第三章-1DNA復制圖

1、 第三章第三章 DNA復制復制 (DNA Replication) 第一節(jié)第一節(jié) 基本概念基本概念 第二節(jié)第二節(jié) DNA復制的酶學復制的酶學 第三節(jié)第三節(jié) 原核生物原核生物DNA復制（復制（E.coli） 第四節(jié)第四節(jié) 真核生物真核生物DNA復制復制第五節(jié)第五節(jié) DNA的損傷修復及突變的損傷修復及突變DNA DNA 復制在細胞周期的復制在細胞周期的S S期期一、一、DNA的半保留復制的半保留復制 （Semi-Conservation Replication） 1958 Meselson-stahl 設計的設計的CsCl超離心試驗證實了超離心試驗證實了 DNA復制的這一特性（復制的這一特性（P3

2、9）第一節(jié)第一節(jié) 基本概念基本概念15N 標記實驗標記實驗 細胞生長在細胞生長在15N 標記培養(yǎng)基中標記培養(yǎng)基中 轉(zhuǎn)入正常轉(zhuǎn)入正常N源培養(yǎng)基中源培養(yǎng)基中 分離各代分離各代DNA 分析各代分析各代DNA的浮力密度的浮力密度15N 標記標記 DNA未標記未標記 DNA CsCL密度梯度離心密度梯度離心 浮力密度浮力密度 N15DNA 1.742g/ml N15N14DNA 1.717g/ml N14DNA 1.710g/mlReplication fork1 1、復制起點：富含、復制起點：富含AT & AT & 發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)夾結(jié)構(gòu) “呼吸作用呼吸作用”十分明顯十分明顯 許多酶的結(jié)合位

3、許多酶的結(jié)合位點點AT rich復制叉（復制叉（replication fork）：染色體中參與復制的活性區(qū)域，）：染色體中參與復制的活性區(qū)域，即復制正在發(fā)生的位點即復制正在發(fā)生的位點 2、復制方向（復制過程的順序性）、復制方向（復制過程的順序性） 復制眼（復制眼（replication eye）：電子顯微鏡下觀察正在復制的）：電子顯微鏡下觀察正在復制的DNA， 復制的區(qū)域形如一只眼睛復制的區(qū)域形如一只眼睛真核生物的多復制子真核生物的多復制子 多個復制眼多個復制眼單、雙向復制取決于起點處有一個還是兩個復制叉單、雙向復制取決于起點處有一個還是兩個復制叉 單向復制單向復制 雙向復制雙向復制 復制的

4、多模式復制的多模式 單單起點、起點、單單方向方向（原核）（原核）多多起點、起點、單單方向方向（真核）（真核）單單起點、起點、雙雙方向（原核）方向（原核）多多起點、起點、雙雙方向（真核）方向（真核）（2）共價延伸方式（）共價延伸方式（covalence elongation）或滾環(huán)式復）或滾環(huán)式復 制（制（rolling circle replication） 由于復制時產(chǎn)生的滾環(huán)結(jié)由于復制時產(chǎn)生的滾環(huán)結(jié) 構(gòu)形狀象構(gòu)形狀象，又稱，又稱復制復制 病毒、細菌因子病毒、細菌因子 （3） 置換式置換式 （Displacement form ） 又稱又稱 D 環(huán)復制環(huán)復制 動物線粒體動物線粒體 DNA的復

5、制方式的復制方式(P47) 其中其中 DNApol 全酶有十種共全酶有十種共22個亞基個亞基二聚體二聚體 滑動鉗滑動鉗 DNApol和和 DNApol 的主要特性和功能（的主要特性和功能（P47） 1、 DNA聚合酶活性：兩者都有聚合酶活性：兩者都有 條件條件模板、引物模板、引物 DNApol主要用于主要用于DNA 的修復和的修復和RNA引物的替換引物的替換 能填充很大的缺口，甚至整個互補鏈能填充很大的缺口，甚至整個互補鏈 DNApol DNA鏈的延長鏈的延長 填充幾個堿基的小缺口填充幾個堿基的小缺口 2、 35 外切核酸酶活性外切核酸酶活性 校對功能校對功能(proofreading) 3、

6、 53外切核酸酶活性外切核酸酶活性 DNApol的的53外切活性有以下三個特點：外切活性有以下三個特點： 必須有必須有5磷酸末端磷酸末端 被除去的核苷酸必須是已經(jīng)配對的被除去的核苷酸必須是已經(jīng)配對的 被除去的可以是脫氧核糖核苷酸，也可以是核被除去的可以是脫氧核糖核苷酸，也可以是核糖糖 核苷酸核苷酸 （缺口平移）（缺口平移）DNA復制保持準確性的機制復制保持準確性的機制:1、堿基互補配對、堿基互補配對2、復制酶的校對機制、復制酶的校對機制3、復制的起始具有引物：避免由于最初幾個核、復制的起始具有引物：避免由于最初幾個核苷酸的復制錯誤導致的致死突變苷酸的復制錯誤導致的致死突變!4、從、從5到到3延

7、伸延伸5、生物體的、生物體的DNA修復機制修復機制 拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶：使：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是松解負超螺旋，反應不需要能連接。作用是松解負超螺旋，反應不需要能量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶：使：使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當引入負超螺旋時需要由接。當引入負超螺旋時需要由ATP提供能量，提供能量，同復制有關(guān)。同復制有關(guān)。OriC in E. coli chromosomal DNA oriC與與 E.coli 復制的起始（復制的起始（P44） 四個四個9bp的重復序列

8、的重復序列 dnaA結(jié)合位點結(jié)合位點 三個三個13bp的重復序列的重復序列若干若干GATC位點位點打開打開DNA超螺鏈超螺鏈打開雙螺旋打開雙螺旋防止復螺旋防止復螺旋單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白解鏈酶解鏈酶引物復合體引物復合體引物酶引物酶拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶合成合成1、拓撲異構(gòu)酶解開超螺旋。、拓撲異構(gòu)酶解開超螺旋。2、Dna A蛋白識別并在蛋白識別并在ATP存在存在下結(jié)合于四個下結(jié)合于四個9bp的重復序列。的重復序列。3、在類組蛋白（、在類組蛋白（HU、ATP參與參與下下, Dan A蛋白變性蛋白變性13個個bp的重的重復序列復序列,形成開鏈復合物。形成開鏈復合物。4 、Dna B借助于水解借助于水

9、解ATP產(chǎn)生產(chǎn)生的能量在的能量在Dna C的幫助下沿的幫助下沿5 3 方向移動，解開方向移動，解開DNA雙鏈，形成雙鏈，形成前引發(fā)復合物。前引發(fā)復合物。5、單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。、單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。6、引物合成酶（、引物合成酶（Dna G蛋白）蛋白）開始合成開始合成RNA引物。引物。起始復合物起始復合物前引前引發(fā)復發(fā)復合物合物開鏈復合物開鏈復合物復制叉的復制叉的移動方向移動方向解旋酶解旋酶DNA聚合聚合酶酶III解鏈酶解鏈酶RNA引物引物引發(fā)體引發(fā)體DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 前導鏈前導鏈滯后鏈滯后鏈3 5 復制的起始復制的起始DNADNA鏈的延長鏈的延長DNADNA鏈終止鏈

10、終止5 RNA引物引物3 3 過程過程復制體復制體專一性終止蛋白專一性終止蛋白 E.coli 中由中由 tus gene 編碼編碼 （terminus utilization substance） 通過抑制通過抑制DNA解鏈酶解鏈酶而發(fā)揮終止作用而發(fā)揮終止作用 每次復制時只使用一個終止位點每次復制時只使用一個終止位點ter 第四節(jié)第四節(jié) 真核生物的真核生物的DNA聚合酶（聚合酶（P48） 、五種五種 位置位置 核內(nèi)核內(nèi) 核內(nèi)核內(nèi) 核內(nèi)核內(nèi) 核內(nèi)核內(nèi) 線粒體線粒體 合成合成 與與引發(fā)引發(fā) 修復修復 合成合成 合成合成,修復修復 復制復制功能功能 酶酶結(jié)合結(jié)合 前導鏈前導鏈 后隨鏈后隨鏈35校校

11、NO NO Yes Yes Yes正活性正活性 第五節(jié)第五節(jié) DNA損傷、修復和突變損傷、修復和突變概述：損傷因素及其類型概述：損傷因素及其類型復制過程中的錯配修復復制過程中的錯配修復損傷修復損傷修復 廣義的修復系統(tǒng)：廣義的修復系統(tǒng)： DNA聚合酶的校對功能聚合酶的校對功能 (復制的范疇復制的范疇) 錯配修復錯配修復 堿基切除修復堿基切除修復（尿嘧啶（尿嘧啶-N-糖苷酶修復系統(tǒng)）糖苷酶修復系統(tǒng)） 核苷酸切除修復核苷酸切除修復 直接修復直接修復 (光復活、重組修復、光復活、重組修復、SOS修復等修復等) 錯配修復錯配修復(P50)(P50)DNA中的中的GATC為為m6A甲基化敏感位點甲基化敏感

12、位點平均每平均每2kb左右有一左右有一GATC 甲基化程度的差異甲基化程度的差異MutL/MutS 掃描識別錯配掃描識別錯配 堿基和鄰近的堿基和鄰近的GATC序列序列 切點甲基化切點甲基化GATC中中 G的的5側(cè)側(cè) DNA helicase, SSB, exonuclease I去除包括錯去除包括錯 配堿基的片段配堿基的片段 DNA polymerase III 和和 DNA ligase 填充缺口填充缺口昂貴的代價用于保證昂貴的代價用于保證DNA的準確性的準確性修復過程修復過程 堿基切除修復堿基切除修復 (P51)尿嘧啶尿嘧啶-N-糖苷酶糖苷酶 系統(tǒng)系統(tǒng) ( ung system )修復尿嘧

13、啶的來源：修復尿嘧啶的來源：dUTP的滲入的滲入 胞嘧啶的自發(fā)脫氨氧化胞嘧啶的自發(fā)脫氨氧化-TAGC-ATCG-TAGC-A CG-U-TAGC-尿嘧啶尿嘧啶-N-糖苷酶糖苷酶 GCUAU-TAGC-A CG-AP內(nèi)切酶內(nèi)切酶(Apurinase)-TAGC-ATCG-DNApol Ligase PR1、光復活（、光復活（photo reactivation ）-TT-AA-TT-AA-TT-AA-TT-AA- 復制前修復、不容易出錯復制前修復、不容易出錯 400 nm 藍光、藍光、PR 酶酶 (photo-reactivation enzyme) 光敏裂合酶（光敏裂合酶（photolyase

14、）可見光激活可見光激活二聚體修復的機制：二聚體修復的機制：2. 2. 切除修復切除修復ExisionRepair ExisionRepair 復制前進行復制前進行 不易出錯不易出錯UvrA, B, C gene 內(nèi)切核酸酶內(nèi)切核酸酶（Endonucleases） 外切核酸酶外切核酸酶 （Exonuclease） DNA pol DNA Ligase核苷酸切除修復核苷酸切除修復 3 3、重組修復、重組修復（RecombinativeRepair） 復制后修復復制后修復 ，容易出錯，容易出錯 RecA（催化（催化DNA 分子間分子間的同源聯(lián)會和交換單鏈）的同源聯(lián)會和交換單鏈） DNA pol DNA ligase二聚體后起始二聚體后起始 RecA 聚合酶、連接酶聚合酶、連接酶4、 SOS 修復機制修復機制 SOS 修復無模板指導的修復無