糖尿病基因診斷

1、一.糖尿病的臨床表現(xiàn)二.輔助檢查三.糖尿病的基因診斷一.糖尿病的臨床表現(xiàn):典型者有“三多一少”癥狀，即多飲、多尿、多食、消瘦，不少患者缺乏典型臨床癥狀，表現(xiàn)為反應(yīng)性低血糖，或某些急慢性并發(fā)癥的癥狀。可疑指征 有多尿，多食癥狀者 有原因不明的體重下降，特別是原來(lái)超重或肥胖者 肥胖或者超重者 有糖尿病家族史，年齡大于40歲者 皮膚瘙癢，反復(fù)出現(xiàn)癤腫或者皮膚潰瘍經(jīng)久不愈者 有一過(guò)性高血糖史或尿糖陽(yáng)性史者 有反應(yīng)性低血糖發(fā)作史者 視力下降者 有巨大兒（出生體重=4kg）分娩史的女性或男性陽(yáng)痿二.輔助檢查血糖的測(cè)定口服葡萄糖耐量試驗(yàn) （OGTT）空腹血漿或血清胰島素及C肽測(cè)定胰島素或C肽釋放試驗(yàn)糖基化血

2、紅蛋白測(cè)定糖化血清蛋白測(cè)定自身抗體測(cè)定其他檢查1999年WHO修改糖尿病標(biāo)準(zhǔn)如下： 空腹血糖(FPG)的分類：60mmolL為正常；6070mmolL為空腹血糖過(guò)高(未達(dá)糖尿病，簡(jiǎn)稱IFG)；70mmolL為糖尿病(需另一天再次證實(shí))?？崭寡堑亩x是至少8小時(shí)沒(méi)有熱量的攝入。 可疑糖尿病，空腹及餐后血糖增高但未達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)者應(yīng)行此試驗(yàn)。成人采用75g葡萄糖負(fù)荷，兒童175g/kg，正常人血糖高峰出現(xiàn)于服糖后1/21h，峰值不超過(guò)8910mmol/L(160180mg/dl)。采用放射免疫法測(cè)定的胰島素包括胰島素原及與抗體結(jié)合的胰島素。C肽測(cè)定不受胰島素抗體影響，不與胰島素產(chǎn)生交叉免疫反

3、應(yīng)，也不受外源性胰島素干擾。1型糖尿病空腹血漿胰島素和C肽水平很低，2型糖尿病則多為正?；蛟龈?。本試驗(yàn)的方法與OGTT相同，只是于空腹，服糖后30，60，120，180min時(shí)采血同時(shí)測(cè)胰島素或C肽，以直接了解胰島細(xì)胞的功能狀態(tài)。正常人血胰島素和C肽的高峰與血糖高峰一致，于服糖后3060分鐘胰島素測(cè)值為空腹的510倍，C肽測(cè)值為空腹的56倍。1型糖尿病患者糖負(fù)荷后無(wú)胰島素和C肽釋放反應(yīng)峰，其釋放曲線呈低平狀態(tài)；2型糖尿病肥胖患者，糖負(fù)荷后胰島素和C肽釋放反應(yīng)峰值正常或增高，但高峰卻在2h后延遲出現(xiàn)；病程已久消瘦2型糖尿病患者胰島素和C肽的釋放反應(yīng)峰值低于正常。糖基化血紅蛋白(GHb)含量與血糖

4、濃度呈正比，可反映23個(gè)月前體內(nèi)血糖的平均水平。糖基化血紅蛋白的主要成分為HbAlc，因此常以HbAlc代表GHb。GHb(或HbAlc)的測(cè)值因測(cè)定方法不同而略有差異，約在36%63%的范圍之內(nèi)。未控制的糖尿病患者GHb可為正常人的2至3倍。自身抗體包括胰島細(xì)胞抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)及谷氨酸脫羥酶(GAD)抗體測(cè)定。1型糖尿病患者血清中該三種抗體可同時(shí)存在，亦可僅測(cè)到12種。三種抗體中GAD存在的時(shí)間較長(zhǎng)，于發(fā)病10余年后仍可測(cè)到該抗體。 三.糖尿病的基因診斷1、線粒體DNA點(diǎn)突變： 線粒體DNA (m tDNA ) 3243 位點(diǎn)tRNAL eu (UUR)基因A G 突變是

5、DM 的致病基因。2、線粒體DNA缺失突變: 10.4kb缺失(nt4398-14882);7.5kb(nt6080-13800);7.6kb(nt6465-14135)3、線粒體DNA重復(fù)突變：Poulton等報(bào)道2例，分別為8kb（nt6000-15000）及8kb（nt7000-16000） 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCRSSCP)及等位基因特異性寡核苷酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)INS基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有Arg65His、Arg65leu以及Hisl00Asp等點(diǎn)突變。此3種突變均可導(dǎo)致血中胰島素原不能轉(zhuǎn)換為胰島素，從而引起高胰島素原血癥。 Moller等對(duì)INSR基因的全部外顯子篩查后發(fā)

6、現(xiàn)，外顯子2，3，8，9，13，17中有無(wú)義突變，外顯子20中存在一個(gè)異質(zhì)性點(diǎn)突變。 (CGGCAG、Argl174Gln) 該突變位于酪氨酸激酶區(qū)內(nèi)，影響受體細(xì)胞內(nèi)亞基的結(jié)構(gòu)，是引起遺傳性胰島素抵抗（insulin resistance ，IR）的主要原因。 對(duì)GCK的12個(gè)外顯子作單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)測(cè)序分析進(jìn)行分子篩查，發(fā)現(xiàn)多種GCK突變，到目前為止已知致NIDDM的GCK突變近30種，以錯(cuò)義突變多見(jiàn)，亦有無(wú)義突變、剪接點(diǎn)突變及堿基缺失。1己糖激酶(hexokinase，HK2)基因突變2磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因突變 3糖原合成酶(glycogen synthetase，GSY)

7、基因突變4載脂蛋白基因群及低密度脂蛋白受體基因突變糖尿病相關(guān)基因診斷技術(shù) 等位基因特異性寡核苷酸斑點(diǎn)雜交技術(shù) 測(cè)序分析進(jìn)行分子篩查 PCR PCR-SSCP PCR-DGGE 基因芯片 線粒體基因突變糖尿病PCR技術(shù)常規(guī)方法提取提取基因組DNA (包括核DNA 和線粒體DNA )。PCR 法擴(kuò)增擴(kuò)增含3243 位點(diǎn)的線粒體DNA 片段, 引物R: 52 GTTTTA GGGGCTCTTTGGT 2GAA GA GTT 23; 引物F: 52 TTGGA TCA 2 GGACA TCC2CGA TGGTGCA G23。組成PCR 總反應(yīng)體系50 l, 置熱循環(huán)儀內(nèi), 94變性變性30 s, 60

8、退火退火45 s, 72延伸延伸1 m in, 共30 個(gè)循環(huán), 最后再72延伸10 m in。用限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶Apa I 酶切酶切PCR 反應(yīng)產(chǎn)物。取30 l PCR 反應(yīng)產(chǎn)物, 再加3. 4 l L 2Buffer 及1 lApa 酶(20 ul) 混勻, 37水浴3 h, 使之充分酶解。酶解產(chǎn)物用溴化乙錠染色, 然后用1. 5% 瓊脂糖電泳檢測(cè)瓊脂糖電泳檢測(cè), 最后在紫外燈下觀察結(jié)果。1 4: 突變; 5、6: 無(wú)突變; C: 正常PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為500 bp。線粒體3243 位點(diǎn)突變者的白細(xì)胞中含有野生型和突變型m tDNA , 呈異質(zhì)性。A G 突變, 形成GGGCCC

9、序列能被限制性內(nèi)切酶Apa I 識(shí)別。酶切后, 在1. 5% 瓊脂糖電泳帶上可見(jiàn)500 bp 及重疊在一起的250 bp 2 個(gè)片段,無(wú)此突變者僅見(jiàn)500 bp 1 個(gè)片段。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)原理：基于序列不同的DNA單鏈片段，其空間構(gòu)象亦有所不同，當(dāng)其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時(shí)，其泳的位置亦發(fā) 生變化而表現(xiàn)出不同序列單鏈其電泳遷頻率的差異，從而據(jù)引判斷有無(wú)突變存在. 步驟：1、PCR擴(kuò)增靶DNA。2、PCR產(chǎn)物的快速變性而后快速?gòu)?fù)性，形成特定空間結(jié)構(gòu)的DNA單鏈分子。3、非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳

10、（PAGE）。4、PAGE膠的銀染?；蛐酒╣ene chip） 指通過(guò)微陣(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段通過(guò)高速點(diǎn)樣機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如硅片、膜、玻璃片等固相表面，以同位素或熒光標(biāo)記的DNA待測(cè)樣品，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測(cè)等方面研究的技術(shù)?！疤结槨保狠d玻片或尼龍膜表面的寡核苷酸“樣品”：標(biāo)記了熒光或同位素待測(cè)靶核酸 DNA、cDNA或RNAn近日從武漢大學(xué)中南醫(yī)院了解到, 該院周新教授率領(lǐng)的課題組新近發(fā)明的糖尿病基因診斷芯片, 可以通過(guò)基因檢測(cè)在一天之內(nèi)確診線粒體型糖尿病。 將成千上萬(wàn)個(gè)我們克隆到的特異性靶基因固定在

11、一塊芯片上，對(duì)來(lái)源于不同個(gè)體、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激（包括不同誘導(dǎo)、不同治療手段）下細(xì)胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性組織特異性發(fā)育階段特異性分化階段特異性。進(jìn)行綜合評(píng)定與判斷，極大加快這些基因功能的確立?；蛐酒ぷ髁鞒袒蛐酒ぷ髁鞒滩±仆瑢W(xué)，男，15歲。三個(gè)月前受涼感冒，之后常感覺(jué)口渴、總想喝水、感覺(jué)沒(méi)有力氣，體重減輕5斤。以為是感冒還沒(méi)完全好，沒(méi)有在意，口渴時(shí)就喝可樂(lè)等甜飲。兩天前明顯感覺(jué)沒(méi)力氣，并出現(xiàn)惡心、嘔吐、上腹不適。到醫(yī)院查空腹血糖22.7mmol/L；尿常規(guī)：葡萄糖4+，酮體3+，蛋白-。血常規(guī)：WBC13.6*109/L；肝功、腎功、血脂、尿酸、血尿淀粉酶正常；血?dú)夥治觯篜H值 7.05；尿微量白蛋白正常；心電圖：竇性心動(dòng)過(guò)速；肝膽脾雙腎B超：脂肪肝。體檢：血壓90/60mmHg，身高169cm，體重48kg，皮膚粘膜較干燥，雙肺呼吸音稍粗，心率110次/分，律齊，心界無(wú)擴(kuò)大，心音正常，各瓣膜聽(tīng)診區(qū)未聞及雜音，雙下肢無(wú)水腫。診斷：1型糖尿病，糖尿