同種異體骨移植修復(fù)過程中轉(zhuǎn)化生長因子β1表達的實驗研究

1、 同種異體骨移植修復(fù)過程中轉(zhuǎn)化同種異體骨移植修復(fù)過程中轉(zhuǎn)化 生長因子生長因子1 1表達的實驗研究表達的實驗研究梁炳生梁炳生 關(guān)海山關(guān)海山山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科前前 言言 轉(zhuǎn)化生長因子轉(zhuǎn)化生長因子 1 1（ TGF-TGF-1 1）是一種多肽類多是一種多肽類多功能生長因子，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞或瘤細(xì)胞的生長功能生長因子，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞或瘤細(xì)胞的生長分化，在骨組織中受損傷刺激可啟動新生骨與軟骨分化，在骨組織中受損傷刺激可啟動新生骨與軟骨的生成。動物實驗證明，外源性的生成。動物實驗證明，外源性TGF-TGF-1 1能夠促進骨能夠促進骨折愈合。目前認(rèn)為，折愈合。目前認(rèn)為，TGF

2、-TGF-1 1表達量的變化可直接反表達量的變化可直接反映成骨能力的強弱，其基因表達信號的強弱可反映映成骨能力的強弱，其基因表達信號的強弱可反映生成量的多少。生成量的多少。 本研究采用免疫組化和原位雜交方法，觀察分析本研究采用免疫組化和原位雜交方法，觀察分析同種異體骨移植修復(fù)過程中，術(shù)后時間、移植骨處同種異體骨移植修復(fù)過程中，術(shù)后時間、移植骨處理以及供受體間主要組織相容性抗原是否相配等因理以及供受體間主要組織相容性抗原是否相配等因素對移植骨局部內(nèi)源性素對移植骨局部內(nèi)源性TGF-TGF-1 1表達的影響，旨在為表達的影響，旨在為進一步研究異體骨移植愈合機理以及臨床合理使用進一步研究異體骨移植愈合

3、機理以及臨床合理使用重組生長因子提供實驗依據(jù)。重組生長因子提供實驗依據(jù)。 材料與方法材料與方法 本研究采用本研究采用2 22 24 4三因素析因試驗設(shè)計方法。三因素析因試驗設(shè)計方法。根據(jù)供受體間主要組織相容性抗原是否相配將實根據(jù)供受體間主要組織相容性抗原是否相配將實驗動物隨機分為兩個大組，即主要組織相容性抗驗動物隨機分為兩個大組，即主要組織相容性抗原相配組和不配組。各大組再隨機分為兩個處理原相配組和不配組。各大組再隨機分為兩個處理組，分別是新鮮異體骨移植組和冷凍異體骨移植組，分別是新鮮異體骨移植組和冷凍異體骨移植組。組。 一、實驗設(shè)計一、實驗設(shè)計表表1 1：實驗動物分組情況及處理：實驗動物分組

4、情況及處理 二、實驗動物選擇二、實驗動物選擇 選用健康、成年近交系選用健康、成年近交系LEWLEW大鼠大鼠 （主要組（主要組織相容性復(fù)合體單倍體型織相容性復(fù)合體單倍體型Rt.1Rt.1l l）和近交系和近交系DADA大大鼠（主要組織相容性復(fù)合體單倍體型鼠（主要組織相容性復(fù)合體單倍體型Rt.1Rt.1a a），雄性，體重雄性，體重270-320270-320克?？?。 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。動物中心提供。 三、移植骨的制備三、移植骨的制備 LEW LEW和和DADA大鼠各大鼠各1212只做為供體。無菌條件下取其雙側(cè)股骨，只做為供體。無菌條件下取其雙側(cè)股骨，除去骨髓及附著

5、軟組織，除去骨髓及附著軟組織， 修剪成修剪成3 3mmmm4mm4mm形狀規(guī)則的半管形狀規(guī)則的半管狀皮質(zhì)骨塊，狀皮質(zhì)骨塊，0.9%0.9%氯化鈉注射液反復(fù)沖洗。氯化鈉注射液反復(fù)沖洗。 將其中將其中2424塊皮質(zhì)塊皮質(zhì)骨（骨（LEWLEW、DADA大鼠股骨各大鼠股骨各1212塊）裝入雙層無菌血漿袋中，熱塊）裝入雙層無菌血漿袋中，熱壓封口，置入壓封口，置入-20-20低溫冰箱中凍存低溫冰箱中凍存2 2周，周， 制成冷凍異體骨，制成冷凍異體骨，植入前浸于植入前浸于30-3730-37的的0.90.9氯化鈉注射液中復(fù)溫氯化鈉注射液中復(fù)溫3030分鐘。分鐘。 將另將另外外2424塊皮質(zhì)骨做為新鮮異體骨，

6、在塊皮質(zhì)骨做為新鮮異體骨，在2 2小時內(nèi)植入受體。小時內(nèi)植入受體。 四、動物模型建立四、動物模型建立 LEWLEW大鼠大鼠4848只做為受體。只做為受體。0.6%0.6%戊巴比妥鈉（戊巴比妥鈉（5 5mlml /kg/kg）腹腔注射麻醉，腹臥位固定，左后肢前外側(cè)切腹腔注射麻醉，腹臥位固定，左后肢前外側(cè)切口，長約口，長約3 3cmcm，切開皮膚、皮下組織，沿肌間隙分切開皮膚、皮下組織，沿肌間隙分離，暴露股骨中段，口腔科高速裂鉆截骨，離，暴露股骨中段，口腔科高速裂鉆截骨， 造成股造成股骨干中段骨干中段3 3mmmm4mm4mm大小的骨缺損模型。大小的骨缺損模型。 將移植骨將移植骨正位植入后，逐層縫

7、合傷口。正位植入后，逐層縫合傷口。 五、主要試劑五、主要試劑 TGF- TGF-1 1免疫組化試劑盒及免疫組化試劑盒及TGF-TGF-1 1原位雜交試劑原位雜交試劑盒（武漢博士德生物工程公司提供）。盒（武漢博士德生物工程公司提供）。 六、觀察方法六、觀察方法 取材后組織標(biāo)本以取材后組織標(biāo)本以10%10%中性福爾馬林固定中性福爾馬林固定48-7248-72小時；小時；10%10%EDTAEDTA脫鈣脫鈣2 2周，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石周，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蠟包埋，5 5umum連續(xù)切片，分別進行連續(xù)切片，分別進行HEHE染色，染色，TGF-TGF-1 1免免疫組化染色及原

8、位雜交檢測。光鏡下觀察各組移植骨疫組化染色及原位雜交檢測。光鏡下觀察各組移植骨修復(fù)情況。修復(fù)情況。 將已判定為陽性的組織切片，隨機抽樣做空白對照，將已判定為陽性的組織切片，隨機抽樣做空白對照，以以PBSPBS緩沖液代替一抗或雜交液。其他步驟不變。以緩沖液代替一抗或雜交液。其他步驟不變。以空白對照實驗的染色程度確定是否陽性空白對照實驗的染色程度確定是否陽性, , 空白實驗空白實驗染色強度為陰性染色強度為陰性,空白對照染色強度為陽性。陽性表空白對照染色強度為陽性。陽性表達以組織和達以組織和/ /或細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為判斷標(biāo)或細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為判斷標(biāo)準(zhǔn)。以乳腺癌標(biāo)本作為陽性對照。準(zhǔn)。以

9、乳腺癌標(biāo)本作為陽性對照。 七、圖像分析和統(tǒng)計學(xué)方法七、圖像分析和統(tǒng)計學(xué)方法 1 1骨組織形態(tài)計量分析骨組織形態(tài)計量分析 每張每張HEHE染色組織切片隨機選取染色組織切片隨機選取5 5視野，經(jīng)計算機自動圖像處理系視野，經(jīng)計算機自動圖像處理系統(tǒng)計算新生骨組織密度。統(tǒng)計算新生骨組織密度。 新生骨組織密度新生骨組織密度= =新生骨組織面積新生骨組織面積/ /總骨總骨面積。面積。 2 2TGF-TGF-1 1原位雜交結(jié)果圖像分析原位雜交結(jié)果圖像分析 將原位雜交組織切片隨機選取將原位雜交組織切片隨機選取 5 5個視野，經(jīng)計算機自動圖像處理個視野，經(jīng)計算機自動圖像處理系統(tǒng)提取圖中表達陽性信號彩色閾值，計算平

10、均光密度值。系統(tǒng)提取圖中表達陽性信號彩色閾值，計算平均光密度值。 以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理采用以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理采用SASSAS軟件，進行軟件，進行2 22 24 4析因方差分析。析因方差分析。 數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，P P0.050.05有顯著有顯著性差異。性差異。結(jié)結(jié) 果果 一、組織學(xué)觀察一、組織學(xué)觀察 主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植：主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植： 骨吸收不明顯，死骨含量少。骨吸收不明顯，死骨含量少。 術(shù)后術(shù)后1 1周，移植骨表面、髓腔及移植骨周，移植骨表面、髓腔及移植骨- -宿主骨間隙宿主骨間隙有新生骨樣組織生成；有新生骨樣組織生成；2

11、 2周時，移植骨淺表處生成編織骨；周時，移植骨淺表處生成編織骨；4 4周，板層骨與編織骨摻雜出現(xiàn)；周，板層骨與編織骨摻雜出現(xiàn)； 8 8周，板層骨排列整齊周，板層骨排列整齊與移植骨緊密地整合在一起，髓腔再通。與移植骨緊密地整合在一起，髓腔再通。 上述部位增殖、分化的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)上述部位增殖、分化的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TGF-TGF-1 1蛋白及蛋白及mRNAmRNA表達陽性。表達陽性。 主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨移植：主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨移植： 移植骨邊緣有骨吸收現(xiàn)象，骨內(nèi)有死骨成分。移植骨邊緣有骨吸收現(xiàn)象，骨內(nèi)有死骨成分。 術(shù)后第術(shù)后第2 2周，移植骨周圍、髓

12、腔及移植骨周，移植骨周圍、髓腔及移植骨- -宿主骨間宿主骨間隙有新生骨樣組織出現(xiàn)；隙有新生骨樣組織出現(xiàn)；4-84-8周時，板層骨、編織骨摻雜周時，板層骨、編織骨摻雜出現(xiàn)且位置表淺，髓腔內(nèi)有殘余骨小梁。出現(xiàn)且位置表淺，髓腔內(nèi)有殘余骨小梁。 移植骨周圍、髓腔及移植骨移植骨周圍、髓腔及移植骨- -宿主骨間隙增殖、分化宿主骨間隙增殖、分化的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TGF-TGF-1 1蛋白及蛋白及mRNAmRNA表達陽表達陽性。性。 主要組織相容性抗原不配的新鮮異體骨移植：主要組織相容性抗原不配的新鮮異體骨移植： 骨吸收活躍，且移植骨周圍有大量多核巨細(xì)胞骨吸收活躍，且移植骨周圍有

13、大量多核巨細(xì)胞浸潤。浸潤。 術(shù)后術(shù)后2 2周，周， 移植骨邊緣及髓腔內(nèi)有少量新生骨移植骨邊緣及髓腔內(nèi)有少量新生骨樣組織出現(xiàn)；至樣組織出現(xiàn)；至8 8周時，新生骨組織很少，移植骨內(nèi)周時，新生骨組織很少，移植骨內(nèi)仍有大片均質(zhì)狀死骨。髓腔無再通跡象。仍有大片均質(zhì)狀死骨。髓腔無再通跡象。 上述部位增殖、分化的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞上述部位增殖、分化的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)TGF-TGF-1 1蛋白及蛋白及mRNAmRNA表達陽性。表達陽性。 主要組織相容性抗原不配的冷凍異體骨移植：主要組織相容性抗原不配的冷凍異體骨移植： 移植骨邊緣有骨吸收現(xiàn)象，骨內(nèi)有死骨成分。移植骨邊緣有骨吸收現(xiàn)象，骨內(nèi)有死骨成分。

14、術(shù)后術(shù)后2 2周，新生骨樣組織出現(xiàn)；周，新生骨樣組織出現(xiàn)； 4-8 4-8周時，板層骨、周時，板層骨、編織骨摻雜出現(xiàn)，位置表淺，與移植骨整合不緊密，髓編織骨摻雜出現(xiàn)，位置表淺，與移植骨整合不緊密，髓腔內(nèi)有殘余骨小梁。腔內(nèi)有殘余骨小梁。 TGF-TGF-1 1蛋白及蛋白及mRNAmRNA表達主要定為于新生骨組織表表達主要定為于新生骨組織表面的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。面的成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。圖1術(shù)后2周，主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植（HE 100）圖2術(shù)后2周，主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨移植（HE 100）圖3術(shù)后2周，主要組織相容性抗原不配的新鮮異體骨移植（HE 100）圖

15、4術(shù)后2周，主要組織相容性抗原不配的冷凍異體骨移植（HE 100） 圖 1 圖 2 圖 3 圖 4 圖 5術(shù)后1周，主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植（ISH 100）圖 6術(shù)后1周，主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨移植（ISH 100）圖 7術(shù)后2周，主要組織相容性抗原不配的新鮮異體骨移植（ISH 100）圖 8. 術(shù)后2周，主要組織相容性抗原不配的冷凍異體骨移植（ISH 100） 圖 7 圖 8 圖 5 圖 6 圖 9 圖 10 圖 11 圖 122 圖 9術(shù)后4周，主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植（IHC 100）圖 10術(shù)后4周，主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨移植（IH

16、C 100）圖 11術(shù)后8周，主要組織相容性抗原不配的新鮮異體骨移植（IHC 100）圖 12術(shù)后8周，主要組織相容性抗原不配的冷凍異體骨移植（IHC 100） 1 1隨時間延長新生骨組織密度逐漸增高，術(shù)隨時間延長新生骨組織密度逐漸增高，術(shù)后第后第8 8周新生骨組織密度最高（周新生骨組織密度最高（P P0.050.05）。）。 2 2主要組織相容性抗原相配與不配者之間新生主要組織相容性抗原相配與不配者之間新生骨組織密度有顯著性差異（骨組織密度有顯著性差異（P P0.050.05）。）。二、骨組織形態(tài)計量分析二、骨組織形態(tài)計量分析 3 3冷凍異體骨移植與新鮮異體骨移植之間新生冷凍異體骨移植與新鮮

17、異體骨移植之間新生骨組織密度有顯著性差異（骨組織密度有顯著性差異（P P0.050.05）。 4. 4. 主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植新主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植新生骨組織出現(xiàn)最早，成骨效果最好，術(shù)后生骨組織出現(xiàn)最早，成骨效果最好，術(shù)后8 8周與其他周與其他各移植骨相比新生骨組織密度最高（各移植骨相比新生骨組織密度最高（P0.05P0.05）。）。表表2 2 骨組織形態(tài)分析結(jié)果骨組織形態(tài)分析結(jié)果 主要組織相容性抗原相配主要組織相容性抗原相配 主要組織相容性抗原不配主要組織相容性抗原不配時間時間( (周周) ) 新鮮異體骨新鮮異體骨 冷凍異體骨冷凍異體骨 新鮮異體骨新鮮異體

18、骨 冷凍異體骨冷凍異體骨 1 1 0.20000.20000.0033 0.13920.0033 0.13920.00290.0029 0.1070 0.10700.0032 0.14110.0032 0.14110.0073 0.0073 2 2 0.5236 0.52360.0188 0.36730.0188 0.36730.0196 0.15370.0196 0.15370.0065 0.37010.0065 0.37010.0020 0.0020 4 4 0.6193 0.61930.0174 0.48150.0174 0.48150.0135 0.21180.0135 0.21180

19、.0024 0.43260.0024 0.43260.0238 0.0238 8 8 0.76150.76150.0200 0.70300.0200 0.70300.0106 0.30630.0106 0.30630.0159 0.69890.0159 0.69890.00960.0096 00.10.20.30.40.50.60.70.81234新生骨組織密度主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨主要組織相容性抗原不配的新鮮異體骨主要組織相容性抗原不配的冷凍異體骨 1 2 4 8 圖13 骨組織形態(tài)計量分析結(jié)果 時間（周） 1 1供受體間主要組織相容性抗原是否相

20、配影響供受體間主要組織相容性抗原是否相配影響TGF-TGF-1 1mRNAmRNA的表達強度的表達強度（P0.05P0.05）。 2 2移植骨冷凍處理影響移植骨冷凍處理影響TGF-TGF-1 1mRNAmRNA的表達強度的表達強度( (P0.05)P0.05)。 3 3術(shù)后時間影響術(shù)后時間影響TGF-TGF-1 1mRNAmRNA的表達強度的表達強度（P0.05P0.05）。術(shù)后術(shù)后8 8周時周時TGF-TGF-1 1mRNAmRNA表達水平最低。表達水平最低。 4 4時間、移植骨處理以及主要組織相容性抗原是否時間、移植骨處理以及主要組織相容性抗原是否相配等因素之間存在交互作用相配等因素之間存

21、在交互作用（P0.05P0.05）。 三、三、TGF-TGF-1 1mRNAmRNA原位雜交檢測圖像分析原位雜交檢測圖像分析 主要組織相容性抗原相配主要組織相容性抗原相配 主要組織相容性抗原不配主要組織相容性抗原不配 時間時間( (周周) ) 新鮮異體骨新鮮異體骨 冷凍異體骨冷凍異體骨 新鮮異體骨新鮮異體骨 冷凍異體骨冷凍異體骨 1 1.41750.0029 0.99850.0144 0.24090.0075 0.45540.0128 2 0.84700.0085 0.70870.0016 0.25910.0015 1.05440.1224 4 0.61020.0035 0.49940.001

22、7 0.25330.0103 0.48830.0161 8 0.47500.0047 0.41960.0018 0.24380.0061 0.42170.0187 表表3 3 術(shù)后不同時間各移植骨術(shù)后不同時間各移植骨TGF-TGF-1 1mRNAmRNA表達強度（平均光密度值）表達強度（平均光密度值） 影響因素影響因素 F F值值 P P值值 主要組織相容性抗原主要組織相容性抗原( (A) 1277.55 0.05A) 1277.55 0.05 移植骨處理移植骨處理( (B) 71.19 0.05B) 71.19 0.05 術(shù)后觀察時間術(shù)后觀察時間( (T) 449.16 0.05T) 449

23、.16 0.05 A AB 887.30 0.05B 887.30 0.05 B BT 67.89 0.05T 67.89 0.05 A AT 393.78 0.05T 393.78 0.05 A AB BT T 30.99 30.99 0.050.05表表4 24 22 24 4析因分析結(jié)果析因分析結(jié)果00.20.40.60.811.21.41.61234平均光密度值主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨主要組織相容性抗原相配的冷凍異體骨主要組織相容性抗原不配的新鮮異體骨主要組織相容性抗原不配的冷凍異體骨 1 2 4 8時間（周） 圖14 術(shù)后不同時間各移植骨TGF-1表達強度（平均光密度值）討

24、討 論論 一、骨移植修復(fù)過程中一、骨移植修復(fù)過程中TGF-TGF-1 1的表達特征的表達特征 目前已經(jīng)知道，骨損傷修復(fù)過程中，目前已經(jīng)知道，骨損傷修復(fù)過程中，TGF-TGF-1 1早期早期主要源于血小板和局部血液凝固。主要源于血小板和局部血液凝固。 血小板脫顆粒釋血小板脫顆粒釋放放TGF-TGF-1 1，刺激修復(fù)細(xì)胞如間充質(zhì)細(xì)胞，成骨細(xì)胞，刺激修復(fù)細(xì)胞如間充質(zhì)細(xì)胞，成骨細(xì)胞增殖、分化，啟動修復(fù)過程增殖、分化，啟動修復(fù)過程。局部的成骨細(xì)胞、破局部的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞可在骨細(xì)胞可在TGF-TGF-1 1的調(diào)節(jié)下使骨吸收、骨形成協(xié)調(diào)的調(diào)節(jié)下使骨吸收、骨形成協(xié)調(diào)進行。進行。 本研究發(fā)現(xiàn)，異體骨移植修復(fù)

25、過程中，移植骨局部本研究發(fā)現(xiàn)，異體骨移植修復(fù)過程中，移植骨局部TGF-TGF-1 1的表達水平與成骨效果協(xié)同變化，隨骨組織逐漸的表達水平與成骨效果協(xié)同變化，隨骨組織逐漸成熟而發(fā)生量的變化，成熟而發(fā)生量的變化， 呈現(xiàn)出由高到低的緩慢下降趨呈現(xiàn)出由高到低的緩慢下降趨勢，提示了在移植骨修復(fù)過程中，局部內(nèi)源性勢，提示了在移植骨修復(fù)過程中，局部內(nèi)源性TGF -TGF -1 1對骨形成、骨改建起著重要調(diào)節(jié)作用，對骨形成、骨改建起著重要調(diào)節(jié)作用， 它可以根據(jù)損它可以根據(jù)損傷修復(fù)所需的生物學(xué)環(huán)境而發(fā)生量與分布的變化。傷修復(fù)所需的生物學(xué)環(huán)境而發(fā)生量與分布的變化。 現(xiàn)已證實，現(xiàn)已證實，TGF-TGF-1 1可誘導(dǎo)

26、間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨可誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，細(xì)胞、成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化， 以軟骨內(nèi)成骨或膜內(nèi)成骨以軟骨內(nèi)成骨或膜內(nèi)成骨的方式成骨。的方式成骨。 本研究觀察到，異體骨移植成骨過本研究觀察到，異體骨移植成骨過程主要是以膜內(nèi)成骨方式進行，軟骨內(nèi)成骨很少。程主要是以膜內(nèi)成骨方式進行，軟骨內(nèi)成骨很少。 原位雜交結(jié)果顯示，在膜內(nèi)成骨階段原位雜交結(jié)果顯示，在膜內(nèi)成骨階段TGF-TGF-1 1mRNAmRNA表達量最高，隨即呈現(xiàn)出下降趨勢。表達量最高，隨即呈現(xiàn)出下降趨勢。 這可能是骨移植時局部出血較少，有氧環(huán)境利于間這可能是骨移植時局部出血較少，有氧環(huán)境利于間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以膜內(nèi)成骨的方式

27、形成骨充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以膜內(nèi)成骨的方式形成骨組織。這與骨折愈合過程中，組織。這與骨折愈合過程中， 局部局部TGF-TGF-1 1mRNAmRNA的表的表達特征明顯不同，即沒有與軟骨內(nèi)成骨階段有關(guān)的第達特征明顯不同，即沒有與軟骨內(nèi)成骨階段有關(guān)的第二次峰值出現(xiàn)。二次峰值出現(xiàn)。 二、免疫排斥反應(yīng)抑制二、免疫排斥反應(yīng)抑制TGF-TGF-1 1的表達的表達 本研究表明，主要組織相容性抗原不配的同種異本研究表明，主要組織相容性抗原不配的同種異體骨移植的成骨效果明顯不如組織抗原相配者。原體骨移植的成骨效果明顯不如組織抗原相配者。原位雜交結(jié)果也顯示出同樣的抑制特征。這說明供受位雜交結(jié)果也顯示出同樣的抑

28、制特征。這說明供受體間主要組織相容性抗原不配抑制骨移植的修復(fù)過體間主要組織相容性抗原不配抑制骨移植的修復(fù)過程以及局部內(nèi)源性程以及局部內(nèi)源性TGF-TGF-1 1的表的表達。這一結(jié)論與以往達。這一結(jié)論與以往研究結(jié)果是一致的。研究結(jié)果是一致的。 研究證明，骨細(xì)胞膜及細(xì)胞外骨基質(zhì)中含有大研究證明，骨細(xì)胞膜及細(xì)胞外骨基質(zhì)中含有大量量I I、II II類抗原分子。異體骨移植可以呈遞抗原，誘類抗原分子。異體骨移植可以呈遞抗原，誘發(fā)宿主產(chǎn)生以局部細(xì)胞免疫反應(yīng)為主的排斥反應(yīng)，發(fā)宿主產(chǎn)生以局部細(xì)胞免疫反應(yīng)為主的排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植骨周圍炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管狹窄、閉導(dǎo)致移植骨周圍炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管狹窄、閉塞，

29、移植骨修復(fù)過程延遲或移植骨被超前吸收。塞，移植骨修復(fù)過程延遲或移植骨被超前吸收。 同時，免疫排斥反應(yīng)過程中還產(chǎn)生了許多細(xì)胞因同時，免疫排斥反應(yīng)過程中還產(chǎn)生了許多細(xì)胞因子，如子，如IL-1IL-1，TNF-TNF-等，它們除參與免疫調(diào)節(jié)外，等，它們除參與免疫調(diào)節(jié)外，還可激活破骨細(xì)胞的活性促進破骨并抑制成骨。體還可激活破骨細(xì)胞的活性促進破骨并抑制成骨。體外研究發(fā)現(xiàn)，外研究發(fā)現(xiàn)，IL-1IL-1，TNF-TNF-可以促進可以促進FASFAS介導(dǎo)的人類介導(dǎo)的人類成骨細(xì)胞凋亡，抑制成骨細(xì)胞凋亡，抑制TGF-TGF-1 1的表達。的表達。 盡管同種異體骨植入體內(nèi)后，處于一個低水平的免盡管同種異體骨植入體內(nèi)

30、后，處于一個低水平的免疫反應(yīng)狀態(tài)，不存在異體器官移植所出現(xiàn)的超急性排疫反應(yīng)狀態(tài)，不存在異體器官移植所出現(xiàn)的超急性排斥反應(yīng)，但仍會給骨修復(fù)、塑型、重建帶來不利影斥反應(yīng)，但仍會給骨修復(fù)、塑型、重建帶來不利影響，反映在分子水平上表現(xiàn)為響，反映在分子水平上表現(xiàn)為 TGF-TGF-1 1 表達水平的降表達水平的降低或延遲。低或延遲。 三、移植骨冷凍處理對三、移植骨冷凍處理對TGF-TGF-1 1表達的影響表達的影響 現(xiàn)已證實，異體骨經(jīng)低溫冷凍處理后可以降低其免疫現(xiàn)已證實，異體骨經(jīng)低溫冷凍處理后可以降低其免疫原性，但同時其生物學(xué)活性也被減弱。這一現(xiàn)象的發(fā)生原性，但同時其生物學(xué)活性也被減弱。這一現(xiàn)象的發(fā)生可

31、能是移植骨內(nèi)存活細(xì)胞死亡造成的。因為低溫冷凍處可能是移植骨內(nèi)存活細(xì)胞死亡造成的。因為低溫冷凍處理對移植骨而言，不僅僅是一個低溫儲藏的過程，植入理對移植骨而言，不僅僅是一個低溫儲藏的過程，植入前移植骨往往需要解凍，凍融的變化過程在改變抗原結(jié)前移植骨往往需要解凍，凍融的變化過程在改變抗原結(jié)構(gòu)的同時，也會引起骨內(nèi)存活細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致骨構(gòu)的同時，也會引起骨內(nèi)存活細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致骨內(nèi)細(xì)胞死亡。內(nèi)細(xì)胞死亡。 本研究結(jié)果顯示，低溫冷凍處理對主要組織相容性本研究結(jié)果顯示，低溫冷凍處理對主要組織相容性抗原相配與不配的異體骨移植會造成兩種截然不同的抗原相配與不配的異體骨移植會造成兩種截然不同的結(jié)局：對組織

32、抗原相配者而言，表現(xiàn)為骨摻入延遲，結(jié)局：對組織抗原相配者而言，表現(xiàn)為骨摻入延遲，TGF-TGF-1 1mRNAmRNA表達水平降低；而對于組織抗原不配者，表達水平降低；而對于組織抗原不配者，則表現(xiàn)為骨摻入加快，則表現(xiàn)為骨摻入加快，TGF-TGF-1 1mRNAmRNA表達水平增高，表達水平增高，并且在術(shù)后第并且在術(shù)后第2 2周達到高峰。這也說明了低溫冷凍造成周達到高峰。這也說明了低溫冷凍造成骨內(nèi)存活細(xì)胞死亡以及細(xì)胞膜破壞，使與膜結(jié)構(gòu)有關(guān)骨內(nèi)存活細(xì)胞死亡以及細(xì)胞膜破壞，使與膜結(jié)構(gòu)有關(guān)的抗原結(jié)構(gòu)改變，移植物免疫原性下降。的抗原結(jié)構(gòu)改變，移植物免疫原性下降。 以往研究表明，移植骨的生物學(xué)作用主要體現(xiàn)

33、在以以往研究表明，移植骨的生物學(xué)作用主要體現(xiàn)在以下三個方面：一是提供移植骨本身內(nèi)在的生物學(xué)活性下三個方面：一是提供移植骨本身內(nèi)在的生物學(xué)活性物質(zhì)，即骨內(nèi)存活細(xì)胞及其產(chǎn)物；二是骨基質(zhì)內(nèi)活性物質(zhì)，即骨內(nèi)存活細(xì)胞及其產(chǎn)物；二是骨基質(zhì)內(nèi)活性生長因子誘導(dǎo)宿主來源的未分化間充質(zhì)細(xì)胞成骨，即生長因子誘導(dǎo)宿主來源的未分化間充質(zhì)細(xì)胞成骨，即骨誘導(dǎo)作用；三是充當(dāng)宿主新生骨組織長入的支架，骨誘導(dǎo)作用；三是充當(dāng)宿主新生骨組織長入的支架，即骨傳導(dǎo)作用。即骨傳導(dǎo)作用。 本研究觀察到，在冷凍異體骨移植物的周圍及靠本研究觀察到，在冷凍異體骨移植物的周圍及靠近邊緣的部位有新生骨組織形成，同時局部也有近邊緣的部位有新生骨組織形成

34、，同時局部也有TGF-TGF-1 1mRNAmRNA及蛋白質(zhì)存在。及蛋白質(zhì)存在。 證明了冷凍異體骨移證明了冷凍異體骨移植，后兩種成骨途徑是可能的。但是這種源于骨吸收植，后兩種成骨途徑是可能的。但是這種源于骨吸收后細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子的成骨將是十分緩慢的，并后細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子的成骨將是十分緩慢的，并且新生骨組織總是出現(xiàn)在移植骨表淺的部位，不會與且新生骨組織總是出現(xiàn)在移植骨表淺的部位，不會與移植骨很好地整合在一起。移植骨很好地整合在一起。 EnnekingEnneking等也發(fā)現(xiàn)冷凍骨內(nèi)部等也發(fā)現(xiàn)冷凍骨內(nèi)部“爬行替代爬行替代”主要主要發(fā)生在移植骨淺表面及兩端，移植后發(fā)生在移植骨淺表面及兩端，移

35、植后5 5年，移植骨年，移植骨僅有僅有20%20%被新骨替代，深層未修復(fù)部分仍保持原結(jié)被新骨替代，深層未修復(fù)部分仍保持原結(jié)構(gòu)。構(gòu)。 四、多種因素交互作用影響四、多種因素交互作用影響TGF-TGF-1 1的表達的表達 同種異體骨移植修復(fù)過程中，時間、移植骨處理以同種異體骨移植修復(fù)過程中，時間、移植骨處理以及主要組織相容性抗原是否相配等因素相互作用影響及主要組織相容性抗原是否相配等因素相互作用影響移植骨局部內(nèi)源性移植骨局部內(nèi)源性TGF-TGF-1 1mRNAmRNA的表達。本研究證實，的表達。本研究證實，主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植，在術(shù)后主要組織相容性抗原相配的新鮮異體骨移植，在術(shù)后1 1周周TGF-TGF-1 1 mRNAmRNA表達強度最高，并且新生骨組織出表達強度最高，并且新生骨組織出現(xiàn)最早，成骨效果最好?，F(xiàn)最早，成骨效果最好。 本研究發(fā)現(xiàn)，主要組織相容性抗原相配的異體骨在本研究發(fā)現(xiàn)，主要組織相容性抗原相配的異體骨在冷凍以后，移植骨局部冷凍以后，移植骨局部TGF-TGF-1 1 mRNAmRNA表達降低，而表達降低，而組織抗原不配者