基因組學研究在功能基因組中的應用

1、基因組學研究在功能基因組中的應用摘 要：20世紀的最后十年，分子生物學研究發(fā)生了很大的變革，從單個基因或蛋白質(zhì)研究轉向大規(guī)模研究基因，從而產(chǎn)生了基因組學、功能基因組學等新學科。功能基因組學是在結構基因組學豐富信息資源的基礎上，應用先進的基因表達技術、生物功能檢測技術和生物信息學技術分析研究基因的表達、調(diào)控和功能；探討生物的生長、發(fā)育規(guī)律的新型交叉學科。目前功能基因組學研究的內(nèi)容和方法，主要包括應用微點陣、基因表達系列分析（SAGE）、蛋白質(zhì)組、生物信息學等方法來研究基因組表達概況、基因組多樣性、模式生物體等。關鍵詞：基因組學，功能基因組學，SAGE，蛋白質(zhì)組學人類基因組計劃的完成意味著從結構基

2、因組學到功能基因組學的跨越，把我們帶進了后基因組時代，基因組學的研究發(fā)生了翻天覆地的變化已從結構基因組學過渡到功能基因組學。功能基因組學以揭示基因組的功能及調(diào)控機制為目標功能基因組學的研究是21世紀國際研究的前沿也是最熱門的研究領域之一。本文簡要介紹功能基因組學的研究進展尤其是功能基因組學的主要研究內(nèi)容和研究方法，。1功能基因組的含義基因組(genome)這一概念于1924年提出用于描述生物的全部基因和染色體組成。基因組學(genomics)由美國科學家ThomasRoderick于1986年提出是指對所有基因進行基因組作圖(包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉錄本圖譜)核苷酸序列分析基因定位和基因功能

3、分析的一門科學。結構基因組學(Structural genomics)是基因組學的一個重要組成部分和研究領域它是通過基因作圖，核苷酸序列分析以確定基因組成、基因定位的一門科學，結構基因組學代表基因組分析的早期階段以建立生物體高分辨率遺傳、物理和轉錄圖譜為主。比較功能基因組學(comparative genomics)是在基因組圖譜及序列測定的基礎上對已知的基因和基因組結構進行比較以了解基因的功能、表達機理及物種進化的學科。功能基因組學(functional genomics)被稱為后基因組學(post genomics)是利用結構基因組學提供的信息和產(chǎn)物發(fā)展和應用新的實驗手段通過在基因組或系統(tǒng)

4、水平上全面分析基因的功能使得生物學研究從對單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉向多個基因或蛋白質(zhì)同時進行系統(tǒng)的研究的一門科學，功能基因組學代表基因組分析的新階段以高通量、大規(guī)模試驗方法、統(tǒng)計與計算機分析為主要特征。功能基因組學的近期目標是采用高通量、大規(guī)模、自動化的方法加速遺傳分析進程；長遠目標是避開傳統(tǒng)遺傳分析的局限采用系統(tǒng)化的途徑及數(shù)據(jù)采集方法闡明復雜的生物學現(xiàn)象。2 功能基因組學的研究方法基因的時空差異表達是植物發(fā)育、分化、衰老和抗逆等生命現(xiàn)象的分子基礎?；蛟诓煌M織、不同器官以及不同環(huán)境條件下的差異表達特征，為基因的功能提供了重要的信息。Velculescu等(1997)將在特定組織或細胞內(nèi)轉錄

5、的所有基因及其表達豐度稱為轉錄組(transcriptome)，因此在轉錄水上進行的基因表達差異分析實際上就是進行轉錄組研究。經(jīng)典的減法雜交(subtractive hybridization)，差示篩選(differential screening)，cDNA代表差異分析(representative difference analysis，RDA)以及mRNA差異顯示(differential display)等技術已被廣泛用于鑒定和克隆差異表達的基因，但是這些技術不能勝任對大量的植物基因進行全面、系統(tǒng)的分析，于是，基因表達的系統(tǒng)分析(serial analysis of gene exp

6、ression，SAGE)、cDNA微陣列(cDNA microarray)和DNA芯片(DNA chip)等能夠大規(guī)模地進行基因差異表達分析的技術應運而生。2.1 基因表達的系統(tǒng)分析( SAGE)SAGE技術的主要理論依據(jù)是:來自cDNA 3端特定位置的一段911bp長的序列能夠區(qū)分基因組中95%的基因。這一段基因特異的序列被稱為SAGE標簽(SAGE tag)。通過對cDNA制備SAGE標簽并將這些標簽串聯(lián)起來，然后對上述串聯(lián)起來的SAGE標簽進行測序不僅可以顯示各SAGE標簽所代表的基因在特定組織中是否表達，還可以根據(jù)各SAGE標簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達豐度的指標。應用SAG

7、E技術的一個必要前提是GenBank中必須有足夠的某一物種的DNA序列資料，尤其是EST序列資料。目前該技術在人類和酵母基因組研究中已得以應用，但是尚未用于植物基因組研究。SAGE技術的不足是不能夠檢測出稀有轉錄物。2.2 cDNA 微陣列和 DNA 芯片技術 cDNA微陣列和DNA芯片都是基于reverse Northern雜交以檢測基因表達差異的技術。二者的基本思路都是首先把cDNA，或EST，或基因特異的寡聚核苷酸固定在固相支持物上，并與來自不同細胞、組織或整個器官的mRNA反轉錄生成的第一鏈cDNA探針進行雜交，然后用特殊的檢測系統(tǒng)對每個雜交點進行定量分析，理論上雜交點的強度基本上反映

8、了其所代表的基因在不同細胞、組織或器官中的相對表達豐度。這兩項技術的優(yōu)點是可以同時對大量基因，甚至整個基因組的基因的表達差異進行對比分析。cDNA微陣列技術是Schena等(1995)發(fā)展起來的，其主要優(yōu)點是:靈敏度極高，mRNA豐度低至10萬分之一仍能被檢測出;使用幾種不同顏色的熒光染料標記探針，這樣在同一張陣列膜上進行一次雜交實驗就可以同時分析不同細胞間或不同環(huán)境脅迫下基因表達的差異。cDNA微陣列技術的主要不足是成本非常高，如需要機器人點膜和特殊的信號檢測分析系統(tǒng)，點在玻璃片上的array不能重復使用等。最近，Desprez等和胡玉欣等分別獨立發(fā)展了利用尼龍膜作固相支持物和使用同位素標記

9、探針進行雜交的cDNA表達陣列技術，從而降低了成本，但檢測的靈敏度卻降低了(萬分之一)。DNA芯片技術是Affymetrix公司率先研制出來的，該技術利用結合化學手段在玻璃固相支持物上原位合成大量的基因特異的寡聚核苷酸，并與熒光標記的探針進行雜交，再利用特殊的檢測系統(tǒng)進行信號分析，就可以獲得基因的時空差異表達譜，最近Ramsay(1998)對DNA芯片技術的原理和應用進行了較全面的介紹。2.3 蛋白組( proteome) 研究轉錄不是基因表達的最終結果，基因功能的實現(xiàn)最終是以蛋白質(zhì)的形式體現(xiàn)的。因此，在轉錄水平上所獲取的基因表達的信息有時并不足以揭示該基因在細胞內(nèi)的確切功能。蛋白組指的是由基

10、因組表達產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱，由英文單詞protein的前半部加上單詞genome的后半部組合而成。蛋白質(zhì)雙向電泳是目前蛋白組研究的首選技術（Humphery Smith，1997），但是該技術在以下方面尚需改進：分辨率和可重復性；蛋白質(zhì)斑點的自動定量檢測系統(tǒng)，以及蛋白質(zhì)N端和內(nèi)部氨基酸序列測定技術等。 利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術對基因敲除(knock-out)突變體或轉基因重組體與野生型個體間雙向電泳蛋白圖譜的差異進行對比分析就可以對目的基因的功能進行分析。在植物上該技術已被用來分離新的基因，Damerval等(1998)分析了玉米Opaque2基因的近等基因系之間的雙向電泳蛋白圖譜的差異，結果

11、鑒定克隆了一個新的轉錄激活因子基因。對水稻鹽脅迫處理和ABA處理前后的雙向電泳蛋白圖譜進行的對比分析同樣克隆了幾個與水稻耐鹽性相關的胚胎晚期豐富蛋白(lea)基因。2.4 反向遺傳學研究 傳統(tǒng)的遺傳學或稱為正向遺傳學(forward genetics)主要研究自發(fā)或誘發(fā)突變體中某一突變性狀的遺傳行為，如控制突變性狀的基因的數(shù)目及其在染色體上的位置、突變性狀在后代中的傳遞規(guī)律等。反向遺傳學(reverse genetics)是在已知基因序列的基礎上研究基因的生物學功能，一般通過創(chuàng)造功能喪失(loss-of-function)突變體并研究突變所造成的表型效應。在微生物和小鼠中可以通過同源重組的方法

12、用突變的基因取代野生型基因創(chuàng)造功能喪失突變體進行反向遺傳學研究，但在植物中很難進行同源重組試驗(Puchta H,1996)，不過植物中有成熟的轉座子標簽(transposon tagging)系統(tǒng)和T-DNA標簽系統(tǒng)，而且目前已經(jīng)獲得了擬南芥、金魚草、番茄、玉米和水稻等植物的轉座子插入誘變的突變體群體，以及T-DNA插入誘變了的擬南芥突變體群體。從這些突變體群體中篩選出特異基因被突變了的植株，并對突變株進行表型分析將有助于揭示目的基因的生物學功能。篩選突變體的常用方法是利用PCR技術，這是在果蠅(Ballinger D G,1989)和線蟲(C.elegans)(Zwaal R R,1993

13、)中發(fā)展起來的比較成熟的方法，其基本思路是根據(jù)目的基因的序列設計一個引物，再根據(jù)插入元件(轉座子或T-DNA)的序列設計第二個引物，用上述引物對突變體群體進行PCR擴增，由于只有目的基因插入轉座子或T-DNA的突變體才有PCR擴增產(chǎn)物，這樣根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無就可以很容易地從數(shù)以千計的突變體群體中篩選出所需要的突變體。該技術已經(jīng)在矮牽牛(Koes R,1995)、玉米(Bensen R T,1995；Mena M，1996)和擬南芥（Krysan P J，1996）等植物中得以成功應用。但是對數(shù)以千計的材料進行PCR反應工作量十分巨大，為克服這一困難，Winkler等(1998)設計了利用DNA

14、混合池(pooling)進行突變體篩選的實驗程序，結果只需要進行36個PCR反應就可以從由6000個突變體組成的群體中篩選出單個的突變株，大大減輕了篩選的工作量，同時這些突變體的DNA樣品及構建的DNA池也可以向其他研究者免費提供。當然，要對基因組中所有的基因進行功能分析所需要的突變體的數(shù)目也是十分可觀的，理論上，要達到95%的概率使基因組中每一個基因均因插入元件而致突變，則所構建的突變體群體中個體的數(shù)量至少應為該植物基因總數(shù)的5倍左右。3基因組學在我的課題中的應用 我的課題為山葡萄抗霜霉病候選基因功能驗證研究。葡萄是一個具有多樣性的群體，不同群體和個體在生物學性狀以及在對疾病的易感性、抗性上的差別，是由于基因序列的差異與內(nèi)外環(huán)境相互作用的結果。這種基因不同的差異極為多態(tài)性，最常見的多態(tài)性是單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms,SNPs），葡萄中大約有三萬多個基因，編碼區(qū)的SNPs可能導致蛋白序列的多態(tài)性，非編碼區(qū)的