重慶市自然科學(xué)基金

1、項目名稱：凋亡蛋白酶在登革病毒性肝損害發(fā)生中作用的研究 研究內(nèi)容和意見摘要登革出血熱/休克綜合癥的發(fā)生機理尚不明了，新近研究表明：登革病毒NS1蛋白可能參與登革休克的發(fā)生。本研究運用分子生物學(xué)技術(shù)，制備NS1蛋白及其抗體，用流式活性細胞分類法分析NS1蛋白與血管內(nèi)皮細胞的結(jié)合率及其對內(nèi)皮細胞骨架蛋白的影響；整合素2抗體有否阻段效應(yīng)；實施動物實驗，分析感染后血清NS1蛋白濃度與疾病進展的相關(guān)性。主題詞1.主題詞數(shù)量不多于三個; 2.主題詞之間空一格(英文用/分隔)中文登革病毒NS1蛋白內(nèi)皮細胞英文Dengue virus/ NS1 protein/ Endothelium簡表填寫要求一、簡表內(nèi)容

2、將輸入計算機，必須逐項認真填寫，采用國家公布的標準簡化漢字。簡表中所有代碼以最 新發(fā)布的國家自然科學(xué)基金項目分類目錄及代碼為準填寫。高技術(shù)探索課題主題號按高技術(shù) 新概念新構(gòu)思探索課題項目指南中主題號填寫。申請其重點項目時項目類別也填寫B(tài)，并在申請 書封面右上角加注“高技術(shù)探索課題重點項目”。二、凡選擇欄目，將相應(yīng)提示符A、B等之一填入該欄的右下角。三、部分欄目填寫要求： 項目名稱應(yīng)確切反映研究內(nèi)容和范圍，最多不超過25個漢字（包括標點符號）。 基礎(chǔ)研究指以認識自然現(xiàn)象、探索自然規(guī)律為目的，不直接考慮應(yīng)用目標的研究活動。 應(yīng)用基礎(chǔ)研究指有廣泛應(yīng)用前景，但以獲取新原理、新技術(shù)、新方法為主要目的的研

3、究。 申報學(xué)科申請項目所屬的最基礎(chǔ)學(xué)科。如涉及多學(xué)科可填寫兩個，先填為主學(xué)科。 申請金額以萬元為單位，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，注意小數(shù)點。 起止年月起始時間從申請的次年1月算起，終止時間為完成年度的12月。 所用實驗室系指研究項目將利用的實驗室，僅填寫國家計委批準的國家重點實驗室或部門批準的 開放實驗室。 所在單位名稱及代碼按單位公章填寫全稱。例如“中國科學(xué)院西安光學(xué)精密機械研究所”不得填 “中科院西安光機所”或“西安光機所”。全稱中的數(shù)字，一律寫中文，例如： 中國航天工業(yè)總公司第七O一所。首次申請國家自然科學(xué)基金的單位，尚未 編入單位代碼，其代碼暫不填寫。 參加單位數(shù)指研究項目組主要成員所在單位數(shù)

4、，包括主持單位和合作單位（合作者所在單位）， 以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。 項目組主要成員指在項目組內(nèi)對學(xué)術(shù)思想、技術(shù)路線的制訂與理論分析及對項目的完成起重要作 用的人員，本人應(yīng)在申請書上親自簽名。本欄雙線右側(cè)內(nèi)容不輸入計算機。 研究內(nèi)容和意義摘要與主題詞均錄入軟盤。二、立論依據(jù)（包括項目的研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻及出處）對基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國際科學(xué)發(fā)展趨勢，論述項目的科學(xué)意義：對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿，圍繞國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的重要科技問題，論述其應(yīng)用前景。登革熱病毒（Dengue Virus）是屬于黃病毒屬的正股單鏈RNA病毒，它以蚊蟲為媒介，主要引起登革熱和登革出血熱

5、/休克綜合癥(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome, DHF/DSS)。后者為危及患者生命的急癥，死亡率極高，主要死因為出血,休克和肝損害。在我國南方及東南亞，西太平洋，中南美洲均有流行。據(jù)報告，每年世界上熱帶和亞熱帶地區(qū)約有 1億人的健康受到該病毒的威脅。登革感染已成為上述地區(qū)嚴重的公共衛(wèi)生問題。肝損害是登革出血熱的三大死亡原因之一，但其發(fā)生機理尚不明了,缺乏合適的動物模型是肝損害發(fā)生機理不能深入研究的重要原因。在日留學(xué)期間，申請者將對登革敏感的人類肝癌細胞株（HepG2）移入嚴重免疫功能不全(SCID)小鼠體內(nèi)，再用登革病毒感染Hep

6、G2移植SCID小鼠，從而建立了該病毒感染的小鼠模型，首次在動物身上成功地再現(xiàn)了某些DHF/DSS的癥狀，為該病發(fā)生機制的研究奠定了良好的基礎(chǔ)(Virology,1999)。利用該模型，我們對感染后肝臟損害情況做了初步觀察，發(fā)現(xiàn)感染后早期（3 -5天），64%小鼠肝臟的主要病理變化為肝細胞出現(xiàn)凋亡小體,并伴有不同程度的血清轉(zhuǎn)氨酶升高和病毒血癥. 以往的臨床觀察也發(fā)現(xiàn)：登革病毒感染后常有肝臟受累的表現(xiàn)，如黃疸，肝腫大，血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高。尸檢可見肝組織內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體，脂肪變性，枯否氏細胞肥大等。我們的結(jié)果和臨床的研究報道是一致的。這提示肝細胞凋亡可能是登革病毒感染早期肝臟損害的重要病理基礎(chǔ)。因而

7、，弄清登革病毒感染后細胞凋亡發(fā)生的機制，對于闡明肝臟損害的致病機理十分重要，而且，對其早期治療途徑的探索也具有特殊意義。目前，在復(fù)雜的細胞凋亡信號調(diào)控系統(tǒng)中，凋亡蛋白酶家族和核因子NF-kB的作用頗引人注目。細胞凋亡蛋白酶是1994年發(fā)現(xiàn)的哺乳動物蛋白酶，家族成員有10個以上，其中，凋亡蛋白酶3，8，9與細胞凋亡的關(guān)系尤為密切，而凋亡蛋白酶8和9位于3的上游，通過激活3引起該系統(tǒng)的級聯(lián)反應(yīng)，是引發(fā)細胞凋亡的一條重要途經(jīng)。 NF-kB是一種具有多向調(diào)節(jié)作用的核內(nèi)蛋白質(zhì)，正常情況下，以無活性形式存在于細胞漿內(nèi)，當(dāng)某種因素（炎癥，應(yīng)激，感染等）使之激活后，NF-kB的二聚體從抑制亞單位中釋放出來轉(zhuǎn)移

8、至核內(nèi)，與DNA的特定部位結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄，從而參與細胞凋亡的調(diào)控，是細胞應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)控分子。研究證明：多種病毒如艾滋病毒，流感病毒，巨細胞病毒和辛得比斯 (Sindbis) 病毒均能激活NF-kB；此外也有報道認為NF-kB參與調(diào)節(jié)應(yīng)激狀態(tài)肝損害后肝細胞基因的表達。提示NF-kB的活化與肝損害發(fā)生和轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切。但NF-kB在登革病毒性肝損害發(fā)生中的作用尚不清楚。由于NF-kB和凋亡蛋白酶共同參與某些炎癥和非炎癥性疾病的發(fā)生，我們推測：登革病毒的增殖及其蛋白產(chǎn)物在細胞內(nèi)的堆積可能激活NF-kB和凋亡蛋白酶，二者協(xié)調(diào)作用的失衡可能是感染后肝細胞凋亡發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子。因而，本項目擬利用體

9、外培養(yǎng)體系和活體動物實驗，研究感染后NF-kB和凋亡蛋白酶3，9 活性的變化及其在肝細胞凋亡發(fā)生中的作用。旨在闡明登革熱病毒感染后肝損害的發(fā)生機理，并尋找有效的拮抗劑，在基因轉(zhuǎn)錄啟動或信號系統(tǒng)激活的早期，阻斷細胞凋亡的發(fā)生，探索登革熱病毒性肝損害的治療方法。本研究一旦有所發(fā)現(xiàn)，對于其它病毒性肝炎發(fā)生機理的闡明和治療必將具有普遍意義。主要參考文獻：1. An,J., Kimura-kuroda,J., Hi.rabayashi,Y. K.Yasui.(1999).Development of a novel mouse model for dengue virus infection. Viro

10、logy 263,70-77.2.Yamazaki,Y. et al (2000): Cytoskeletal disruption accelerates caspase-3 activation in DNA damage-induced apoptosis. Ex. Cell Res.259:64-78.3.Nakajima K. et al(2000), Structure,expression and function of the Xenopus laevis caspase family. J.B.C, 275:10484-10491. 4. Bitzer M et al(199

11、9): Sendai virus infection induces apoptosis through activation of caspase-8(FLICE) and caspase-3(CPP32). J.virol.73;702-7085.Geisbert,TW et al (2000):Apoptosis induced in vitro and in vivo during infection by ebola and marburg viruses.Lab.Invest.80:171-1856.Takizawa T et al (1999): Recruitment of a

12、poptotic cysteine proteases(caspases) in influenza virus-induced cell death. Microbiol.Immunol,43,245-252,1999.7. Clem RJ et al(1998): Modulation of cell death by Bcl-XL through caspase interaction. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 95;554-5598. Hida A et al(2000), Nuclear factor kappa B and caspases co-oerat

13、ively regulate the activation and apoptosis of human macrophages, Immunol.99:553-560.9.安靜，等： dengue viru感染 用 T cell 病 與作用。日本第48屆病毒學(xué)會。2000。三重10.Havert,MB et al (2000):Activation of divergent neuronal cell death pathways indifferent target cell populations during neuroadapted sindbis virus infection o

14、f mice. J.Viorl.,74:5352-6.3三、研究方案研究目標、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究內(nèi)容：(1) HepG2 細胞的培養(yǎng) ：DMEM 含10%FBS，常規(guī)培養(yǎng)， 小鼠肝細胞的培養(yǎng)：首先用灌流方法分離肝細胞，然后常規(guī)培養(yǎng)。胎兒肝細胞長期培養(yǎng)方法的建立。(2) 感染實驗：用登革熱病毒分別感染HepG2 細胞、小鼠肝細胞和胎肝細胞，做下列分析。(3) 觀察指標； 細胞的形態(tài)學(xué)變化，特別是嗜酸小體的出現(xiàn)； 病毒的增殖滴度的檢測和病毒蛋白在細胞內(nèi)分布情況的觀察。 從感染細胞中抽出核酸產(chǎn)物，分析DNA的降解。 檢測感染細胞之細胞凋亡的發(fā)生率及與病毒增殖的關(guān)系。 檢測感染細胞NF-k

15、B因子的活性變化和和凋亡蛋白酶3 .8活性的變化并分析二者與病毒增殖和細胞凋亡發(fā)生的相關(guān)性。 抑制NF-kB與DNA的結(jié)合或四肽化合物DEVD-CHO抑制凋亡蛋白酶，觀察其對細胞凋亡發(fā)生的影響。（4）動物實驗的實施：利用已建立的登革感染小鼠模型，從整體水平經(jīng)時觀察感染后肝功能的變化，肝臟組織形態(tài)學(xué)變化特別是細胞凋亡的發(fā)生率及整體條件下寡核苷酸和四肽化合物對細胞凋亡發(fā)生的抑制作用。預(yù)測目標：（1） 闡明NF-kB和凋亡蛋白酶在登革熱病毒引發(fā)的肝細胞凋亡中的作用。（2） 初步解明PDTC (Prrylidine dithiocarbamate)或四肽化合物（DEVD-CHO）對肝細胞凋亡的抑制作用

16、。 擬解決的關(guān)鍵問題：闡明NF-kB和凋亡蛋白酶在登革出血熱之肝臟損害中的作用及其機理。尋找拮抗劑，為病毒性肝損害的早期治療開辟新途徑。2擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析 研究方法，技術(shù)路線和實驗方案：一、登革病毒對肝細胞的影響體外實驗(1) HepG2 細胞培養(yǎng) ：DMEM 含10%FBS，常規(guī)培養(yǎng)， 小鼠肝細胞的培養(yǎng)：首先用灌流方法分離肝細胞，然后置37二氧化碳培養(yǎng)廂中培養(yǎng)（DMEM 含10%FBS）。 胎兒肝細胞的培養(yǎng)：剪碎肝組織，用0.025% 的膠原酶（I型）孵育（37，1小時）后，過濾、離心，分離細胞。Williams E 培養(yǎng)基（含10% FBS,EGF及胰島素）

17、。(2) 感染實驗：用登革熱病毒2（Tr1751株）分別感染Hep G2 細胞、小鼠肝細胞和胎肝細胞。觀察時相點：擬于感染后12，24，36，48，60，72，96小時, 對下列指標做動態(tài)分析。(3) 觀察指標： 利用H.E.染色和TUNEL染色法觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化特別是有無細胞凋亡發(fā)生。 TUNEL法分析感染細胞DNA的降解情況，以了解細胞凋亡的發(fā)生率。方法的基本原理是將感染的細胞與FITC 標記的dUTP及 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶孵育，斷裂的DNA片段將被FITC 標記，用流式細胞儀檢測并計算陽性細胞數(shù)，即為凋亡細胞的發(fā)生率。 分別用空斑試驗和熒光抗體法分析培養(yǎng)上清中的病毒滴度和細胞中病毒

18、蛋白抗原的分布，研究病毒增殖，蛋白在細胞內(nèi)堆積與細胞凋亡的相關(guān)性。 用凝膠阻滯法分析感染后核因子NF-kB 活性的變化。該方法主要分三步：32P標記DNA探針；制備核蛋白核抽提物；凝膠阻滯分析。 細胞內(nèi)凋亡蛋白酶3活性的測定：應(yīng)用PhiPhiLux G1D2 Kit (MBL)進行測定，方法的原理是將rhodamine標記的DEVD（凋亡蛋白酶3 的底物）與所收集的感染細胞孵育，激活的凋亡蛋白酶3將與底物反應(yīng)，故流式細胞儀記數(shù)的陽性細胞百分比將代表凋亡蛋白酶3的活性。 細胞內(nèi)凋亡蛋白酶8活性的測定利用其單抗，應(yīng)用Western blotting進行半定量。 應(yīng)用PDTC (Prrylidine

19、 dithiocarbamate)，抑制NF-kB與DNA的結(jié)合，觀察其對細胞凋亡發(fā)生的影響。以闡明NF-kB在登革病毒感染后肝細胞凋亡發(fā)生中的作用。 分別應(yīng)用四肽化合物DEVD-CHO和IETO-FMK抑制凋亡蛋白酶3 和8，觀察其對細胞凋亡發(fā)生的影響，以闡明凋亡蛋白酶在登革病毒感染后肝細胞凋亡發(fā)生中的作用。 同時應(yīng)用PDTC、 DEVD-CHO和IETO-FMK, 以觀察NF-kB和凋亡蛋白酶兩系統(tǒng)的協(xié)同作用對登革病毒感染后肝細胞凋亡發(fā)生的影響。 二、登革病毒對肝臟功能的影響動物實驗：利用已建立的登革感染小鼠模型，從整體水平經(jīng)時觀察感染后肝功能的變化，肝臟組織形態(tài)學(xué)變化特別是細胞凋亡的發(fā)生

20、率及整體條件下PDTC和四肽化合物對細胞凋亡發(fā)生的影響?？尚行苑治觯?.已有一定的工作積累：申請者在日留學(xué)期間，在日本東京都神經(jīng)科學(xué)研究所微生物研究室保井先生的指導(dǎo)下一直從事登革病毒的研究工作。經(jīng)過幾年的努力，申請者成功地制作了小鼠的登革感染動物模型，初步觀察了感染后肝臟的形態(tài)和功能的變化，獲得了較好的結(jié)果。同時，申請者學(xué)習(xí)了質(zhì)粒制作，DNA轉(zhuǎn)染，探針制備，原位雜交等分子生物學(xué)技術(shù)，積累了豐富的研究經(jīng)驗。申請者熟悉該項目中所涉及的技術(shù)方法，在技術(shù)上保證了該項目的順利進行。2.具有相應(yīng)的研究條件： 國內(nèi)有嚴重免疫功能不全（SCID）小鼠生產(chǎn)；我校有SPF動物房和感染動物房，中心儀器室有超速冷凍離

21、心機，流式細胞儀等；我室有細胞培養(yǎng)室及本實驗必要的細胞株（如Cos7,HepG2,Vero,C6/36等）及其它必要的儀器設(shè)備。而且，實驗所需小的實驗器材和試劑均可由國內(nèi)購入。因而本研究課題從條件上是可行的。3. 本項目的創(chuàng)新之處本項目擬將培養(yǎng)體系和動物實驗結(jié)合起來，研究NS1蛋白與內(nèi)皮細胞的結(jié)合、可能機理及其這種結(jié)合在登革休克發(fā)病中的作用。這是本項目在思維方法上的創(chuàng)新之處。4. 年度研究計劃及預(yù)期進展第一年度：(1) 小鼠肝細胞的分離與培養(yǎng)及HepG2 細胞的培養(yǎng)。(2) 培養(yǎng)體系感染實驗的予實驗(3) 感染實驗的正式實驗，收集標本，完成培養(yǎng)體系各種指標的檢測。第二年度 (1) 動物實驗：H

22、epG2移植SCID小鼠的制作，預(yù)實驗。（2） 動物實驗：感染實驗，收集標本，完成即刻檢測指標的分析第三年度 （1） 動物實驗：完成病毒滴度的檢測和病毒抗原分布的分析，形態(tài)學(xué)變化； 必要的補充實驗。(2). 資料匯總，撰寫論文。5. 預(yù)期研究成果(1)本研究擬從分子水平和整體水平研究細胞凋亡信號調(diào)控系統(tǒng)在登革熱病毒感染后肝臟損害中的致病作用，期望為闡明登革病毒性肝損害的發(fā)病機制提供理論基礎(chǔ)，并為治療開辟新途徑（2）研究結(jié)果以論文（2-3篇）形式在國內(nèi)外發(fā)表四、研究基礎(chǔ)與本項目有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績（1）申請者自1993年赴日留學(xué)以來，一直從事登革病毒感染癥的研究。經(jīng)過幾年努力

23、， 成功地制作了小鼠的登革感染模型，于1997年在第四屆flavivirus國際學(xué)會和日本病毒學(xué)會上報告，受到同行的好評。該項工作揭載在1999年Virology上。在此基礎(chǔ)上，為研究感染后宿主肝損害的發(fā)生機理，申請者初步觀察了感染后早期小鼠肝功能變化和肝臟的病理形態(tài)學(xué)變化，取得了有較好苗頭的實驗結(jié)果，為本項目奠定了一定的工作基礎(chǔ)。現(xiàn)申請者已經(jīng)完成登革病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)傳播與增殖規(guī)律及登革病毒特異性T 細胞在登革出血熱/休克綜合癥發(fā)病中的作用機理的研究，此兩項工作已總結(jié)成文并投稿。2. 已具備的實驗條件,尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑(包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況)我校中心儀器室擁有流式細胞儀，高速冰凍離心機，電子顯微鏡等設(shè)備；同時有SPF動物房和感染動物房。另外，我室有蛋白分離純化系統(tǒng)（BIO-RAD）、組織培養(yǎng)室等必要的實驗條件，本項目可以利用上述條件在預(yù)定的時間內(nèi)完成。7五、經(jīng)費預(yù)算支出科目金額（萬元）計算根據(jù)及理由合計23.001.科研業(yè)務(wù)費3.000.50資料費1.00學(xué)術(shù)會議費1.50論文發(fā)表費2.實驗材料費17.503.00含Taq酶，連接酶、內(nèi)切酶及脂質(zhì)體等，2.00電鏡、共焦點激光顯微鏡及流式細胞儀等使用費1.50組織培養(yǎng)用試劑，4.00生化，