DNA復制與修復

1、勤不在三更五鼓 功只怕一曝十寒3 DNA的復制與修復DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立為DNA自我復制機制做了初步解釋，即堿基互補兩條鏈互補，堿基配對模板式復制。DNA復制中的問題1.細胞中的DNA是在雙鏈螺旋的基礎上進一步與蛋白質(zhì)形成染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)形式存在，而復制只在單鏈進行。2.在細胞周期中，DNA復制的起始和終止的調(diào)控。3.DNA分子很長，復制起始是隨機的，還是固定的？4.不同DNA分子如環(huán)形、線形DNA復制如何終止。5.DNA復制的酶和蛋白因子。6.DNA復制的保真機制。7.DNA序列多態(tài)性的形成機制。8.DNA損傷及修復機制。3.1 DNA復制概述為了保證遺傳的穩(wěn)定性，在每次細胞分裂之前，

2、遺傳信息載體必須精確地復制自己。遺傳信息的載體是DNA，但許多病毒的遺傳信息載體是RNA而不是DNA。3.1.1 DNA復制研究選材原核細胞是研究DNA復制的最佳的實驗系統(tǒng)。細胞小，生活周期短，易在人工條件下培養(yǎng)，原核生物易獲得各種突變體。原核生物中的大腸桿菌是在各方面研究最深入的一種。噬菌體（phage）是研究復制機制的一個重要實驗系統(tǒng)。優(yōu)點：基因組小，易操作；DNA分子有線形、環(huán)形、單鏈和雙鏈形式，可代表不同類型DNA的復制。如：線型，式，D型等復制。已研究過的典型噬菌體系統(tǒng)：Phage x174, T43.1.2 DNA復制的半保留性Watson和Crick發(fā)表了DNA雙螺旋模型之后又緊

3、接著發(fā)表了DNA半保留復制（semi conservative replication model）模型，這一建立在堿基互補基礎上的機制，為DNA的轉(zhuǎn)錄、修復、和分子雜交等奠定了基礎。DNA復制（replication）是在親代雙鏈DNA分子的每一條鏈上按堿基互補配對而準確地合成一條新的互補鏈，結(jié)果生成兩個與親代鏈相同的DNA雙鏈的過程。在半保留復制模型提出之前，普遍認為“蛋白質(zhì)和核酸是彼此互補的，DNA自我復制過程是通過核酸和蛋白質(zhì)的交替合成”。但Watson和Crick認為DNA自我復制時親本鏈保持不變，但雙鏈分成兩半，每個親本鏈作為復制的模板，子代雙鏈含有一條親本鏈和一條新合成的鏈。這就

4、是DNA復制的半保留模型。當時人們對半保留模型是持懷疑態(tài)度的，因雙螺旋模型中存在最大的問題是雙鏈是如何打開的？其所需的能量從何而來？Watson和Crick也承認這是“最大的問題”。人們?yōu)榱吮荛_打開雙鏈這個難題，又提出了全保留復制(conservative replication model)和分散(dispersive model)兩個模型。在全保留模型中兩條母鏈彼此結(jié)合，恢復原狀，新合成的兩條子鏈彼此互補結(jié)合形成一條新的雙鏈。在分散模型中親代雙鏈被切成雙鏈片段，而這些片段又可作為新合成雙鏈片段的模板，新、老雙鏈片段又以某種方式聚集成“雜種鏈”。后來通過實驗證實其中半保留模型是正確的。DNA

5、復制的3種假說3.1.2.1 半保留復制在DNA的半保留復制過程中復制區(qū)域雙螺旋解旋并分開，以每條單鏈為模板，按堿基互補配對原則，由DNA聚合酶催化合成新的互補鏈，結(jié)果由一條鏈成為互補的兩條鏈，這樣新形成的兩個DNA分子與原來的DNA分子的堿基序列完全相同。由于每個子代DNA的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復制方式稱為半保留復制(semi conservation replication)。3.1.2.2 半保留復制的證據(jù)Meselson和Stahl的實驗他們的同位素標記和密度梯度離心實驗支持了半保留復制方式。1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N作DNA標

6、記，而不用放射性同位素32P和14C。15N會導致DNA分子密度顯著增加，這樣可通過密度梯度離心將親本鏈和子代鏈區(qū)分開來。將大腸桿菌放在15NH4C1培養(yǎng)基中生長15代，使DNA被15N標記后，再將細菌移到只含有14NH4C1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別取0代、1代、2代、3代的細胞，提取DNA，進行密度梯度離心，分辨重鏈DNA、正常的輕鏈DNA和包含一條重鏈和一條輕鏈的DNA“雜種鏈”。離心后從管底到管口DNA分子就停留在與其相當?shù)腃sC1密度處，紫外光下可以看到形成的區(qū)帶。14N-DNA密度較輕，停留在離管口較近的位置；15N-DNA密度較大停留在較低的位置。當含有15N-DNA的細胞在14NH4

7、C1培養(yǎng)液中培養(yǎng)1代后，只有一條區(qū)帶介于14N-DNA與15N-DNA之間。培養(yǎng)2代后則在14N-DNA區(qū)又出現(xiàn)一條帶。有等量的“雜種鏈”和輕鏈密度。這些結(jié)果只與半保留復制模型相符。全保留模型可以排除，但分散模型卻不能排除。Meselson等又將第1代的14N/15N雜種鏈變性使雙鏈分開，再將變性前后的雙鏈和單鏈分別進行CsCl密度梯度離心。變性前雜種雙鏈只有一種帶，密度為1.717g/cm3，變性后兩條單鏈的密度不同而呈現(xiàn)了兩條帶，一條為15N帶，（1.740g/cm3），另一條為14N帶（1.725g/cm3）。作為對照的是從肺炎球菌（D. pneumoniae）中提取的DNA，變性前后都

8、只有一條帶，密度為1.700g/cm3。這一結(jié)果完全符合半保留復制預期的結(jié)果，并否定了全保留模型和分散模型。按照半保留復制方式培養(yǎng)兩代，只能出現(xiàn)14N和14N/15N兩種DNA分子，隨著代數(shù)的增加14N-DNA逐漸增加。而14N-15NDNA區(qū)帶逐漸減弱。Taylor的實驗真核細胞的每條染色單體是由一條DNA雙鏈組成，1958年Herbert Taylar用3H的胸腺密啶核苷酸處理蠶豆根尖細胞8小時，然后移入含有秋水仙素而沒有標記放射性的培養(yǎng)液中。經(jīng)標記處理后第一次分裂中期的染色體周圍均顯示放射性，每個染色體中有一條染色單體被標記，另一條染色單體未被標記。第二次分裂中期的染色體就只有一個顯示有

9、放射性，而另一個卻沒有。證明真核DNA復制也符合半保留模型。姐妹染色單體差別染色方法（sister-chromatid differential staining）在復制過程中用胸腺嘧啶的類似物5-尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，BUdR）可摻入到新合成的DNA中。在兩細胞周期之后，一條染色單體中含有DNA分子的雙鏈都被BrdU取代，而另一條染色單體只有一條DNA單鏈中含有BrdU。若用熒光染料染色，DNA雙股都含有Brdu的染色單體的熒光強度要小于DNA的單股含BrdU的染色單體的熒光強度，在熒光顯微鏡下可觀察到兩條姐妹染色單體的熒光強弱不同。若用Giemsa染色，當雙鏈都

10、插入5-BudR時則染不上Giemsa，而一條插入5-BudR則可染色。若細胞的培養(yǎng)基加入5-BudR則第二復制周期時，兩條姊妹染色體染色狀況不同，一明一暗，稱花斑染色體。3.1.3 DNA復制過程的順序性3.1.3.1 邊解鏈邊復制DNA的復制是邊解鏈邊合成從SV40復制的早期電鏡照片可見復制部分和未復制部分。3.1.3.2 復制起點DNA復制是從DNA分子上特定位置（原點，origin）開始，此位置稱復制起點(Origin of replication，ori)。復制起點（origin）是DNA復制所必需的一段特殊的DNA序列。噬菌體、細菌染色體、質(zhì)粒和一些動物病毒的DNA通常具有明顯的復

11、制起點。酵母也有特異的復制起點，在細胞周期S期染色體復制時起重要的作用。真核生物的復制起點很復雜，現(xiàn)在還難于在分子水平上闡明其特征。大多數(shù)原核生物基因組和細菌質(zhì)粒只有一個Ori位點，而真核生物染色體中有多個Ori。例如，果蠅染色體DNA約有3000個Ori位點，釀酒酵母第17號染色體中至少有400個Ori。3.1.3.3 復制方向DNA復制方向的可能性。研究DNA復制的方向常用溫度敏感性變異菌株結(jié)合放射自顯影技術(shù)。大腸桿菌的一個溫度敏感株在42時能使DNA在完成復制后不再開始新的復制過程，而在25時復制功能恢復。將此溫度敏感株在同一時間開始復制，細菌同步生長。先將這種同步生長的突變株在含高比度

12、3H-TdR中生長幾分鐘，再移入低比度3H-TdR中作脈沖標記。然后對菌體DNA作放射自顯影分析。若復制是單向的，僅有一個高比度區(qū)，且高比度與低比度的放射性分布應該鄰近。若復制是雙向的，有兩個分離的低比度放射性分布區(qū)。DNA可進行單向和雙向復制，大多數(shù)DNA的復制是雙向的。有些病毒（如腺病毒、29噬菌體等）及線粒體DNA的復制是單向進行的，滾筒式屬單向復制。SV40為5224bp的環(huán)形分子，有1個EcoR切點。中用EcoR酶切復制中的SV40得到復制眼大小不同的系列DNA分子，可見隨復制眼擴大兩側(cè)DNA變短，說明復制從原點開始雙向復制。真核一般為多起點復制。也可利用變形對DNA電泳遷移的作用來

13、確定復制原點。例如用二維作圖方法，即復制中DNA的限制性片段在第一維方向進行電泳，按分子量的大小分離。再在第二維方向電泳，第二維方向電泳移動主要由形狀決定。不同復制中分子會有不同的路徑，這可以通過它偏離雙倍大小線形DNA分子的路線的程度來確定。復制起點的位置和復制叉的數(shù)目決定了限制性復制片段的形狀，這些形狀可通過不同的電泳路跡(實線)顯示出來。虛線顯示線形DNA的電泳路跡。DNA正在復制的分叉部位稱為復制叉（replication fork）非復制DNA的旁邊復制的DNA在電鏡下象只眼睛稱復制眼（泡）3.1.4 DNA的半不連續(xù)復制DNA復制是半保留復制，且是半不連續(xù)復制(Semi-disco

14、ntinuous replication)。DNA雙螺旋的兩條鏈是反向平行的，因此，在復制起點處兩條DNA鏈解開成單鏈時，一條是53方向，另一條是35方向。DNA復制時，新生鏈延伸方向一條為35，另一條為53。但生物細胞內(nèi)所有催化DNA聚合酶都只能催化53延伸。3.1.4.1 半不連續(xù)復制的證據(jù)Okazaki（岡崎）于1968年通過H3脫氧胸苷（H3dT）標記實驗證明了半不連續(xù)復制。實驗材料T4感染的E.coli：野生型phageT4；mutant T4（連接酶突變）實驗系統(tǒng)H3dT標記E.coli；phageT4感染；密度梯度離心。檢測標記DNA在不同時間合成的情況。實驗結(jié)果：短時間內(nèi)，首先

15、合成較短的DNA片斷（岡崎片段），接著出現(xiàn)較大的DNA分子。突變型連接酶T4中，大片段DNA很少或無。半不連續(xù)合成，放射性標記一半出現(xiàn)于短片段（岡崎片段），另一半出現(xiàn)在長片段DNA中。結(jié)論：DNA復制是半保留半不連續(xù)復制。3.1.4.2 半不連續(xù)復制在復制起點兩條鏈解開形成復制泡(replication bubbles)，DNA向兩側(cè)復制形成兩個復制叉(replication forks)。以復制叉移動的方向為基準，一條模板鏈是35，以此為模板的新生DNA鏈合成沿53方向連續(xù)進行，這條鏈稱前導鏈(leading strand)。另一條模板鏈的方向為53，以此為模板的新鏈合成方向也是53，但與復

16、制叉前進方向相反，且是分段的不連續(xù)合成，這條鏈稱滯后鏈(lagging strand)，合成的片段為岡崎片段(Okaxaki fragments)。岡崎片段由DNA連接酶連成完整的DNA鏈。前導鏈的連續(xù)復制和滯后鏈的不連續(xù)復制，稱為DNA合成的半不連續(xù)復制。3.1.5 復制子DNA復制從起點開始雙向進行直到終點為止。復制子(replicon)復制子或復制單元是基因組中具有一個復制起點（origin，ori）和一個復制終點（terminus，ter）并能在細胞中自主復制的單位。原核生物中，只有一個復制原點，每個DNA分子上只有一個復制子；真核生物中，每個DNA分子有多個復制子，每個復制子長約50

17、-200kb；其DNA復制是由多個復制子共同完成的。每個細胞中，染色體DNA復制子一般只復制一次。大腸桿菌DNA復制1次需42min；人類復制叉前進100bp/s，復制整個基因體需8hr；果蠅復制整個基因體僅需34分鐘。染色體外遺傳元件的復制子染色體外遺傳元件包括：原核生物細胞中的質(zhì)粒和噬菌體；真核生物細胞中的線粒體、葉綠體和病毒的DNA。染色體外遺傳元件一般為單復制子（只有一個origin），但為多次復制，為多拷貝。真核生物的線粒體和葉綠體復制一般與核DNA同步或稍滯后；原核生物的染色體DNA和質(zhì)粒（噬菌體）一般不同步，但整合后同步。質(zhì)粒整合前為式或滾筒式復制，整合后為一個復制子。質(zhì)粒為雙向

18、復制。E.coli溫敏型突變體在30復制正常，42時，E.coli復制起動受阻，而以質(zhì)粒origin開始的單向復制。說明復制起始是受調(diào)控的。3.2 原核生物DNA的復制3.2.1 DNA的復制酶和相關(guān)蛋白DNA復制實際上就是DNA指導的DNA合成代謝，需要有DNA作為復制的模板。體外復制實驗證明，新合成DNA的特異性完全取決于事先加入的模板DNA。三磷酸核苷酸(dNTP)是合成原料。細胞內(nèi)還有許多酶和蛋白質(zhì)參與DNA的復制。3.2.1.1 解旋酶(Helicase)DNA復制時，解旋酶在ATP的作用下可促使DNA母鏈不斷解開形成單鏈。大腸桿菌中的解旋酶DnaB作為引發(fā)體的成員，參與復制叉的形成

19、，并結(jié)合于一個復制叉，利用ATP水解的能量解開雙螺旋，推動復制叉向前延伸。3.2.1.2 單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)解旋酶沿復制叉方向推進產(chǎn)生了一段單鏈區(qū)，細胞內(nèi)大量的單鏈DNA結(jié)合蛋白(single strand DNA binding protein SSB)能和單鏈DNA結(jié)合，防止其重新配對形成雙鏈DNA。單鏈結(jié)合蛋白通過與磷酸骨架結(jié)合使DNA單鏈相互分開，它們離開暴露的堿基，所以那些堿基可以作為DNA合成的模板。SSB與解旋酶不同，它不具備酶的活性。在大腸桿菌細胞中主要SSB是177肽所組成的四聚體，可以和單鏈DNA上相鄰的32個核苷酸結(jié)合。SSB的作用：使DNA單鏈保持一種伸展構(gòu)象

20、，作為模板；使解開的單鏈不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；保護DNA單鏈不受Dnase水解。SSB結(jié)合DNA單鏈有協(xié)同性(cooperative binding)：一個SSB四聚體結(jié)合于單鏈DNA上可以促進其他SSB四聚體現(xiàn)相鄰的單鏈DNA結(jié)合。SSB可以重復使用，當新生的DNA鏈合成到某一位置時，該處的SSB便會脫落，并被重復利用。3.2.1.3 DNA拓撲異構(gòu)酶(DNA Topisomerase)拓撲異構(gòu)體（topoisomer)：具有不同螺旋數(shù)的同一DNA分子兩種異構(gòu)體。拓撲異構(gòu)酶：可使DNA的兩種拓撲異構(gòu)體互變的酶。DNA在細胞內(nèi)以超螺旋狀態(tài)存在，DNA拓撲酶催化同一DNA分子不同超螺旋狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。

21、拓撲異構(gòu)酶的功能：與DNA形成共價結(jié)合中間體，使DNA磷酸二酯鍵斷裂，形成DNA nick，DNA的一條鏈進行解旋，旋轉(zhuǎn)而改變DNA分子的拓撲狀態(tài)。拓撲異構(gòu)酶可使DNA發(fā)生連環(huán)化（catenate）、脫連環(huán)化（decatenate）、打結(jié)（knot）和解結(jié)（unknot）。拓撲異構(gòu)酶參與DNA的復制、轉(zhuǎn)錄的重組等過程。拓撲異構(gòu)酶的種類分為型和型。原核拓撲構(gòu)酶：MW=100kD，單肽鏈，含34個Zn。作用是暫時切斷一條DNA鏈，形成酶-DNA共價中間物而使超螺旋DNA松弛，然后再將切斷的單鏈DNA連接起來。每次改變一個連環(huán)數(shù)。原核拓撲構(gòu)酶作用機制：酶與DNA結(jié)合使雙鏈解旋；使一條鏈切開，但酶與切

22、口的兩端結(jié)合阻止了螺旋的旋轉(zhuǎn)；酶使另一條鏈經(jīng)過缺口，然后再將兩斷端連接起來；酶從DNA上脫落，兩條鏈復原，得到的DNA比原來少一個負超螺旋。拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶也稱旋轉(zhuǎn)酶。廣泛存在于各種生物中。使正超螺旋轉(zhuǎn)化為負超螺旋，每次改變兩個連接數(shù)。大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNA gyrase)，能將負超螺旋引入DNA分子，在ATP供能時酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈DNA。幾乎所有天然狀態(tài)的雙鏈DNA均以負超螺旋的方式存在，特別是進行半保留復制的DNA均以種種拓撲異構(gòu)體的形式存在。負超螺旋是DNA復制的必需條件，負超螺旋可使DNA雙鏈堿基對打開所需要的能量降低4.1KJ/mol，因而，有利于DNA的

23、雙鏈分開。真核生物拓撲異構(gòu)酶酵母、兩棲類動物、昆蟲、哺乳動物和植物的拓撲異構(gòu)酶的特性相似，但與原核的酶有明顯差異。型：MW=95kD，單體蛋白，不需ATP。型拓撲異構(gòu)酶型拓撲異構(gòu)酶剪切一條鏈二條鏈機制酶非共價與DNA結(jié)合。一條鏈剪切，3-P基團共價與激活位點的酪氨酸殘基結(jié)合。未剪切的鏈從缺口處通過。打斷的鏈重新連接。酶非共價與DNA結(jié)合。兩條鏈都剪切，5-P基團共價與激活位點的酪氨酸殘基結(jié)合(這涉及對回旋酶和真核拓撲異構(gòu)酶有4bp交錯)。未被切割的雙鏈通過構(gòu)象改變從缺口通過。打斷的雙鏈重新連接。需要ATP不是大腸桿菌topo I(蛋白)、topo釋放負超螺旋回旋酶(topo) ：誘導負超螺旋t

24、opo IV：去連接連鎖的環(huán)真核拓撲異構(gòu)酶：釋放正和負超螺旋拓撲異構(gòu)酶：釋放負超螺旋(弱活性)，不去連接拓撲異構(gòu)酶：釋放正和負超螺旋拓撲異構(gòu)酶：釋放負超螺旋，可能也能釋放正超螺旋型：MW=150180kD，均為二聚體，需ATP和Mg2+。3.2.1.4 引物酶(Primase)引物酶以單鏈DNA為模板，利用核糖核苷酸合成RNA（610nt）作為DNA合成的引物。引物的意義在于減少致死突變。DNA合成中最初幾個核苷酸正確性遠比其后的低。引物RNA隨后被降解，從而減少了復制錯誤。DNA合成以RNA為引物的實驗證據(jù)Reiji 以32PdNTP標記未標記NTP為底物。引發(fā)合成后，用稀堿處理。32P出現(xiàn)

25、在水解產(chǎn)物中（RNA水解），證明RNA為引物。引物酶催化引物RNA分子的合成，但它不同于RNA聚合酶。引物酶對雷米封不敏感，而RNA聚合酶則敏感；引物酶只在復制起點處合成RNA引物而引發(fā)DNA的復制，而RNA聚合酶則是啟動DNA轉(zhuǎn)錄合成RNA從而將遺傳信息由DNA傳遞到RNA。大腸桿菌的引物酶由一條多肽鏈組成，MW為60KD，每個細胞中有50100個分子，由大腸桿菌的dnaG基因編碼。但在單鏈噬菌體M13 DNA和質(zhì)粒Co1E1 DNA復制時，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。噬菌體T7的Gene4蛋白，T4的Gene41和61蛋白等也具有引物酶的活性和具有大腸桿菌引物酶相似的功能。3.2.1

26、.5 DNA聚合酶(DNA Polymerase)DNA聚合酶的性質(zhì)以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA；需要模板和引物的存在；不能起始合成新的DNA鏈；催化dNTP加到生長中DNA鏈的3-OH末端；催化DNA合成的方向是53。原核DNA聚合酶有三種：DNA polymerase 、DNA polymerase 和DNA polymerase 生化教研室幻燈片96DNA pol的發(fā)現(xiàn)1956年，Kornberg用無細胞E.coli系統(tǒng)證明DNA是模板合成。1957年發(fā)現(xiàn)DNApol。大腸桿菌DNA polymerase 1956年Kornberg發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，又稱Kornbe

27、rg酶。此酶已經(jīng)研究清楚且代表了其他DNA聚合酶的基本特點。酶的性質(zhì)DNA pol由一條多肽鏈組成，約含1000個氨基酸殘基，MW為109KD。分子含有一個二硫鍵和一個SH基。每個分子中含有一個Zn2+，在DNA聚合反應起著很重要的作用。每個大腸桿菌細胞中含有約400個分子，每個分子37下能催化667nt/min摻入正在生長的DNA鏈。DNA pol可被枯草桿菌蛋白酶裂解成2個片段，大片段MW為76KD，稱為Klenow片段，具聚合酶和35外切酶的活性，由兩個結(jié)構(gòu)域組成。小片段的MW為34KD，具有53外切酶活性。DNA Pol在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約65Å，在酶的縱軸上有一個約

28、20Å的深溝(cleft)，帶有正電荷，是酶的活性中心位置。酶的活性中心位置上至少有6個結(jié)合位點：a. 模板DNA結(jié)合位點；b. DNA生長鏈或引物結(jié)合位點；c. 引物末端結(jié)合位點；d. 脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點；e. 53外切酶活性位點，用以結(jié)合生長鏈前方的5-端脫氧核苷酸并切除之；f. 35外切酶活性位點，用以結(jié)合和切除生長鏈上未配對的3-端核苷酸。酶的功能a. 聚合作用在引物的3-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNA pol逐個聚合上核苷酸。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結(jié)合位點后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化

29、，促進3-OH與5-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。b. 35外切酶活性（校對作用）35外切酶活性是從35方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。錯誤核苷酸進入pol的結(jié)合位點不能與模板配對，無法改變酶的構(gòu)象而被35外切酶活性位點所識別并切除。在T4噬菌體突變株中分離得到的T4 DNA聚合酶的35外切酶活性很低，使DNA復制的真實性降低，而易發(fā)生突變。具有抗突變能力的T4突變株中的DNA聚合酶的35外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復制真實性好，變異率低。35外切酶活性的主要功能是校對作用。維持了DNA復制真實性。c. 53外切酶活性（切除修復作用）：53外切酶活性是從53方向水解DN

30、A生長鏈前方的DNA鏈。它只作用具切口的雙螺旋DNA，并在切口以外的配對區(qū)切割。53外切酶活性在DNA損傷的修復中可能起著重要作用。對岡崎片段5-末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性（每次能切除10nt）。DNApol聚合酶活性和53外切酶活性協(xié)同作用雙鏈DNA上的單鏈切口可激活DNA pol的53外切酶活力，從切口的5-端切除舊鏈，同時從切口開始合成新鏈，可使DNA鏈上切口向前推進，產(chǎn)生缺口平移(nick translation)，即沒有新DNA合成，只有核苷酸交換。缺口平移可從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣?32P-dNTP，則重新合成的新

31、鏈為帶有同位素標記的DNA分子，可以用作探針進行分子雜交實驗。DNA pol不是大腸桿菌中DNA復制的主要酶。a. 體內(nèi)DNA合成速率比純化的DNA pol催化dNTP摻入速率（667nt/min）高20倍；b. 大腸桿菌的一個突變株中，pol的活力正常，但染色體DNA復制不正常；c. 在一些突變株中，pol的活力只是野生型的1%，但DNA復制卻正常，而此突變株對輻射和化學誘變劑卻高度敏感。DNA pol在DNA修復中起著重要的作用。大腸桿菌DNA pol 1970年發(fā)現(xiàn)DNA pol。MW為120KD，每個細胞內(nèi)約有100個酶分子，但活性只有DNA pol的5%。聚合作用:pol催化DNA的

32、聚合，它最適模板是雙鏈DNA而中間有小空隙(gap，50200nt)的單鏈DNA部份。pol具有35外切酶活性，但無53外切酶活性。pol缺陷的大腸桿菌突變株的DNA復制正常。表明pol不是DNA復制的主要酶，它可能在DNA損傷修復中起一定作用。大腸桿菌DNA polDNApol 的發(fā)現(xiàn)DNApol的合成DNA，參入nt的速率為600nt/min，但實際測定數(shù)約12000nt/min，比DNA pol 的催化速率大20倍。遺傳分析表明，DNA復制涉及多種基因，但DNA pol是單肽鏈。1969年，Cairns發(fā)現(xiàn)E.coli的一種突變體的細胞抽提液，雖然反應顯示1%的DNA pol活力，但該突

33、變體能以正常速率繁殖。突變體對紫外輻射和化學誘變十分敏感，表明可能存在另一種DNA pol。DNA pol 是至少以10種亞基組成的復合物參與DNA的復制，此復合物稱為DNA聚合酶全酶。a、e及q亞基構(gòu)成核心聚合酶(core polymerase)。a具有聚合酶；e有35核酸外切酶的活力。b構(gòu)成聚合酶的卡箍(clamp)，結(jié)合在DNA模板鏈上。DNA聚合酶的主要亞基及其裝配層次組成亞基 MW(×103) 組裝層次 a 130 27.5 10 71 47.5 35 33 15 12 40.6pol pol pol *全酶復合體生化教研室幻燈片118生化教研室幻燈片119層次 持續(xù)性 刺

34、激因子pol 10 無pol 60 亞精胺pol * 200 SSB全酶 105 SSBpol 全酶的結(jié)構(gòu)是一種非對稱二聚體。pol 在細胞內(nèi)數(shù)量少（每個大腸桿菌細胞中只有1020個酶分子），但催化dNTP摻入DNA鏈的速率是DNA pol的15倍。pol具有聚合酶和35外切酶活性。DNA pol 是細胞內(nèi)DNA復制所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度(non permissive temperature)內(nèi)是不能生長的，此種突變株的裂解液也不能合成DNA，但加入pol 則可以恢復其合成DNA的能力。3.2.1.6 DNA連接酶(DNA ligase)DNA在隨后鏈上的復制是不連續(xù)的，合

35、成的DNA片段需要連接酶連接。DNA連接酶的主要功能是借助ATP或NAD水解提供的能量，催化雙鏈DNA上的單鏈間隙的5-端與3-端生成磷酸二酯鍵，封閉DNA雙鏈上的缺口。DNA連接酶的作用條件被連接的兩鏈必須與另一鏈（模板鏈）互補； 兩鏈相鄰；每次只能連接一個切口；使一條鏈的5-P與另一鏈的3-OH形成磷酸二酯鍵。連接能量來自NAD（如E.coli或T4誘導的連接酶，動、植物中的酶）。缺口缺失核苷酸不連接。連接酶作用機制NAD+或ATP將其腺苷?；D(zhuǎn)移到DNA連接酶的1個Lys殘基的-NH2上。酶-腺苷酸中間物上的腺苷?；D(zhuǎn)移到DNA的5-磷酸基端。被激活的5-磷?；撕虳NA的3-OH端生成

36、磷酸二酯鍵。DNA連接酶催化的連接反應是可逆的。逆反應過程可在AMP存在時，使共價閉環(huán)超螺旋DNA產(chǎn)生有缺口的DNA-腺苷酸，生成松弛的閉環(huán)DNA。大腸桿菌的DNA連接酶(MW 75KD)被胰蛋白酶水解形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶與NAD（不是ATP）反應形成酶-AMP中間物，但不能繼續(xù)將AMP轉(zhuǎn)移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。大腸桿菌細胞中約有300個分子的DNA連接酶。與DNA聚合酶的分子數(shù)相近。連接酶在DNA復制、修復和重組中起重要作用，連接酶有缺陷的突變株不能進行DNA復制、修復和重組。在真核生物細胞中的DNA連接酶，分為連接酶和，反應中利用ATP所提供的能量。DNA連接酶

37、分子量約為200KD，主要存在于生長旺盛細胞中，DNA連接分子量約85KD，主要存在于生長于不活躍的細胞中(resting cell)。在DNA復制過程中還有許多蛋白質(zhì)參與，如大腸桿菌細胞中就有三十多種蛋白質(zhì)參與DNA復制，許多蛋白質(zhì)的功能目前尚不明了。DNA復制過程中還有許多未知的因子參與，DNA復制過程中許多具體的細節(jié)尚不十分清楚。T4Ligase(連接酶)特性可連接DNA與DNA，也可連接RNA與RNA。可連接DNA中的單鏈切口，也可連接粘性末端切口和平齊末端切口。T4Ligase可作為重組工具酶。3.2.2 原核生物DNA復制的引發(fā)盡管原核生物是較簡單的單細胞生物體，但其復制過程很復雜

38、，并且是一個順序性過程，涉及到多種酶和蛋白因子，是這些酶和蛋白因子協(xié)同作用的結(jié)果。對E.coli DNA復制機制的認識是利用E.coli突變體和x174的復制進行初步研究的結(jié)果。研究方法：獲得突變體，對突變基因研究獲得其功能；反義RNA基因工程；點突變基因工程。大腸桿菌復制基因利用噬菌體研究原核DNA復制噬菌體DNA有線型、環(huán)型、單鏈、雙鏈，其復制機制可表明各種形式的DNA復制模式；噬菌體利用寄主的基因產(chǎn)物進行復制，復制行為與寄主相似。3.2.2.1 M13噬菌體復制的引發(fā)M13基因組為6407nt的單鏈環(huán)狀DNA分子，在54805820nt間有5個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中第3個最重要，有59個nt，此

39、雙鏈區(qū)是一個復制起始的信號。M13利用宿主細胞的RNA聚合酶起始RNA的合成，在發(fā)夾結(jié)構(gòu)前6nt，開始合成引物RNA。對于RNA聚合酶如何識別這個發(fā)夾結(jié)構(gòu)作為起始位點的還不清楚，可能還涉及其他一些蛋白質(zhì)。合成2030nt的RNA鏈后就破壞了發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由于形成RNADNA雜交體，就把另一半發(fā)夾結(jié)構(gòu)釋放出來。因此，SSB就結(jié)合到這段序列上。DNA pol III以RNA為引物合成DNA鏈直到RNA引物的開始處。引物被DNA pol I切除并補齊因RNA切除后形成的空缺，切口再由連接酶連接起來。G4噬菌體(5577nt)的復制與M13的不同之處在于它不是由RNA聚合酶起始復制，而是由引物酶直接結(jié)合到

40、不能結(jié)合SSB蛋白的發(fā)夾結(jié)構(gòu)上，引物酶合成一段2629nt，互補于發(fā)夾結(jié)構(gòu)一條鏈的RNA。DNA鏈在RNA 3-OH上延長，此后的反應和M13是相同的。因此，M13的復制能被RNA聚合酶的抑制劑利福平所抑制，而G4和X174的復制則不被利福平所抑制。泳道1：引物合成時不加dNTP；2：引物合成后加入dNTP；3：起始反應時加入dNTP和NTP3.2.2.2 x174的復制X174的復制比M13和G4復雜，需要更多的蛋白質(zhì)因子參與，形成一個類似大腸桿菌中的復制引發(fā)體，并且可能在幾個位點起始DNA的合成，可作為岡崎片段合成起始的范例。x174的復制模式x174的DNA復制除模板外，復制系統(tǒng)均由寄主

41、提供。x174（+）鏈（SS）®合成x174（-）鏈，形成RF x174（SSRF）®RF繁殖（RFRF）®新的x174（+）鏈產(chǎn)生（RFSS）fX174的()鏈合成(SSRF)fxl74的(+)鏈進入寄主細胞，除分子中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)外，其它部分被SSB覆蓋。()鏈合成(SSRF)需引物體(primosome)參與。在基因F和G間的70nt片段是引物體組裝位點(primosome assembly site，pas)，pas形成44nt組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可被PriA識別，在PriB和PriC參與下形成復合物。由PriA、PriB和PriC組成的復合物與DnaT、DnaB和

42、DnaC組裝成預引物體(preprimosome)。其中DnaB和DnaC形成由ATP穩(wěn)定化的B6C6復合物。預引物體與引物酶（DnaG）結(jié)合成引物體。引發(fā)體在pas位點上形成，但引物合成是在很多位點上，表明引發(fā)體可沿著單鏈DNA引發(fā)位點移動。當引物合成后，PriA水解ATP引起DnaB變構(gòu)而降低與單鏈DNA的親和性，移動到另一個起始位點，ADP又被ATP取代，引物酶能穩(wěn)定DnaB·ATP·ssDNA復合物，開始另一個引發(fā)反應。引發(fā)體至少含DnaB、PriA和引物酶。PriA可識別pas位點，并且還具有水解ATP和置換SSB的活性，這對引發(fā)體移動到其它位點進行引發(fā)非常重要。

43、M13和G4僅有一個引發(fā)點。DNAPol全酶從引物延伸合成DNA片段。引發(fā)體移動的方向同DNA鏈延長方向相反，這說明雙鏈DNA復制時，隨從鏈合成岡崎片段的情形。當復制叉向前移動時，在引發(fā)體前方就形成單鏈，每一次引發(fā)反應以后，引發(fā)體就沿著單鏈向前移動到下一個岡奇片段合成開始的位點。因此，引發(fā)物移動的方向同復制叉相同，同隨從鏈DNA合成方向相反。Pol切除RNA引物填補缺口，連接DNA片段。形成的雙鏈DNA稱為RF。引物體繼續(xù)與DNA相結(jié)合以備參與(+)鏈的合成。fxl74()鏈合成是不連續(xù)的。fX174的(+)鏈合成(RFSS)(+)鏈合成涉及噬菌體編碼的gpA和大腸桿菌的Rep。gpA（60k

44、D）對(+)鏈原點具有專一性的核酸內(nèi)切酶活力。gpA的功能是引發(fā)復制起始。gpA借引物體結(jié)合于識別位點，專一性切割4305和4306間的磷酸二酯鍵產(chǎn)生切口。gpA通過其酪氨酸殘基與4306位5端結(jié)合，保存鏈能。Rep蛋白結(jié)合于gpA處的()鏈。Rep蛋白從(+)鏈使gpA復合物從(+)鏈的5端開始使雙鏈DNA解鏈，分離出的(+)鏈被SSB保護。pol全酶從(+)鏈3端使DNA鏈不斷延伸，形成環(huán)化的滾環(huán)結(jié)構(gòu)(looped rolling structure)。而原來的(+)鏈在復制叉移動時仍與gpA相連，如同逐步被剝離。復制繞()鏈超過完整一周后產(chǎn)生1個雙股復制原點，gpA在此再做專一切割，再與

45、新形成的5端共價結(jié)合，gpA的第2次切割產(chǎn)生單位長度的fX174 DNA，它的3-OH向gpA5-P做親核攻擊形成環(huán)狀分子（+鏈）。每個gpA分子含2個活性酪氨酸，故可完成相繼地切割，并與5-端相連。在由fx174感染的中期，每個新合成的(+)鏈指導()鏈合成從而形成RF。在感染的后期，新合成的(+)鏈通過噬菌體編碼的病毒成熟蛋白和衣殼蛋白(gpB、E、D、F、G和H)形成新的病毒粒子。x174（-）鏈合成為隨后鏈復制模式?？捎糜谘芯縀.coli隨后鏈的合成機制，不連續(xù)合成。x174（+）鏈合成為主導鏈復制模式。可用于研究E.coli主導鏈的合成機制。連續(xù)合成。大腸桿菌基因組是雙股環(huán)形DNA，

46、其復制是由單一原點（origin）開始的q式復制。origin處形成復制叉，經(jīng)過先導鏈的連續(xù)復制和滯后鏈的不連續(xù)復制，到達終點完成復制。3.2.2.3 E.coli DNA復制的引發(fā)E.coli的DNA復制起始指從origin（原點）開始的 起始過程，這一過程不同于隨后鏈上岡崎片段的起始。DNA復制的引發(fā)包括：起始識別解鏈解旋引發(fā)體組裝。（由于解鏈導致正螺旋加大最終導致難以解開所以要解旋）復制原點（origin)DNA復制不是隨機的從DNA分子上的任何一點起始，而是從特定的區(qū)域開始。大腸桿菌的復制起始點(oriC)位于其基因組天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操縱子間，oriC包含245bp。ori

47、的特性復制起點幾乎都是富含A-T的序列；已經(jīng)分離出大腸桿菌染色體DNA復制起點oriC。由245bp的DNA片段組成。oriC含有2個系列的重復單位，其中有3個13bp重復序列和4個9bp重復序列，均富含AT。ori在所有細菌復制起始位點中都是保守的oriC在不同原核生物中有同源性，很多細菌的ori區(qū)在結(jié)構(gòu)上相似，在序列上有相當?shù)谋Ｊ匦?，且在分類關(guān)系上愈接近的細菌間其同源性愈高，表明DNA復制起點的重要性。將一個復制起點連接到任一DNA上，都能支持其復制。9bp（A位點）為DnaA蛋白識別位點。引發(fā)體的形成復制開始的是形成引發(fā)體，這需要很多蛋白因子的參與。DnaA蛋白識別起始序列并結(jié)合于ori

48、C（復制起始點）的9bp重復序列，形成oriC負超螺旋包裹在外，2040個DnaA蛋白在內(nèi)的復合物。HU蛋白參與并促進DnaA蛋白識別3個13bp串聯(lián)重復序列使DNA熔鏈形成開放復合物。用核酸酶P1（作用ssDNA單鏈DNA）證明解鏈部分約為45bp。DnaB和DnaC（引發(fā)體成員）蛋白進入熔鏈區(qū)形成前引物復合體。SSB結(jié)合在被解開的單鏈上，由PriA、PriB、PriC、DnaT、DnaB和DnaC等6種蛋白質(zhì)組成引發(fā)前體(preprimosome)。引發(fā)前體進一步與引物酶(DnaG，primase)組裝成引發(fā)體(primosome)。在SSB和旋轉(zhuǎn)酶（拓撲異構(gòu)酶）的參與下，引發(fā)體可在單鏈D

49、NA上移動，在DnaB亞基的作用下識別DNA復制起點位置。引發(fā)體先在前導鏈上由引物酶催化合成RNA引物，此過程稱為轉(zhuǎn)錄激活(transcriptional activation)。DNA pol組裝和復制叉上二聚體形成。引發(fā)體在滯后鏈上沿53方向相對移動，并在模板鏈上斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成滯后鏈的引物RNA，供DNA聚合酶合成岡崎片段使用。在RNA引物3端DNA開始聚合。許多因子協(xié)同作用才使引發(fā)體在滯后鏈上移動，識別合適的引物合成位置，并將核苷酸在引發(fā)位置上聚合成RNA引物。在同一種生物體細胞中這些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滯后鏈模板上比較特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。R

50、NA引物形成后，DNA pol 的亞基組裝成非對稱DNA聚合酶二聚體，它催化將第一個脫氧核苷酸按堿基互補原則加在RNA引物3'-OH端而進入DNA鏈的延伸階段。3.2.3 DNA鏈的延伸3.2.3.1 正超螺旋的消除螺旋酶在復制叉處邊移動邊解開雙鏈，DNA聚合酶催化DNA新生鏈的合成。DNA解鏈時必產(chǎn)生正超螺旋，當達到一定程度后就會造成復制叉難以繼續(xù)前進而終止DNA復制。而細胞內(nèi)DNA復制不會因出現(xiàn)拓撲學問題而停止。解除正超螺旋的機制DNA在生物細胞中本身就是負超螺旋，當DNA解鏈而產(chǎn)生正超螺旋時，可以被原來存在的負超螺旋所中和。DNA拓撲異構(gòu)酶可打開一條鏈，使正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變成松弛狀

51、態(tài)；同時DNA拓撲異構(gòu)酶(旋轉(zhuǎn)酶)也可以在復制叉前方地將負超螺旋引入雙鏈DNA。3.2.3.2 復制體(replisome)的形成DNA復制體是在復制叉附近，由DNA pol二聚體、引發(fā)體和DnaB等構(gòu)成的類似核糖體大小的復合體。復制體在DNA前導鏈模板和滯后鏈模板上移動時便合成了連續(xù)的DNA前導鏈和由許多岡崎片段組成的滯后鏈。不同系統(tǒng)（噬菌體、E.coli、動物、植物病毒）中的復制體組分雖有差異，但功能相似。復制體包括Ori的復制體（主導鏈和隨從鏈的是否相同）和復制起始后延伸過程的復制體兩種。延伸過程的復制體為非對稱的DNApol 二聚體、DnaB、隨從鏈上的SSB和引發(fā)體等組成。3.2.3

52、.3 DNA鏈的延伸前導鏈和滯后鏈由同一pol 二聚體延伸。前導鏈的合成：由DnaG（primase）在復制起始位點附近合成1個1060nt的RNA引物，然后由pol 把dNTP加到該引物上。滯后鏈的合成：產(chǎn)生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I補上一小段DNA序列，由DNA ligase把兩個片段相連。DNA滯后鏈與主導鏈合成的不同步。在DNA復制叉處由一個非對稱DNA pol二聚體，同時分別進行復制DNA前導鏈和滯后鏈。位于滯后連的引發(fā)體，在合成引物后DnaG可將模板鏈提起（或成環(huán)），使RNA引物3端位于pol 處，然后再折向與未解鏈的雙鏈DNA在同一方

53、向上，則滯后鏈的合成可以和前導鏈的合成在同一方向上進行。pol 的每一個催化中心合成一個子鏈。DnaB負責在復制叉上向前移動。引發(fā)體拖著一條DNA鏈通過。DNA pol沿著滯后鏈模板催化在RNA引物上聚合DNA鏈。滯后模板鏈被SSB結(jié)合，隨岡崎片段延伸priA可利用ATP供能除去SSB。當合成的DNA鏈到達前一次合成的岡崎片段的位置時，滯后鏈模板及新合成的岡崎片段便從DNA聚合酶上釋放出來。卡箍的分離和締合復制叉不斷遷移便又產(chǎn)生了一段滯后鏈模板，它重新環(huán)繞pol，并合成岡崎片段。因此，前導鏈合成不會超過滯后鏈太多。這樣引發(fā)體在DNA鏈上和pol同速移動。當岡崎片段形成后，DNA pol通過其5

54、3外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物；同時，利用后一個岡崎片段作為引物合成DNA。最后的缺口由DNA ligase連接形成完整的滯后鏈。DNA復制過程在復制叉形成復制體（DnaB、亞基與DNA結(jié)合，引發(fā)體形成，2×pol 復合體形成）3.2.4 DNA復制的終止3.2.4.1 E.coli DNA復制的終點在DNA上存在著復制終止位點，復制叉在此位點相遇（forks meet）。E.coli的DNA復制終點序列（23bp）：AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCA終止序列可被tus蛋白（tus基因編碼）識別，并結(jié)合于其上，它只讓一

55、側(cè)復制叉通過，并可能阻止DnaB的解鏈作用，使DNA復制在終止位點終止。E.coli的兩個復制叉在相距終點100kb時，復制速度減慢，從而協(xié)調(diào)2個復制叉到達的時間。終止的調(diào)節(jié)：在終止點Forks meet兩側(cè)各有幾個短序列，如：terE、D、A；terC、B。當一側(cè)復制叉前進的快，而另一側(cè)前進的慢時，快側(cè)復制酶則會在ter位點停止，等待直到慢側(cè)跟上時。似乎構(gòu)成一個“replication fork trap”3.2.4.2 DNA復制后的末端問題DNA復制時，當RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合所填充。而線性DNA分子以53為模板的滯后鏈的合成，末端的RNA引物被切除后是無法被DNA聚合酶所填充的。T7-DNA復制方式