酶破壞容易被蛋白酶破壞 N-N-末端常常帶有甲硫氨酸，在人體內(nèi)用藥時(shí)可能會(huì)引起免疫反應(yīng)末端常常帶有甲硫氨酸，在人體內(nèi)用藥時(shí)可能會(huì)引起免疫反應(yīng) 將外源基因連接到信號(hào)肽的下游，利用大腸桿菌的信號(hào)肽，構(gòu)建成分泌將外源基因連接到信號(hào)肽的下游，利用大腸桿菌的信號(hào)肽，構(gòu)建成分泌型表達(dá)質(zhì)粒；當(dāng)其在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物（目的蛋白）型表達(dá)質(zhì)粒；當(dāng)其在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物（目的蛋白）在信號(hào)肽的幫助下，以生物活性形式被分泌到細(xì)胞外在信號(hào)肽的幫助下，以生物活性形式

44、被分泌到細(xì)胞外特點(diǎn)：特點(diǎn)：提高了易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解的表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定提高了易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解的表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)無(wú)活性的蛋白質(zhì)，分泌表達(dá)時(shí)能按一定的方式在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)無(wú)活性的蛋白質(zhì)，分泌表達(dá)時(shí)能按一定的方式 折折 疊，形成具有活性的蛋白質(zhì)疊，形成具有活性的蛋白質(zhì) 分泌后的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不含起始密碼所編碼的分泌后的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不含起始密碼所編碼的MetMet（因?yàn)椋ㄒ驗(yàn)镸etMet隨著信隨著信 號(hào)肽被信號(hào)肽酶切割掉了）號(hào)肽被信號(hào)肽酶切割掉了） （3 3）分泌型蛋白）分泌型蛋白（二）酵母中的基因表達(dá)（二）酵母中的基因表達(dá) 1.1.酵母載體酵母載體（1 1）概念：）概念：是可以攜帶外源基因在

45、酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分是可以攜帶外源基因在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分 裂傳遞到子代細(xì)胞的裂傳遞到子代細(xì)胞的DNADNA或或RNARNA單位單位（2 2）酵母載體分類：）酵母載體分類：普通表達(dá)載體普通表達(dá)載體和和精確表達(dá)載體精確表達(dá)載體 普通表達(dá)載體普通表達(dá)載體只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物 的組成，特別是對(duì)其的組成，特別是對(duì)其N-N-末端氨基酸是否有增減并無(wú)嚴(yán)格要求末端氨基酸是否有增減并無(wú)嚴(yán)格要求 精確表達(dá)載體精確表達(dá)載體要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切 酶位點(diǎn)，以

46、利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后N-N-末端氨基酸末端氨基酸 序列與天然產(chǎn)物相同，既無(wú)多余的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無(wú)多余的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸 由于從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母由于從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最后階段質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最后階段再轉(zhuǎn)入酵母中再轉(zhuǎn)入酵母中 （3 3）克隆載體）克隆載體（二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素（二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素 1.1.外源基因的

47、拷貝數(shù)外源基因的拷貝數(shù) 拷貝數(shù)要適當(dāng)。拷貝數(shù)要適當(dāng)。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達(dá)，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達(dá)，但會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)量的降低；單拷貝的質(zhì)粒載體對(duì)細(xì)胞的最大生長(zhǎng)但會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)量的降低；單拷貝的質(zhì)粒載體對(duì)細(xì)胞的最大生長(zhǎng)沒有影響，但表達(dá)的效率不高，必須調(diào)節(jié)好這兩方面的關(guān)系沒有影響，但表達(dá)的效率不高，必須調(diào)節(jié)好這兩方面的關(guān)系 外源基因在酵母中表達(dá)效率外源基因在酵母中表達(dá)效率與與啟動(dòng)子啟動(dòng)子、分泌信號(hào)分泌信號(hào)、終止序列終止序列有關(guān)有關(guān)（1 1）要使外源基因在酵母中表達(dá)，必須將外源基因克隆到酵母菌表達(dá)載）要使外源基因在酵母中表達(dá)，必須將外源基因克隆到酵母菌表達(dá)載體的啟動(dòng)子

48、和終止子之間，構(gòu)成表達(dá)框架（啟動(dòng)子體的啟動(dòng)子和終止子之間，構(gòu)成表達(dá)框架（啟動(dòng)子- -外源基因外源基因- -終止子）終止子）（2 2）分泌信號(hào)包括信號(hào)肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后面）分泌信號(hào)包括信號(hào)肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切斷表達(dá)的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切斷表達(dá)產(chǎn)物與前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn)生正確的表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)物與前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn)生正確的表達(dá)產(chǎn)物（3 3）終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止，并加上）終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止，并加上polyApolyA，形成的，形成

49、的mRNAmRNA比較穩(wěn)定并被有效地翻譯比較穩(wěn)定并被有效地翻譯 2.2.外源基因的表達(dá)效率外源基因的表達(dá)效率3.3.外源蛋白的糖基化外源蛋白的糖基化 外源蛋白在酵母中可發(fā)生外源蛋白在酵母中可發(fā)生N-N-糖苷鍵（糖苷鍵（AsnAsn連接）和連接）和O-O-糖苷鍵（糖苷鍵（SerSer或或ThrThr連接）兩種不同的糖基化，并在分泌過程中正確識(shí)別外源蛋白的糖連接）兩種不同的糖基化，并在分泌過程中正確識(shí)別外源蛋白的糖基化信號(hào)，使其進(jìn)行正確折疊和分泌到細(xì)胞外基化信號(hào)，使其進(jìn)行正確折疊和分泌到細(xì)胞外 酵母細(xì)胞分泌的酵母細(xì)胞分泌的“異源異源”蛋白糖基化產(chǎn)物與天然產(chǎn)物完全相同，這蛋白糖基化產(chǎn)物與天然產(chǎn)物完全

50、相同，這也是為什么酵母細(xì)胞被廣泛應(yīng)用生產(chǎn)各種醫(yī)用蛋白的原因也是為什么酵母細(xì)胞被廣泛應(yīng)用生產(chǎn)各種醫(yī)用蛋白的原因 不同的酵母菌株及其生理狀態(tài)對(duì)外源基因的表達(dá)有明顯影響，不同的酵母菌株及其生理狀態(tài)對(duì)外源基因的表達(dá)有明顯影響， 用用作表達(dá)的酵母宿主菌株應(yīng)具備下列要求作表達(dá)的酵母宿主菌株應(yīng)具備下列要求 菌體生長(zhǎng)力強(qiáng)菌體生長(zhǎng)力強(qiáng) 菌體內(nèi)源蛋白酶較弱菌體內(nèi)源蛋白酶較弱 菌體性能穩(wěn)定菌體性能穩(wěn)定 分泌能力強(qiáng)分泌能力強(qiáng) 4.4.宿主菌株的影響宿主菌株的影響五、動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)五、動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá) 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn)：產(chǎn)物可分泌到細(xì)胞外，培養(yǎng)液成分可人工調(diào)產(chǎn)物可分泌到細(xì)胞外，培養(yǎng)液成分

51、可人工調(diào)控，產(chǎn)物純化比較容易，產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物；但控，產(chǎn)物純化比較容易，產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物；但動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)慢，單位體積生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)慢，單位體積生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度較小濃度較小 第五節(jié)第五節(jié) 基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的穩(wěn)定性 基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，有基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，有分裂不穩(wěn)定分裂不穩(wěn)定和和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。不管是哪一種不穩(wěn)定，都將使不含。不管是哪一種不穩(wěn)定，都將使不含目的基因的細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)菌，從而減少基因表達(dá)的產(chǎn)物目的基因的細(xì)胞成為

52、優(yōu)勢(shì)菌，從而減少基因表達(dá)的產(chǎn)物分裂不穩(wěn)定：分裂不穩(wěn)定：是指工程菌分裂增殖時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒是指工程菌分裂增殖時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象的子代菌的現(xiàn)象質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或突變，或堿是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或突變，或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變基重排、缺失所致工程菌性能的改變一、引起質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因一、引起質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因 在基因工程菌培養(yǎng)過程中，質(zhì)粒的不穩(wěn)定通常表現(xiàn)為分裂不穩(wěn)定，主要在基因工程菌培養(yǎng)過程中，質(zhì)粒的不穩(wěn)定通常表現(xiàn)為分裂不穩(wěn)定，主要與兩個(gè)因素有關(guān)與兩個(gè)因素有關(guān)含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；

53、這兩種菌的比生這兩種菌的比生長(zhǎng)速率差異的大小長(zhǎng)速率差異的大小1.1.對(duì)于含低拷貝質(zhì)粒的工程菌，若工程菌的比生長(zhǎng)速率較快，則容易產(chǎn)生不對(duì)于含低拷貝質(zhì)粒的工程菌，若工程菌的比生長(zhǎng)速率較快，則容易產(chǎn)生不含質(zhì)粒的子代菌含質(zhì)粒的子代菌（此時(shí)可通過降低工程菌的生長(zhǎng)速率或增加工程菌中的質(zhì)粒（此時(shí)可通過降低工程菌的生長(zhǎng)速率或增加工程菌中的質(zhì)粒拷貝數(shù)能提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性）拷貝數(shù)能提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性）2.2.含高拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較低，但是大量外源質(zhì)含高拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較低，但是大量外源質(zhì) 粒的存在使含質(zhì)粒菌的生長(zhǎng)速率明顯低于不含質(zhì)粒菌，而不含質(zhì)粒菌一旦產(chǎn)粒的存在使含質(zhì)粒

54、菌的生長(zhǎng)速率明顯低于不含質(zhì)粒菌，而不含質(zhì)粒菌一旦產(chǎn)生，能較快地取代含質(zhì)粒菌而成為優(yōu)勢(shì)菌生，能較快地取代含質(zhì)粒菌而成為優(yōu)勢(shì)菌（因而對(duì)這類工程菌而言，進(jìn)一步（因而對(duì)這類工程菌而言，進(jìn)一步提高質(zhì)?？截悢?shù)反而會(huì)增加含質(zhì)粒菌的生長(zhǎng)負(fù)勢(shì)，對(duì)質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利）提高質(zhì)?？截悢?shù)反而會(huì)增加含質(zhì)粒菌的生長(zhǎng)負(fù)勢(shì)，對(duì)質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利） 將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂布于不含抗性標(biāo)記抗生素的將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂布于不含抗性標(biāo)記抗生素的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-1210-12小時(shí)，然后隨機(jī)挑出小時(shí)，然后隨機(jī)挑出100100個(gè)菌落接種到含抗性個(gè)菌落接種到含抗性標(biāo)記抗生素的平板上，培養(yǎng)標(biāo)記抗生

55、素的平板上，培養(yǎng)10-1210-12小時(shí)，統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的菌落數(shù)，每一樣品應(yīng)小時(shí)，統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的菌落數(shù)，每一樣品應(yīng)取取3 3次重復(fù)的結(jié)果，計(jì)算出比值，該比值反映了質(zhì)粒的穩(wěn)定性次重復(fù)的結(jié)果，計(jì)算出比值，該比值反映了質(zhì)粒的穩(wěn)定性質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 1.1.兩階段培養(yǎng)法：兩階段培養(yǎng)法：第一階段先使菌體生長(zhǎng)至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源第一階段先使菌體生長(zhǎng)至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)基因的表達(dá)2.2.選擇性壓力（如抗生素等）：選擇性壓力（如抗生素等）：通過向培養(yǎng)基中加入通過向培養(yǎng)基中加入“壓力壓力”，抑制質(zhì)粒，抑制質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)丟失

56、菌的生長(zhǎng)3.3.間歇供氧法間歇供氧法4.4.改變稀釋速率法改變稀釋速率法 利用重組菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境改變的反應(yīng)較質(zhì)粒丟失菌遲鈍利用重組菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境改變的反應(yīng)較質(zhì)粒丟失菌遲鈍的性質(zhì)，通過改變培養(yǎng)條件（如調(diào)控溫度、的性質(zhì)，通過改變培養(yǎng)條件（如調(diào)控溫度、pHpH、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基組分、溶解氧，通過間歇供氧和改變稀釋速率），抑制組分、溶解氧，通過間歇供氧和改變稀釋速率），抑制質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)，使工程菌生長(zhǎng)速率具有優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng)，使工程菌生長(zhǎng)速率具有優(yōu)勢(shì) 第六節(jié)第六節(jié) 基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn) 菌體生長(zhǎng)是菌體各成分尤其是生物大分子菌體生長(zhǎng)是菌體各成分尤其是生物大分子核酸和蛋白質(zhì)的綜

57、合核酸和蛋白質(zhì)的綜合表現(xiàn)，通常用比生長(zhǎng)速率來(lái)表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源、表現(xiàn)，通常用比生長(zhǎng)速率來(lái)表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源、控制補(bǔ)料或稀釋速率等方法來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)?？刂凭w生長(zhǎng)對(duì)提高質(zhì)控制補(bǔ)料或稀釋速率等方法來(lái)控制菌體的生長(zhǎng)。控制菌體生長(zhǎng)對(duì)提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物的積累、提高外源蛋白產(chǎn)率都有重要意義粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物的積累、提高外源蛋白產(chǎn)率都有重要意義對(duì)菌體生長(zhǎng)的調(diào)控主要有兩種觀點(diǎn)對(duì)菌體生長(zhǎng)的調(diào)控主要有兩種觀點(diǎn)能量的供應(yīng)決定了菌體的最大比生長(zhǎng)速率能量的供應(yīng)決定了菌體的最大比生長(zhǎng)速率小分子前體和催化組分（小分子前體和催化組分（RNARNA聚合酶、核糖體）的限

58、制決定了菌體的最聚合酶、核糖體）的限制決定了菌體的最大比生長(zhǎng)速率大比生長(zhǎng)速率 這兩種觀點(diǎn)分別從能量和合成反應(yīng)的前體這兩個(gè)不同的角度研究菌這兩種觀點(diǎn)分別從能量和合成反應(yīng)的前體這兩個(gè)不同的角度研究菌體的生長(zhǎng)體的生長(zhǎng) 一、菌體生長(zhǎng)與能量的關(guān)系一、菌體生長(zhǎng)與能量的關(guān)系 （一）菌體生長(zhǎng)與能量供應(yīng)的關(guān)系（一）菌體生長(zhǎng)與能量供應(yīng)的關(guān)系 菌體生長(zhǎng)是由呼吸控制的，各種碳源通過有限的呼吸能力所提供菌體生長(zhǎng)是由呼吸控制的，各種碳源通過有限的呼吸能力所提供的最大能量決定了菌體在這種培養(yǎng)基中的最大比生長(zhǎng)速率的最大能量決定了菌體在這種培養(yǎng)基中的最大比生長(zhǎng)速率 當(dāng)菌體生長(zhǎng)所需能量超過菌體有氧代謝所能提供的能量時(shí)，菌體當(dāng)菌體

59、生長(zhǎng)所需能量超過菌體有氧代謝所能提供的能量時(shí)，菌體往往會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物往往會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸乙酸（二）如何實(shí)現(xiàn)工程菌的高密度培養(yǎng)和提高重組產(chǎn)物的表達(dá)水平（二）如何實(shí)現(xiàn)工程菌的高密度培養(yǎng)和提高重組產(chǎn)物的表達(dá)水平分批培養(yǎng)中選用不同的碳源分批培養(yǎng)中選用不同的碳源補(bǔ)料培養(yǎng)中控制補(bǔ)料速度補(bǔ)料培養(yǎng)中控制補(bǔ)料速度連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率向培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲硫氨酸和酵母提取物向培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲硫氨酸和酵母提取物適當(dāng)提高培養(yǎng)基的適當(dāng)提高培養(yǎng)基的pHpH值，可減少乙酸的抑制作用值，可減少乙酸的抑制作用 這些培養(yǎng)方法的實(shí)質(zhì)是控制菌體的糖這些培養(yǎng)方法的實(shí)質(zhì)是控制菌體的糖酵解速度，使之低于三羧酸循環(huán)和呼

60、吸鏈酵解速度，使之低于三羧酸循環(huán)和呼吸鏈的最大代謝能力，從而避免乙酰的最大代謝能力，從而避免乙酰CoACoA的積的積累和乙酸的產(chǎn)生累和乙酸的產(chǎn)生二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系系 （一）菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系（一）菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系 菌體中小分子前體和催化結(jié)構(gòu)（如菌體中小分子前體和催化結(jié)構(gòu)（如 氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA）是有限的，因而生）是有限的，因而生物大分子的合成處于亞飽和狀態(tài)，限制了菌體的比生長(zhǎng)速率物大分子的合成處于亞飽和狀態(tài)，限制了菌體的比生長(zhǎng)速率 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸能使菌體比生長(zhǎng)速率提高，使蛋白質(zhì)合成在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸能使菌體比生長(zhǎng)速