理化生講基因工程操作程序

1、會計學(xué)1理化生講基因工程操作程序理化生講基因工程操作程序目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序的步驟：基因工程的基本操作程序的步驟：目的基因的獲取目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞1 1、什么是目的基因？、什么是目的基因？2 2、獲取目的基因的方法有哪些？其操、獲取目的基因的方法有哪些？其操作過程分別是怎樣的？作過程分別是怎樣的？基因文庫基因文庫 基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部分基因文庫（如（如cDNAcDNA文庫）文庫）基基因因組組文文庫庫限制酶限制酶供體細胞的供體細胞的全部全部DNA大量大量DNA片段片

2、段拼接到載體上拼接到載體上導(dǎo)入受體細胞擴增導(dǎo)入受體細胞擴增mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA 雙鏈雙鏈DNADNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄cDNA文庫文庫依據(jù)目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因在染色體上的位置基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性?；蚍g產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。從從基因文庫基因文庫中獲取目的基因中獲取目的基因模板模板原料原料引物引物酶酶控制溫度控制溫度目的基因目的基因DNADNA四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸如單鏈如單鏈DNADNA分子片段分子片段耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶

3、聚合酶PCRPCR儀自動調(diào)控儀自動調(diào)控PCRPCR的條件：的條件：PCRPCR的過程：的過程：變性變性(90-95)(90-95)復(fù)性復(fù)性(55-60)(55-60)( (退火）退火）延伸延伸(70-(70-75)75)條件：條件：基因較小，核苷酸序列已知。基因較小，核苷酸序列已知。用切目的基因相用切目的基因相同的限制性內(nèi)切同的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒酶切割質(zhì)粒目的基因目的基因1 1、基因表達載體的組成、基因表達載體的組成目的基因目的基因啟動子啟動子:終止子終止子:標(biāo)記基因、復(fù)制原點等標(biāo)記基因、復(fù)制原點等一段有特殊結(jié)構(gòu)的一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片段片段。位于基因的首端。位于基因的首端。一段有特

4、殊結(jié)構(gòu)的一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片段片段。位于基因的尾端。位于基因的尾端。終止子作用：終止子作用：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。標(biāo)記基因作用：標(biāo)記基因作用： 是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基 因，從而將有目的基因的細胞篩選出來，因，從而將有目的基因的細胞篩選出來，如青霉素基因。如青霉素基因。 是是RNARNA聚合酶識別和結(jié)合的部位聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。，最終獲得蛋白質(zhì)。2 2、基因表達載體的構(gòu)建目的：、基因表達載體的構(gòu)建目的：a.a.使目的基因在受體

5、細胞中穩(wěn)定存在，使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。并且可以遺傳給下一代。b.b.使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達維持穩(wěn)定和表達的過程。的過程。1.1.目的基因?qū)胫参锛毎康幕驅(qū)胫参锛毎Ｓ玫姆椒ǔＳ玫姆椒? : 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉基因槍法、花粉 管通道法管通道法農(nóng)桿菌的特點農(nóng)桿菌的特點: :a.a.易感染雙子葉植物和祼子植物。易感染雙子葉植物和祼子植物。b.b.具有趨化性。具有趨化性。c.Tic.Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的

6、T-DNAT-DNA可轉(zhuǎn)移到受體細胞可轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的，并整合到受體細胞染色體的DNADNA上上1.1.目的基因?qū)胫参锛毎康幕驅(qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的導(dǎo)入過程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的導(dǎo)入過程: :構(gòu)建基因表達載體構(gòu)建基因表達載體轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌植物細胞植物細胞導(dǎo)入導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達穩(wěn)定維持和表達. .目的基因?qū)雱游锛毎康幕驅(qū)雱游锛毎Ｓ玫姆椒ǔＳ玫姆椒? : 顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)操作程序：操作程序：a.a.先提純含目的基因的表達載體先提純含目的基因的表達載體 b.b.從動物體內(nèi)取出卵從動物體內(nèi)取出卵( (受精卵）受精卵）c.c.顯微注射儀進行顯微注射顯微注

7、射儀進行顯微注射 d.d.將含目的基因的受精卵移植到輸卵將含目的基因的受精卵移植到輸卵管或子宮中發(fā)育成新個體管或子宮中發(fā)育成新個體3.3.目的基因?qū)胛⑸锛毎康幕驅(qū)胛⑸锛毎松锏奶攸c原核生物的特點: :繁殖快，多為單細胞，遺傳物質(zhì)相對較繁殖快，多為單細胞，遺傳物質(zhì)相對較少。少。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化過程大腸桿菌的轉(zhuǎn)化過程: :用用CaCa2+2+處理細胞處理細胞 增加細胞壁的透性增加細胞壁的透性，與細胞膜無關(guān)，與細胞膜無關(guān) 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞重組表達載體重組表達載體DNADNA分子與感受態(tài)細胞混合分子與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸收DNADNA分子分子1.1.目的基因是否插

8、入受體細胞染色體的目的基因是否插入受體細胞染色體的DNADNA上上目的基因的檢測內(nèi)容和方法目的基因的檢測內(nèi)容和方法檢測方法檢測方法: :DNADNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)DNADNA探針：探針：用放射性同位素等作標(biāo)記的含有用放射性同位素等作標(biāo)記的含有目的基因的目的基因的DNADNA片段。片段。2.2.目的基因是否轉(zhuǎn)錄出目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA目的基因的檢測內(nèi)容和方法目的基因的檢測內(nèi)容和方法檢測方法檢測方法: :分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)用用DNADNA探針與探針與mRNAmRNA雜交。雜交。目的基因的檢測內(nèi)容和方法目的基因的檢測內(nèi)容和方法檢測方法檢測方法: :抗原抗原抗體雜交抗體雜交

9、3.3.目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì) 4 4、個體生物學(xué)水平的鑒定、個體生物學(xué)水平的鑒定如抗蟲、抗病的接種實驗如抗蟲、抗病的接種實驗4 4、珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分，當(dāng)它的成分異常時，動物可能成成分，當(dāng)它的成分異常時，動物可能患某種疾病，如鐮刀型細胞貧血癥，假患某種疾病，如鐮刀型細胞貧血癥，假如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌生如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的產(chǎn)出鼠的珠蛋白，想一想，應(yīng)該如珠蛋白，想一想，應(yīng)該如何設(shè)計？何設(shè)計？ 思考與探究思考與探究思考與探究思考與探究1.1.從小鼠中克隆出從小鼠中克隆出珠蛋白基因的編碼序列（珠蛋

10、白基因的編碼序列（CDNACDNA）。）。2.2.將將cDNAcDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達載體。另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達載體。3.3.將表達載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然將表達載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出了大腸桿菌四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出了大腸桿菌菌落，則表明菌

11、落，則表明珠蛋白基因已進入。珠蛋白基因已進入。4.4.培養(yǎng)進入了培養(yǎng)進入了珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取體，破碎后從中提取珠蛋白。珠蛋白?；蛭膸旎蛭膸?基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部分基因文庫（如（如cDNAcDNA文庫）文庫）模板模板原料原料引物引物酶酶控制溫度控制溫度目的基因目的基因DNADNA四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸如單鏈如單鏈DNADNA分子片段分子片段耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR儀自動調(diào)控儀自動調(diào)控PCRPCR的條件：的條件：目的基因目的基因1.1.目的基因?qū)胫参锛毎康幕驅(qū)胫参锛毎Ｓ玫姆椒ǔＳ玫姆椒? : 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉基因槍法、花粉 管通道法管通道法農(nóng)桿菌的特點農(nóng)桿菌的特點: :a.a.易感染雙子葉植物和祼子植物。易感染雙