乳酸菌檢驗(yàn)操作規(guī)范培訓(xùn)

1、目錄目錄一、乳酸菌一、乳酸菌二、儀器設(shè)備二、儀器設(shè)備三、三、 培養(yǎng)基培養(yǎng)基四、無菌室準(zhǔn)備四、無菌室準(zhǔn)備五、接種培養(yǎng)五、接種培養(yǎng)六、菌落計數(shù)六、菌落計數(shù)七、乳酸菌在改進(jìn)七、乳酸菌在改進(jìn)MC培養(yǎng)基上菌落特征培養(yǎng)基上菌落特征八、過氧化氫酶試驗(yàn)八、過氧化氫酶試驗(yàn)第二頁，共38頁。一、一、乳酸菌乳酸菌1 1、乳酸菌的概念、乳酸菌的概念乳酸菌一詞并非生物分類學(xué)名詞，而是指能乳酸菌一詞并非生物分類學(xué)名詞，而是指能夠利用發(fā)酵性糖類產(chǎn)生大量乳酸的一類微生夠利用發(fā)酵性糖類產(chǎn)生大量乳酸的一類微生物的統(tǒng)稱。物的統(tǒng)稱。通常將乳酸細(xì)菌之類群稱為乳酸菌。通常將乳酸細(xì)菌之類群稱為乳酸菌。第三頁，共38頁。2 2、乳酸菌主要分

2、布、乳酸菌主要分布乳桿菌屬乳桿菌屬LactobacillusLactobacillus 鏈球菌屬鏈球菌屬StreptococcusStreptococcus明串珠菌屬明串珠菌屬LeuconostocLeuconostoc片球菌屬片球菌屬PediococcusPediococcus雙歧桿菌屬雙歧桿菌屬BifidobacteriumBifidobacterium第四頁，共38頁。一乳桿菌屬一乳桿菌屬LactobacillusLactobacillus1乳桿菌屬的形態(tài)特征乳桿菌屬的形態(tài)特征 細(xì)胞呈桿狀，多為長桿狀、短桿狀及棒桿狀，一般成短細(xì)胞呈桿狀，多為長桿狀、短桿狀及棒桿狀，一般成短鏈排列。革蘭氏

3、染色陽性，通常不運(yùn)動，無芽孢。鏈排列。革蘭氏染色陽性，通常不運(yùn)動，無芽孢。第五頁，共38頁。2乳桿菌屬的生物學(xué)特點(diǎn)乳桿菌屬的生物學(xué)特點(diǎn) 化能異養(yǎng)型，營養(yǎng)要求嚴(yán)格，生長繁殖需要多種氨化能異養(yǎng)型，營養(yǎng)要求嚴(yán)格，生長繁殖需要多種氨基酸、維生素、肽、核酸衍生物?；?、維生素、肽、核酸衍生物。 厭氧、耐氧性厭氧或兼性厭氧厭氧、耐氧性厭氧或兼性厭氧 生長最適生長最適pH為為5.56.2，在，在pH5的環(huán)境中可生長，而中性的環(huán)境中可生長，而中性或初始堿性條件下生長速率降低?；虺跏級A性條件下生長速率降低。生長溫度范圍，生長溫度范圍，253，最適生長溫度，最適生長溫度3040。 第六頁，共38頁。3乳桿菌屬的代

4、表種乳桿菌屬的代表種 3.1保加利亞乳桿菌保加利亞乳桿菌L.bulgaricus細(xì)胞形態(tài)長桿狀，兩端鈍圓。細(xì)胞形態(tài)長桿狀，兩端鈍圓。固體培養(yǎng)基生長的菌落呈棉花狀，易與其它乳酸菌區(qū)別。固體培養(yǎng)基生長的菌落呈棉花狀，易與其它乳酸菌區(qū)別。能利用葡萄糖、果糖、乳糖進(jìn)展同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生能利用葡萄糖、果糖、乳糖進(jìn)展同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生D型乳酸有酸澀味，適口性差，不能利用蔗糖。型乳酸有酸澀味，適口性差，不能利用蔗糖。第七頁，共38頁。該菌是乳酸菌中產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的菌種。該菌是乳酸菌中產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的菌種。蛋白質(zhì)分解力較弱，發(fā)酵乳中可產(chǎn)生香味物質(zhì)蛋白質(zhì)分解力較弱，發(fā)酵乳中可產(chǎn)生香味物質(zhì)乙醛。乙醛。最適生長溫度最適生長

5、溫度3745，溫度高于，溫度高于50或低于或低于20不生長。不生長。常作為發(fā)酵酸奶的生產(chǎn)菌。常作為發(fā)酵酸奶的生產(chǎn)菌。 第八頁，共38頁。3.2嗜酸乳桿菌嗜酸乳桿菌L.acidophilus 細(xì)胞形態(tài)比保加利亞乳桿菌小，呈細(xì)長桿狀，能利細(xì)胞形態(tài)比保加利亞乳桿菌小，呈細(xì)長桿狀，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進(jìn)展同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進(jìn)展同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。生乳酸。最適生長溫度最適生長溫度37，20以下不生長，耐熱性差。蛋以下不生長，耐熱性差。蛋白質(zhì)分解力較弱。白質(zhì)分解力較弱。 第九頁，共38頁。最適生長最適生長pH 5.56.0，耐酸性強(qiáng)，能在其它乳酸菌，耐酸性強(qiáng)，能在其它乳酸

6、菌不能生長的酸性環(huán)境中生長繁殖。不能生長的酸性環(huán)境中生長繁殖。嗜酸乳桿菌是能夠在人體腸道定殖的少數(shù)有益微生物嗜酸乳桿菌是能夠在人體腸道定殖的少數(shù)有益微生物菌群之一，其代謝產(chǎn)物有機(jī)酸和抗菌物質(zhì)菌群之一，其代謝產(chǎn)物有機(jī)酸和抗菌物質(zhì)乳桿菌素乳桿菌素可抑制病原菌和腐敗菌的生長?？梢种撇≡透瘮【纳L。 第十頁，共38頁。二鏈球菌屬二鏈球菌屬Streptococcus1鏈球菌屬的形態(tài)特征鏈球菌屬的形態(tài)特征 細(xì)胞呈球形或卵圓形，成對或成鏈排列。革蘭氏染色細(xì)胞呈球形或卵圓形，成對或成鏈排列。革蘭氏染色陽性，無芽孢，一般不運(yùn)動，不產(chǎn)生色素。陽性，無芽孢，一般不運(yùn)動，不產(chǎn)生色素。第十一頁，共38頁。2鏈球菌

7、屬的生物學(xué)特點(diǎn)鏈球菌屬的生物學(xué)特點(diǎn) 化能異養(yǎng)型，同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生右旋乳酸；化能異養(yǎng)型，同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生右旋乳酸；兼性厭氧型，接觸酶反響陰性，厭氧培養(yǎng)生兼性厭氧型，接觸酶反響陰性，厭氧培養(yǎng)生長良好。長良好。 第十二頁，共38頁。3鏈球菌屬的代表種鏈球菌屬的代表種 嗜熱鏈球菌嗜熱鏈球菌St.thermophilus 細(xì)胞形態(tài)呈鏈球狀。細(xì)胞形態(tài)呈鏈球狀。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖進(jìn)展發(fā)酵產(chǎn)生乳酸能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖進(jìn)展發(fā)酵產(chǎn)生乳酸 。第十三頁，共38頁。蛋白質(zhì)分解力較弱，在發(fā)酵乳中可產(chǎn)生香味物質(zhì)雙乙酰。蛋白質(zhì)分解力較弱，在發(fā)酵乳中可產(chǎn)生香味物質(zhì)雙乙酰。 該菌主要特征是能在高溫條件下產(chǎn)酸

8、，最適生長溫度該菌主要特征是能在高溫條件下產(chǎn)酸，最適生長溫度4045，溫度低于，溫度低于20不產(chǎn)酸。耐熱性強(qiáng)，能耐不產(chǎn)酸。耐熱性強(qiáng)，能耐6568的高溫。的高溫。第十四頁，共38頁。三明串珠菌屬三明串珠菌屬Leuconostoc 菌落一般小于菌落一般小于1.0mm，光滑、圓形、灰白色，光滑、圓形、灰白色 細(xì)胞球形或豆?fàn)?，成對或成鏈排列?xì)胞球形或豆?fàn)睿蓪虺涉溑帕?。革蘭氏染色陽性，不運(yùn)動，無芽孢。革蘭氏染色陽性，不運(yùn)動，無芽孢。第十五頁，共38頁。四雙歧桿菌屬四雙歧桿菌屬Bifidobacterium 1雙歧桿菌屬的形態(tài)特征雙歧桿菌屬的形態(tài)特征 細(xì)胞呈多樣形態(tài)：細(xì)胞呈多樣形態(tài)：Y字型、字型、V

9、字型、彎曲狀、勺型，典字型、彎曲狀、勺型，典型形態(tài)為分叉桿菌型形態(tài)為分叉桿菌 革蘭氏染色陽性，亞甲基蘭染色菌體著色不規(guī)那么。革蘭氏染色陽性，亞甲基蘭染色菌體著色不規(guī)那么。無芽孢和鞭毛，不運(yùn)動。無芽孢和鞭毛，不運(yùn)動。 第十六頁，共38頁。2雙歧桿菌屬的生物學(xué)特點(diǎn)雙歧桿菌屬的生物學(xué)特點(diǎn) 化能異養(yǎng)型，對營養(yǎng)要求苛刻，生長繁殖需要多種雙化能異養(yǎng)型，對營養(yǎng)要求苛刻，生長繁殖需要多種雙歧因子歧因子 。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸和乙能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸和乙酸及少量的甲酸和琥珀酸。酸及少量的甲酸和琥珀酸。 蛋白質(zhì)分解力微弱。蛋白質(zhì)分解力微弱。第十七頁，共38頁。專性厭氧，

10、但不同菌種或菌株對氧的敏感性存在差專性厭氧，但不同菌種或菌株對氧的敏感性存在差異，屢次傳代培養(yǎng)后，菌株的耐氧性增強(qiáng)。異，屢次傳代培養(yǎng)后，菌株的耐氧性增強(qiáng)。生長溫度范圍生長溫度范圍2545，最適生長溫度，最適生長溫度37。生長生長pH值范圍值范圍4.58.5，最適生長起始，最適生長起始pH值值6.57.0，不，不耐酸，酸性環(huán)境耐酸，酸性環(huán)境pH5.5對菌體存活不利。對菌體存活不利。 第十八頁，共38頁。3、代表種、代表種 人體腸道中共有人體腸道中共有8種，其中數(shù)量最多的種，其中數(shù)量最多的5種為：種為：兩歧雙歧桿菌兩歧雙歧桿菌B.bifidum嬰兒雙歧桿菌嬰兒雙歧桿菌B.infantis青春雙歧桿

11、菌青春雙歧桿菌B.adolescentis長雙歧桿菌長雙歧桿菌B.longum短雙歧桿菌短雙歧桿菌(B.breve)第十九頁，共38頁。4、雙歧桿菌功能、雙歧桿菌功能是人體腸道有益菌群，它可定殖在宿主的腸粘膜上形是人體腸道有益菌群，它可定殖在宿主的腸粘膜上形成生物學(xué)屏障成生物學(xué)屏障 具有拮抗致病菌、改善微生態(tài)平衡、合成多種微生素、具有拮抗致病菌、改善微生態(tài)平衡、合成多種微生素、提供營養(yǎng)、抗腫瘤、降低內(nèi)毒素、提高免疫力、保護(hù)造提供營養(yǎng)、抗腫瘤、降低內(nèi)毒素、提高免疫力、保護(hù)造血器官、降低膽固醇水平等重要生理功能，其促進(jìn)人體血器官、降低膽固醇水平等重要生理功能，其促進(jìn)人體安康的有益作用，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它

12、乳酸菌。安康的有益作用，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它乳酸菌。 第二十頁，共38頁。二、檢測儀器設(shè)備二、檢測儀器設(shè)備 冰箱：冰箱：04恒溫培養(yǎng)箱：恒溫培養(yǎng)箱：361恒溫水浴鍋：恒溫水浴鍋：461微生物顯微鏡微生物顯微鏡三角瓶：三角瓶：500ml滅菌刻度吸管：滅菌刻度吸管：1ml、10ml 滅菌平皿：直徑滅菌平皿：直徑90mm第二十一頁，共38頁。三、三、 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 1、改進(jìn)、改進(jìn)MC培養(yǎng)基培養(yǎng)基 成分：大豆蛋白胨，成分：大豆蛋白胨，5g；牛肉浸膏，；牛肉浸膏，5g;酵母浸酵母浸膏，膏，5g；葡萄糖，；葡萄糖，20g；乳糖，；乳糖， 20g；碳酸鈣，；碳酸鈣， 10g；瓊脂，；瓊脂，15g；蒸餾水，；蒸餾水，

13、1000mL；1的中的中性紅溶液，性紅溶液，5mL；硫酸多粘菌素；硫酸多粘菌素B，10萬萬IU。 11515分鐘高壓滅菌備用。分鐘高壓滅菌備用。第二十二頁，共38頁。2、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備使用前，將滅菌培養(yǎng)基用微波爐或水浴鍋加使用前，將滅菌培養(yǎng)基用微波爐或水浴鍋加熱溶解，在熱溶解，在4045水浴中保溫待用。水浴中保溫待用。第二十三頁，共38頁。四、無菌室準(zhǔn)備四、無菌室準(zhǔn)備無菌室使用前后，用紫外燈照射無菌室使用前后，用紫外燈照射3040min。將工作服、。將工作服、工作帽和工作鞋放入無菌室進(jìn)展滅菌，進(jìn)入無菌室前工作帽和工作鞋放入無菌室進(jìn)展滅菌，進(jìn)入無菌室前換上工作服、工作帽和工作鞋。換上

14、工作服、工作帽和工作鞋。第二十四頁，共38頁。超凈工作臺面，使用前用超凈工作臺面，使用前用75%酒精擦拭消毒后，用紫酒精擦拭消毒后，用紫外燈照射外燈照射4045min；操作完畢后，用干凈抹布將操；操作完畢后，用干凈抹布將操作臺面擦拭干凈后，用作臺面擦拭干凈后，用75%的酒精棉球進(jìn)展擦拭，開的酒精棉球進(jìn)展擦拭，開啟紫外燈照射啟紫外燈照射4045min。第二十五頁，共38頁。五、接種培養(yǎng)五、接種培養(yǎng) 以無菌操作，用以無菌操作，用1ml滅菌刻度吸管吸取滅菌刻度吸管吸取1ml樣品原液，注入含有滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，樣品原液，注入含有滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，充分振搖，制成充分振搖，制成1:10的稀釋液。的

15、稀釋液。注意：刻度吸管尖端不要觸及試管內(nèi)生理鹽注意：刻度吸管尖端不要觸及試管內(nèi)生理鹽水。水。第二十六頁，共38頁。用用1ml滅菌刻度吸管吸取滅菌刻度吸管吸取1ml1:10的稀釋液，注的稀釋液，注入含有滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖試管，混入含有滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖試管，混合均勻。合均勻。注意：吸取稀釋液前，用刻度吸管吹打，使稀注意：吸取稀釋液前，用刻度吸管吹打，使稀 釋混合均勻?？潭任芗舛瞬灰|及管內(nèi)稀釋釋混合均勻。刻度吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液。液。第二十七頁，共38頁。另取另取1ml滅菌刻度吸管，按上述操作順序，滅菌刻度吸管，按上述操作順序，做做10倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即換倍

16、遞增稀釋液，如此每遞增一次，即換用用1支支1ml滅菌刻度吸管。滅菌刻度吸管。第二十八頁，共38頁。在無菌操作條件下，用在無菌操作條件下，用1ml滅菌刻度吸管吸取滅菌刻度吸管吸取選定的樣品稀釋液或原液至滅菌平皿內(nèi)。選定的樣品稀釋液或原液至滅菌平皿內(nèi)。 同上對同一樣品重復(fù)操作，即每個選定的適當(dāng)同上對同一樣品重復(fù)操作，即每個選定的適當(dāng)?shù)臉悠废♂屢鹤鰞蓚€平皿。的樣品稀釋液做兩個平皿。 第二十九頁，共38頁。按以上步驟，以按以上步驟，以1ml滅菌生理鹽水作為空白操滅菌生理鹽水作為空白操作對照。作對照。 在無菌操作條件下，將約在無菌操作條件下，將約15ml的改進(jìn)的改進(jìn)MC培養(yǎng)培養(yǎng)基傾入樣品平皿中，將平皿置

17、于操作臺面上輕基傾入樣品平皿中，將平皿置于操作臺面上輕輕轉(zhuǎn)動，使樣品和培養(yǎng)基混合均勻。輕轉(zhuǎn)動，使樣品和培養(yǎng)基混合均勻。 第三十頁，共38頁。接種培養(yǎng)操作錄像接種培養(yǎng)操作錄像第三十一頁，共38頁。討論討論錄像中存在細(xì)節(jié)問題：錄像中存在細(xì)節(jié)問題：1、拿平板前先消毒手、拿平板前先消毒手2、倒培養(yǎng)基前要對培養(yǎng)基的瓶進(jìn)展消毒，、倒培養(yǎng)基前要對培養(yǎng)基的瓶進(jìn)展消毒，可以酒精棉球消毒和酒精燈外焰消毒?？梢跃凭耷蛳竞途凭珶敉庋嫦尽５谌?，共38頁。待培養(yǎng)基凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，即有培養(yǎng)基待培養(yǎng)基凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，即有培養(yǎng)基的一面向上。的一面向上。 將所有平皿置于將所有平皿置于361培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)培養(yǎng)箱

18、中，培養(yǎng)723h，觀察乳酸菌菌落特征。，觀察乳酸菌菌落特征。 第三十三頁，共38頁。六、菌落計數(shù)六、菌落計數(shù) 選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在30300之間的平皿進(jìn)展計數(shù)。之間的平皿進(jìn)展計數(shù)。 計數(shù)后，隨機(jī)挑取五個菌落進(jìn)展革蘭氏染色，顯微鏡檢計數(shù)后，隨機(jī)挑取五個菌落進(jìn)展革蘭氏染色，顯微鏡檢查并做過氧化氫酶試驗(yàn)。查并做過氧化氫酶試驗(yàn)。 革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽孢的球菌或桿菌革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽孢的球菌或桿菌可定為乳酸菌。可定為乳酸菌。第三十四頁，共38頁。根據(jù)證實(shí)為乳酸菌菌落計算出該皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)，乘以其根據(jù)證實(shí)為乳酸菌菌落計算出該皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)，乘以其稀釋倍數(shù)即得每毫升樣品中乳酸菌數(shù)。