遺傳重組轉座敲除

1、第九章 DNA的重組與轉座n重組的定義重組的定義n遺傳重組的類型遺傳重組的類型n同源重組的分子機制同源重組的分子機制n重組和酶重組和酶n位點特異性重組位點特異性重組n轉座轉座n轉座的機制轉座的機制n遺傳重組的應用遺傳重組的應用6.0 重組重組nDNA分子的斷裂和重新連接導致遺傳信息的重新組合，稱為重組（recombination）。重組的產物稱為重組DNA（recombinant DNA），所有的DNA都是重組DNA。由于重組，一個DNA分子的遺傳信息可以和另一個DNA分子的遺傳信息結合在一起，也可以改變一條DNA分子上遺傳信息的排列方式。DNA重組廣泛存在于各類生物中，說明重組對物種生存具有

2、重要意義。通過重組實現基因的重新組合使物種能夠更快地適應環(huán)境，加快進化的過程。此外，DNA重組還參與許多重要的生物學過程，比如重組在DNA損傷修復和突變中發(fā)揮重要作用。6.1 6.1 遺傳重組的類型遺傳重組的類型 根據對DNA序列和所需蛋白因子的要求，可有三種類型的重組。其共同點是這些過程都涉及雙鏈DNA之間的物質交換，但其發(fā)生的情況有所不同。遺傳重組的三種類型遺傳重組的三種類型（1 1）同源重組）同源重組 它的發(fā)生是依賴大范圍的DNA同源序列的聯會。在重組過程中，兩個染色體或DNA分子交換對等的部分。需要重組的蛋白質參與，eg.大腸桿菌中的RecA蛋白、RecBCD蛋白；蛋白質因子對DNA堿

3、基序列的特異性要求不高；（存在重組熱點和序列長度的影響）真核生物染色質的狀態(tài)影響重組的頻率。特點特點：同源重組可能發(fā)生在兩條同源的DNA的任意位點(3)(3)異常重組異常重組 完全不依賴于序列間的同源性而使一段完全不依賴于序列間的同源性而使一段DNA序列插入序列插入另一段中，但在形成重組分子時往往是依賴于另一段中，但在形成重組分子時往往是依賴于DNA復制而復制而完成重組過程。完成重組過程。eg.轉座作用，需要轉座酶和對轉座區(qū)域轉座作用，需要轉座酶和對轉座區(qū)域DNA的復制。的復制。(2)(2)位點專一性重組位點專一性重組 重組依賴于小范圍同源序列的聯會，發(fā)生精確的斷裂、連重組依賴于小范圍同源序列

4、的聯會，發(fā)生精確的斷裂、連接，接，DNA分子并不對等交換分子并不對等交換 eg. -phage DNA對對E.coli 的整合的整合(attPattB)，需要有，需要有15 bp的同源序列和專一性的蛋白質因子參與。的同源序列和專一性的蛋白質因子參與。 位點專一重組發(fā)生在兩條特定的序列，兩條重組DNA的其他序列則是不同的。位點專一重組能使二聚體環(huán)狀DNA分子產生兩個單體環(huán)狀DNA分子6.2 6.2 同源重組的分子機制同源重組的分子機制同源重組（同源重組（homologous recombination）發(fā)生在兩個同源）發(fā)生在兩個同源DNA分子之間。真核細胞減數分裂過程中，同源染色體彼此分子之間。

5、真核細胞減數分裂過程中，同源染色體彼此配對，同源染色體配對，同源染色體DNA片段發(fā)生交叉與互換。片段發(fā)生交叉與互換。Darlington D. C.于于1936年提出：減數分裂同源染色體聯會時，年提出：減數分裂同源染色體聯會時，非姊妹染色單體由于纏繞而產生張力，兩個染色單體在同一非姊妹染色單體由于纏繞而產生張力，兩個染色單體在同一位置斷裂、重接，以消除張力，從而產生重組。位置斷裂、重接，以消除張力，從而產生重組。6.2.1 斷裂與重接模型斷裂與重接模型First Meiotic Interphase (cells contain 4N DNA content) Bivalent sister

6、chromatidsalign with each other, thisact is termed synapsis.Synapsed sister chromatidsare termed a synaptonemal complex) Figure 5-55, page 185兩條同源兩條同源DNADNA分子彼此并排對齊，相互配對分子彼此并排對齊，相互配對DNADNA中兩中兩個方向相同的單鏈在個方向相同的單鏈在DNADNA內切酶的作用下內切酶的作用下, ,在相同位在相同位置上同時切開。在切口處置上同時切開。在切口處發(fā)生鏈的交換發(fā)生鏈的交換，形成所謂，形成所謂的的連接分子連接分子（join

7、t moleculejoint molecule），也稱），也稱HollidayHolliday結結構（構（Holliday structureHolliday structure）。）。分支點可以發(fā)生移動，稱為分支遷移（分支點可以發(fā)生移動，稱為分支遷移（branch branch migrationmigration），分支遷移的結果是在兩個），分支遷移的結果是在兩個DNADNA分子中分子中形成異源雙鏈區(qū)（形成異源雙鏈區(qū)（heteroduplexheteroduplex）。）。1. Holliday modelSynapsedchromatidsRecombinationjointHeter

8、oduplex DNA 鏈交換所形成的連接分子必須進行拆分，才能形成鏈交換所形成的連接分子必須進行拆分，才能形成兩個獨立的雙鏈分子。兩個獨立的雙鏈分子。這需要再產生兩個切口。反應結果要看切開的是哪這需要再產生兩個切口。反應結果要看切開的是哪一對鏈，如果切口發(fā)生在當初未切的兩條鏈上，那一對鏈，如果切口發(fā)生在當初未切的兩條鏈上，那么原來的么原來的4 4個鏈就全被切開，就會釋放出剪接重組個鏈就全被切開，就會釋放出剪接重組DNA(spliceDNA(splice recombinant DNA) recombinant DNA)分子。分子。ABBAABABABBAHolliday intermedia

9、tesABBAA BA BA BA BEndonucleasesaka. resolvases(e.g. RuvC)Products beforeDNA repairHolliday Intermediate(see Photo inLehninger pg 962) 如果切口發(fā)生在當初被切的兩條鏈上，連接分子如果切口發(fā)生在當初被切的兩條鏈上，連接分子拆分后將形成補丁重組體（拆分后將形成補丁重組體（patch recombinantpatch recombinant）。）。分開的兩個分開的兩個DNADNA分子除保留了一段異源雙鏈分子除保留了一段異源雙鏈DNA DNA 外，外，均完整無缺。均完整

10、無缺。因此，連接因此，連接DNADNA分子無論如何拆分，所形成的兩個分子無論如何拆分，所形成的兩個獨立的獨立的DNADNA分子總有一段異源雙鏈區(qū)，但是異源雙分子總有一段異源雙鏈區(qū)，但是異源雙鏈區(qū)兩側的重組未必同時發(fā)生。鏈區(qū)兩側的重組未必同時發(fā)生。Termed “patch recombinants”兩條雙鏈體DNA分子間的重組關鍵是單鏈的交換。當雙鏈體DNA的單鏈與相對應的另一雙鏈體中的單鏈發(fā)生置換時，會產生一個分叉結構。交換產生異源雙鏈體DNA片斷，兩條單鏈分別來自父本和母本。聯合分子可以通過切開相接的鏈從而形成兩條分開的雙鏈體分子。DNA雙鏈體配對同源鏈被切出缺口在雙鏈體之間，斷裂鏈交換靠

11、分叉遷移，使交叉點移動在雙鏈體間第二鏈交叉，切口被封閉兩條配對雙鏈體DNA的重組包括相互的單鏈交換、分叉交換和缺口的切出。Holliday模型模型nHolliday R.于1964年提出旋轉顯示Holliday接頭結構 切口控制結果根據鏈被切出缺口的位置, Holliday結構的結果可產生親本雙鏈體或重組雙鏈體.兩種類型的產物都有一段異源雙鏈體DNA.n Holliday模型能夠較好解釋同源重組現象，但也存在問題。該模型認為進行重組的兩個DNA分子在開始時需要在對應鏈相同位置上發(fā)生斷裂。DNA分子單鏈斷裂是經常發(fā)生的事，但很難設想兩個分子何以能在同一位置發(fā)生斷裂。6.2.3 Meselson-

12、Radding模型模型l Holliday模型中為對稱的雜合雙鏈，而實際情況有不均等分離現象。l1975年，Matthew Meselson 和 Charles Radding對Holliday 模型進行了修改。 nHolliday模型要求在兩個并排對齊的同源DNA分子的對應位點形成單鏈切口，從而產生游離的單鏈末端。然而，在Meselson-Radding遺傳重組模型中，僅在一個雙螺旋上產生單鏈切口。利用切口處3-OH合成的新鏈把原有的鏈逐步置換出來，使之成為以5P為末端的單鏈區(qū)。隨后游離的DNA單鏈侵入另一條DNA雙螺旋中，取代它的同源單鏈并與其互補鏈配對形成異源雙鏈區(qū)，被置換的單鏈形成D環(huán)

13、（D-loop）。nD環(huán)單鏈區(qū)隨后被切除,兩個DNA分子在DNA連接酶的作用下形成Holliday交叉。與Holliday不同，此時只在一條DNA分子上出現異源雙鏈區(qū)。如果發(fā)生分支遷移，在兩條雙螺旋上均出現異源雙鏈區(qū)。隨后發(fā)生的連接分子的拆解與Holliday模型一樣。n但是更多的事實表明，重組是由雙鏈斷裂所啟動?，F在認為，同源重組是減數分裂的原因，而不是減數分裂的結果。DNA分子雙鏈斷裂才能與同源分子發(fā)生鏈的交換，藉以將同源染色體分配到子代細胞中去。因此，雙鏈斷裂啟動重組，也啟動了減數分裂。6.2.4 6.2.4 雙鏈斷裂重組模型雙鏈斷裂重組模型（model of double-strand

14、 breaks recombination） n一條染色體的兩條鏈都發(fā)生了斷裂，斷裂是由內切酶水解磷酸二酯鍵的結果。nDNA斷裂之后由核酸外切酶擴大缺口, 接著是斷裂鏈的游離3端插入到具有完整雙鏈的同源染色體中，形成D-環(huán)結構。n在DNA聚合酶的作用下，斷裂兩條鏈分別以完整鏈為模板開始合成, 最后再通過斷裂重接過程完成重組。在受體中形成雙鏈斷裂斷裂擴大為含有3端的間隙3端轉到其他的雙鏈體上3端的合成替換了間隙的一條鏈置換的鏈遷移到其他雙鏈體上DNA的合成發(fā)生于其他3端間隙被供體序列替代相互移動產生了雙交換6.3 重組和酶重組和酶n在原核生物同源重組中存在8個堿基組成的Chi位點（重組熱點） 5

15、 GCTGGTGG 3 3 CGACCACC 5 在E.coli中每隔約510 kb有一個拷貝nRec和Ruv蛋白參與重組。RecA蛋白蛋白nRecA具有單鏈具有單鏈DNA和雙鏈和雙鏈DNA的結合活性，的結合活性，能啟動能啟動DNA單鏈和與之互補的雙鏈分子進單鏈和與之互補的雙鏈分子進行堿基配對行堿基配對催化單鏈取代。催化單鏈取代。n RecA能促進能促進SOS反應中的蛋白酶活性。反應中的蛋白酶活性。 單鏈取代單鏈取代 (single-strand uptake)n其中一個DNA 分子要有單鏈區(qū)；n其中一個DNA 分子要有游離的3末端；n單鏈區(qū)和3末端可和另一DNA分子互補。 RecA具有的處理

16、DNA活性使一條單鏈能與一條雙鏈體中的同源部分發(fā)生置換，這個反應稱為單鏈同化。這個置換反應可發(fā)生在幾種不同構型的DNA分子之間，但要具備3個條件：在雙鏈體與單鏈分子之間RecA催化鏈交換只要其中的一條反應鏈有游離端, RecA就能促進入侵的單鏈同化于雙鏈體DNA中RecA蛋白介導的蛋白介導的DNA鏈交換模型鏈交換模型nRecBCD復合體具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。n在Chi位點產生單鏈3游離未端.nChi位點能夠改變RecBCD的酶活性。一旦RecBCD識別出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便發(fā)生變化，其35外切酶活性受到抑制，53外切酶活性被激活，由原來優(yōu)先降解3末端鏈，改變?yōu)橹?/p>

17、降解5末端鏈。但是它的解旋酶活性未受到影響。 nRecBCD酶活性變化的結果是產生3末端帶有Chi位點的ssDNA。RecBCD蛋白RecBCD核酸酶從一邊開始向chi位點前進, 當它前進時,它降解DNA, 在chi位點,它進行核酸內切, 而后失去RecD,并保留解旋酶活性.nRuvA可識別 Holliday的連接點結構nRuvB是ATPase，可發(fā)動遷移反應nRuvC是一種內切酶， 可特異識別Holliday分枝， 它在體外可切這個連接體，解離重組中間體。 Ruv 蛋白RuvAB是個不對稱的復合體，它推進Holliday結合點的分叉遷移損傷DNA的復制產生間隙RecA介導鏈交換第二鏈交換間隙

18、由DNA合成來填補RuvAB介導分叉遷移RuvC切除Holliday連接點6. 4 位點特異性重組位點特異性重組n位點特異性重組是發(fā)生在DNA上特定序列之間的重組，不依賴于DNA順序的同源性，由能識別特異DNA序列的蛋白質介導，并不需要RecA蛋白和單鏈DNA。6. 4 位點特異性重組位點特異性重組n噬菌體DNA侵入大腸桿菌細胞后，面臨著裂解生長和溶原生長的選擇。要進入溶原狀態(tài)，游離的噬菌體DNA要插入到宿主的染色體DNA中去，這個過程稱為整合（integration）。由溶原生長進入裂解生長，DNA又必須從宿主染色體上切除下來，這個過程稱為外切（excision）。n整合和外切 均需要通過細

19、菌DNA和DNA特定位點之間的重組來實現，這些位點稱為att位點（attachment site）。 n噬菌體的int編碼整和酶來催化整和反應。位點專一性重組的位點專一性重組的核苷酸序列核苷酸序列n1. POP: O為為15bp(核心核心)富含富含A-T的非對稱序列；的非對稱序列； P為為-160 0的的160bp序列序列 P為為0 80的的80bp序列序列n2. BOB: B為為-11 0序列序列 B為為0 11序列序列噬菌體的整合和切除噬菌體的整合和切除共共240bp共共23bp通過在通過在attB和和attP之間的之間的相互重組，噬菌體環(huán)狀相互重組，噬菌體環(huán)狀DNA轉變成線性的前噬菌轉變

20、成線性的前噬菌體；而通過在體；而通過在attL和和attR之間的相互重組，前噬菌之間的相互重組，前噬菌體能被外切出來。體能被外切出來。n-DNA對E.coli的整合： POP + BOB BOPPOB需要整合酶(Int拓撲異構酶活性)和整合宿主因子(IHF)參與n-DNA從E.coli的切離： BOPPOB POP + BOBn需要整合酶(Int)、整合宿主因子(IHF)和切除酶(Xis)參與。所有這些蛋白質都結合到attL和attR的P和P臂上，而attL和attR中央的核心序列并排對齊排列促進原噬菌體的切除。噬菌體的整合和切除噬菌體的整合和切除整合的過程:n具有對特異性DNA強烈親和力的I

21、nt與attP和attB位點結合；n Int的拓撲異構酶活性，使兩條雙鏈各自斷開一條單鏈，瞬間旋轉然后交換連接，形成Holliday中間體，n在另兩條單鏈之間發(fā)生同樣的斷裂重接，從而完成雙鏈間的重組。Int和IHF結合到attP的不同位點，在核心區(qū)域的Int識別位點包括被切割位點attB和attP的共同核心序列的交叉切割允許成十字架狀的連接，使相互之間能產生重組連接點。轉轉 座座l 在生物的基因組中存在一類特殊的在生物的基因組中存在一類特殊的DNA序列，它們能夠作序列，它們能夠作為獨立的單位從基因組的一個位置移動到另一個位置，這種能為獨立的單位從基因組的一個位置移動到另一個位置，這種能夠改變自

22、身位置的夠改變自身位置的DNA序列被稱為轉座子（序列被稱為轉座子（transposons）。）。 所有的轉座子都有兩個基本特征。所有的轉座子都有兩個基本特征。首先，轉座子的兩端為反向重復序列（首先，轉座子的兩端為反向重復序列（inverted repeatinverted repeat）。）。第二，轉座子至少含有一個編碼轉座酶（第二，轉座子至少含有一個編碼轉座酶（transposasetransposase）的基）的基因。因。很多轉座子還攜帶有與轉座不相關的基因，例如抗生素抗性很多轉座子還攜帶有與轉座不相關的基因，例如抗生素抗性基因、毒性基因等。這些基因位于轉座子內，隨轉座子一起基因、毒性基因

23、等。這些基因位于轉座子內，隨轉座子一起從一個從一個DNADNA分子移動到另一個分子移動到另一個DNADNA分子，對基因組的進化產生分子，對基因組的進化產生了十分重要的影響。了十分重要的影響。DNADNA轉座子轉座子 （一）細菌的（一）細菌的DNADNA轉座子轉座子1. 1. 插入序列插入序列 (insertion sequences, IS )(insertion sequences, IS )插入序列是最簡單的轉座子。典型的插入序列長插入序列是最簡單的轉座子。典型的插入序列長7507501500 1500 bpbp，具有，具有101040 bp40 bp長的末端反向重復序列。長的末端反向重復

24、序列。ISIS元件的兩個元件的兩個末端并非是十分精確的反向重復序列。末端并非是十分精確的反向重復序列。所有的所有的ISIS元件都含有一個編碼區(qū)，它編碼的轉座酶能識別元件都含有一個編碼區(qū)，它編碼的轉座酶能識別ISIS元件的末端重復序列，為一種介導轉座過程關鍵蛋白質元件的末端重復序列，為一種介導轉座過程關鍵蛋白質組分。轉座酶對組分。轉座酶對ISIS元件兩個邊界的識別保證了元件兩個邊界的識別保證了ISIS元件作為元件作為一個整體在基因組中移動。一個整體在基因組中移動。ISIS元件位于細菌的染色體上，也存在于噬菌體和質粒元件位于細菌的染色體上，也存在于噬菌體和質粒的的DNADNA分子中。在大腸桿菌的染

25、色體中發(fā)現了幾個拷貝分子中。在大腸桿菌的染色體中發(fā)現了幾個拷貝的的IS1IS1、IS2IS2和和IS3IS3。F F因子中沒有因子中沒有IS1IS1，但有一個拷貝的，但有一個拷貝的IS2IS2和兩個拷貝的和兩個拷貝的IS3IS3。當質粒和染色體上具有相同的。當質粒和染色體上具有相同的ISIS元件時，質?？梢酝ㄟ^同源重組整合到宿主細胞的元件時，質?？梢酝ㄟ^同源重組整合到宿主細胞的染色體上。染色體上。復合轉座子復合轉座子 (composite transposon ) 中心區(qū)攜帶有抗藥性標記中心區(qū)攜帶有抗藥性標記(Drug marker)(Drug marker)，兩側有，兩側有被稱為模塊（被稱為

26、模塊（modulemodule）的）的ISIS元件或類元件或類ISIS元件。元件。 每個每個ISIS元件都有以倒轉重復序列為末端的一般結元件都有以倒轉重復序列為末端的一般結構，所以復合轉座子也是以同樣的倒轉重復序列為構，所以復合轉座子也是以同樣的倒轉重復序列為末端的。有些復合轉座子兩側末端的。有些復合轉座子兩側ISIS序列是相同的序列是相同的 , ,另另一些例子中，模塊高度同源但不相同。與一些例子中，模塊高度同源但不相同。與ISIS序列一序列一樣，復合轉座子的轉座也會在靶基因組中產生短的樣，復合轉座子的轉座也會在靶基因組中產生短的正向重復。正向重復。Tn3Tn3 轉座子轉座子 Tn3 Tn3代

27、表另一類更為復雜的轉座子。這類轉座子的代表另一類更為復雜的轉座子。這類轉座子的兩個側翼序列不是兩個側翼序列不是ISIS或類或類ISIS序列，而是短的倒轉重復序列，而是短的倒轉重復序列；序列；Tn3Tn3的反向重復序列的長度是的反向重復序列的長度是38bp38bp。在兩個倒。在兩個倒轉重復序列之間有轉重復序列之間有3 3個基因。個基因。 A map of transposon Tn3.轉座的分子機制轉座的分子機制 轉座子可以通過兩種機制進行轉座。一種是保守型轉座轉座子可以通過兩種機制進行轉座。一種是保守型轉座（conservative transpositinconservative trans

28、positin），一種是復制型轉座），一種是復制型轉座（replicativereplicative transposition transposition）。在保守型轉座中，轉座元）。在保守型轉座中，轉座元件從供體位點上切除，然后插到靶位點上，因此這個機制又叫件從供體位點上切除，然后插到靶位點上，因此這個機制又叫做剪切粘貼轉座（做剪切粘貼轉座（cut-and-paste transpositioncut-and-paste transposition）。在復）。在復制型轉座中，轉座子被復制，轉座的制型轉座中，轉座子被復制，轉座的DNADNA序列是原座因子的一序列是原座因子的一個拷貝，而不是它

29、本身。因此，復制型轉座伴隨著轉座子拷貝個拷貝，而不是它本身。因此，復制型轉座伴隨著轉座子拷貝數的增加。數的增加。 1.1.保守轉座保守轉座 某些細菌轉座子某些細菌轉座子，包括很多包括很多ISIS元件和復合轉座子元件和復合轉座子，都，都是通過一種稱為剪切是通過一種稱為剪切粘貼機制進行轉座的。這種相粘貼機制進行轉座的。這種相對簡單的機制是一個保守的過程，即只有靶序列被復對簡單的機制是一個保守的過程，即只有靶序列被復制，而原始的轉座子則不發(fā)生復制。制，而原始的轉座子則不發(fā)生復制。2. 2. 復制型轉座復制型轉座 進行復制型轉座的轉座子除了具有編碼轉座酶的進行復制型轉座的轉座子除了具有編碼轉座酶的基因

30、外，還具有編碼解離酶（基因外，還具有編碼解離酶（resolvaseresolvase）的基因）的基因以及解離酶的作用位點，即內部解離位點以及解離酶的作用位點，即內部解離位點（internal resolution site, IRSinternal resolution site, IRS）。）。 69(四)真核生物DNA轉座子 1.1.玉米胚乳顏色的控制因子玉米胚乳顏色的控制因子花斑色是由于突變造成的，而且這種突花斑色是由于突變造成的，而且這種突變不是常規(guī)突變，是與一種變不是常規(guī)突變，是與一種“控制因子控制因子”（controlling element)的存在引起的。的存在引起的。（2）解釋

31、）解釋如果有如果有C基因，胚乳合成色素，呈紫色；基因，胚乳合成色素，呈紫色；如果如果C突變（突變（c），胚乳無色素，呈白色。），胚乳無色素，呈白色。在在c胚乳的發(fā)育過程中，部分細胞發(fā)生恢胚乳的發(fā)育過程中，部分細胞發(fā)生恢復突變（復突變（C），形成色斑。），形成色斑。突變發(fā)生的越早，色斑就越大。突變發(fā)生的越早，色斑就越大。（1）雜交結論 McClintock McClintock認為原來的認為原來的c c突變是由一個突變是由一個“可移動可移動的控制因子的控制因子”（現在稱轉座子）引起的，稱為（現在稱轉座子）引起的，稱為DsDs，即解離因子（即解離因子（dissociatordissociator）

32、。它可以插入到）。它可以插入到C C基因基因中。另一個可移動的控制因子是中。另一個可移動的控制因子是AcAc，稱激活因子，稱激活因子（activatoractivator），它的存在能夠激活），它的存在能夠激活DsDs轉座進入轉座進入C C基基因或其它基因，也能使因或其它基因，也能使DsDs從基因中轉出，使得突變從基因中轉出，使得突變基因回復突變成野生型基因，這就是著名的基因回復突變成野生型基因，這就是著名的Ac-DsAc-Ds系統。系統。（3）對突變的解釋：Ac-Ds系統為什么總是恢復突變、而且高頻率？為什么總是恢復突變、而且高頻率？McClintock認為認為C突變?yōu)橥蛔優(yōu)閏是由于一個是由于一個“可移動的控制因子可移動的控制因子”（transposable controlling element）的插入引起的，她）的插入引起的，她稱之為稱之為Ds（dissociator）。）。 解離因子解離因子Ds另外還有一個控制因子另外還有一個控制因子Ac（activator），），它能激活：它能激活： 激活因子AcDs插入插入C基因（引起突變），基因（引起突變），或從或從C基因中轉出（恢復突變）。基因中轉出（恢復