相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)唐冬雪概述

1、1相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)唐冬雪2016-06-072 蛋白質(zhì)是生命過(guò)程的真正執(zhí)行者，蛋白質(zhì)相互作用與生命健康息息相關(guān)。因此，蛋白質(zhì)互作研究也是基礎(chǔ)生命科學(xué)的一個(gè)重點(diǎn)研究領(lǐng)域. 生物體的生理功能主要由細(xì)胞中的蛋白質(zhì)控制和調(diào)節(jié)。其中，多數(shù)蛋白質(zhì)是通過(guò)與配體結(jié)合或是作為蛋白質(zhì)復(fù)合物中的一部分參與細(xì)胞的代謝過(guò)程。因此，研究蛋白質(zhì)間的相互作用是理解生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。3蛋白質(zhì)相互作用研究方法一、酵母雙雜交技術(shù)二、免疫共沉淀技術(shù)三、細(xì)胞共定位技術(shù)四、GST Pull-down技術(shù)五、FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)）六、BiFC（雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)）七、TAP（串聯(lián)親和純化技術(shù)）八、Far-Western blot

2、（親和印跡技術(shù)）4一、酵母雙雜交技術(shù)1. 基本概述2. 基本過(guò)程3. 應(yīng)用與優(yōu)缺點(diǎn)5基本概述酵母雙雜交系統(tǒng)( Yeast two-hybrid system,Y2H)是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)利用了酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，含有的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，DNA結(jié)合域(DNA binding domain,BD)及轉(zhuǎn)錄激活域(activation domain,AD)，將已知基因（誘餌基因）和靶基因分別構(gòu)建在含BD及AD質(zhì)粒載體上，將兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，若BD結(jié)合的誘餌蛋白能夠與AD結(jié)合的靶蛋白或文庫(kù)中的某些cDNA編碼的蛋白相互作用、彼

3、此間結(jié)合時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致位于側(cè)翼的BD與AD在空間上接近，呈現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子的完全活性，激活下游的報(bào)告基因表達(dá)，從而在特定的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。6原理示意圖78His3是編碼組氨酸合成的基因，-AT是它的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑；ADE2是編碼腺苷酸合成酶的基因。 lacZ是編碼-半乳糖苷酶的基因，可以用-半乳糖實(shí)驗(yàn)測(cè)定活性。 MEL1編碼-半乳糖苷酶，可以降解X-Gal，產(chǎn)生藍(lán)色。GAL1, GAL2和 MEL1 的上游激活序列(UAS)應(yīng)答于GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子。AH109衍生于 PJ69-2A菌株，包括ADE2,HIS3營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記和一個(gè)內(nèi)源的MEL1基因，lacZ 報(bào)告基因被引入PJ69-2A而得到AH

4、109菌株。9基本過(guò)程構(gòu)建表達(dá)載體pGBKT7-Bait醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株感受態(tài)Bait菌株自激活驗(yàn)證含BD-Bait酵母與文庫(kù)中酵母混合培養(yǎng)形成二倍體在三缺培養(yǎng)基篩選將陽(yáng)性克隆劃線(xiàn)至缺陷培養(yǎng)基檢測(cè)對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行Colony PCR后測(cè)序拿測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST找出相應(yīng)基因構(gòu)建表達(dá)載體pGADT7-Prey（或直接提質(zhì)粒）醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株感受態(tài)Prey菌株自激活驗(yàn)證將BD-Bait與AD-Prey用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株感受態(tài)，涂到三缺培養(yǎng)基上驗(yàn)證相互作用（也可用其他方法驗(yàn)證）10/ATGGCG

5、TCTT ACCAGAACCG TCCAGGAGGT CAGGCCACTG ACGAGTACGG AAACCCGATC CAGCAGCAGT ATGACGAGTA CGGAAATCCG ATGGGAGGAG GAGGATACGG AACTGGTGGT GGTGGAGGAG CTACAGGTGG CCAAGGATAC GGAACAGGTG GCCAAGGGTA CGGATCAGGT GGCCAAGGGT ACGGAACCGG TGGCCAAGGA TACGGAACCG GGACCGGGAC TGAAGGCTTT GGAACTGGCGGAGGAGCTAG GCACCACGGC CAAGAGCAAC

6、 TCCACAAGGA AAGTGGTGGTGGCTTGGGAG GAATGCTTCA CCGCTCCGGA TCTGGATCCA GCTCTAGCTC GGAGGATGAT GGACAAGGAG GGAGGAGGAA GAAGGGAATA ACACAAAAGA TCAAGGAGAA GTTGCCAGGT CATCATGATC AGTCTGGTCA AGCTCAAGCG ATGGGCGGCA TGGGATCCGG ATATGATGCT GGTGGCTACG GTGGTGAGCA CCACGAGAAG AAGGGGATGA TGGACAAGAT CAAGGAAAAG CTTCCCGGTG GTG

7、GCCGTTA A 11應(yīng)用 發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì) 鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用 建立基因組蛋白連鎖圖12優(yōu)點(diǎn)1. 快速獲得相互作用蛋白質(zhì)的基因；2. 檢測(cè)在真核活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況；3. 作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后，在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟；4. 檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用；13缺點(diǎn)1. 分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴(lài)于翻譯后加工，如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無(wú)法進(jìn)行；2. 有些蛋白的正確折疊和功能有賴(lài)于其他非酵母蛋

8、白的輔助，這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。14二、免疫共沉淀技術(shù)1. 基本概述2. 基本過(guò)程3. 優(yōu)缺點(diǎn)15基本概述免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的、用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。原理：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。 16IP and Co-IP 免疫沉淀(IP)是利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來(lái)，初步分離靶蛋白的一種方法。 免

9、疫共沉淀(Co-IP)是一種在體外探測(cè)兩個(gè)蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。如果兩個(gè)蛋白在體外體系能夠發(fā)生特異性相互作用的話(huà)，那么當(dāng)用一種蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí)，另一個(gè)蛋白也會(huì)被同時(shí)沉淀下來(lái)。17基本過(guò)程非離子去污劑(Triton X-100)裂解細(xì)胞在細(xì)胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗體protein A-sepharose孵育 SDS-PAGE, western-blotting或質(zhì)譜儀分析鑒定樣品 洗脫蛋白復(fù)合物1819優(yōu)點(diǎn)1.它檢測(cè)的是細(xì)胞裂解原液中所有蛋白質(zhì)與待測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用；2.抗原和抗體的相互作用是在生理濃度的條件下被檢測(cè)的，因此過(guò)量表達(dá)所帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果可以被排除；

10、3.可以檢測(cè)到在體內(nèi)形成的天然復(fù)合物；4. 依賴(lài)于或不依賴(lài)于修飾的蛋白質(zhì)相互作用都可以被檢測(cè)到。20缺點(diǎn)1.可能檢測(cè)不到低親和力及瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；2.兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用，即間接結(jié)合的相互作用可能檢測(cè)不到；3.必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。21三、細(xì)胞共定位技術(shù)1. 基本概述2. 基本過(guò)程3. 優(yōu)缺點(diǎn)22基本概述 免疫熒光法研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的細(xì)胞共定位 基本原理：將已知的抗體或抗原分子標(biāo)記上熒光素，在與其相應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)，從而形成的免疫復(fù)合物上帶

11、有一定量的熒光素，在熒光顯微鏡下就可以看見(jiàn)熒光的抗原抗體結(jié)合部位，檢測(cè)出抗原或抗體。 用已知的熒光素標(biāo)記抗體檢測(cè)相應(yīng)抗原的方法稱(chēng)為熒光抗體法，用已知的熒光素標(biāo)記抗原檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法稱(chēng)為熒光抗原法。23按照抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合步驟，免疫熒光染色方法有：直接法：用熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原結(jié)合，以檢查出相應(yīng)的抗原成分。間接法：檢測(cè)未知抗原時(shí)先用特異性抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的抗體，再用熒光素標(biāo)記的間接抗體與特異性抗體相結(jié)合，形成抗原-特異性抗體-間接熒光抗體的復(fù)合物。補(bǔ)體法：用特異性抗體和補(bǔ)體的混合物與標(biāo)本上的抗原反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在抗原-抗體復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體的熒光抗體與補(bǔ)體結(jié)合

12、，從而形成抗原-抗體-抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物。在研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)中，最常用的免疫熒光技術(shù)是間接法?？乖词撬芯康陌械鞍住?4基本過(guò)程 構(gòu)建表達(dá)載體； 浸染植株，獲得抗性苗； 在熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察。25 例：藍(lán)色光激發(fā)下融合GFP的A蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核內(nèi)，顯示綠色；在綠色光激發(fā)下融合RFP的B蛋白質(zhì)也定位于細(xì)胞核內(nèi)，顯示紅色，而不再有細(xì)胞質(zhì)的定位，說(shuō)明A蛋白質(zhì)的表達(dá)影響了B蛋白質(zhì)的定位，使之由胞漿、胞核廣泛分布，變化為特異性的細(xì)胞核定位，而且B蛋白質(zhì)與A蛋白質(zhì)具有共同的核定位。26 在另外一些情況下，可能會(huì)觀察到兩種蛋白質(zhì)單獨(dú)表達(dá)與共同表達(dá)的定位結(jié)果相同，而且不具

13、有共同的細(xì)胞內(nèi)分布，比如A蛋白質(zhì)分布在細(xì)胞質(zhì)，B蛋白質(zhì)分布在細(xì)胞核，定位具有明顯的差異，但不能因此而斷定A蛋白質(zhì)與B蛋白質(zhì)不存在相互作用，需要考慮的因素有細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞周期、細(xì)胞的生理狀態(tài)、所受到的外界信號(hào)刺激等。某些蛋白質(zhì)的定位強(qiáng)烈依賴(lài)于細(xì)胞類(lèi)型，在一種細(xì)胞系內(nèi)可能定位在細(xì)胞質(zhì)，在另一種細(xì)胞系內(nèi)可能定位在細(xì)胞核，需要視具體情況具體分析。27優(yōu)點(diǎn) 在操作上比較容易掌握，步驟簡(jiǎn)便，可以隨時(shí)觀察，根據(jù)熒光表達(dá)的強(qiáng)弱適時(shí)選擇觀察時(shí)間。缺點(diǎn) 靶蛋白與熒光蛋白的融合蛋白質(zhì)必須經(jīng)過(guò)浸染，在植株內(nèi)表達(dá)后，才能觀察。28四、 GST pull-down 技術(shù) 1. 基本概述 2. 基本過(guò)程 3. 應(yīng)用29基本

14、概述 1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白。從此，GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到了極大的推廣。30基本過(guò)程 將誘餌蛋白質(zhì)和GST標(biāo)簽融合表達(dá)，一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液培育，之后利用谷胱甘肽-Sepharose將GST-融合蛋白-目的蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后進(jìn)行SDS-PAGE，鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。31應(yīng)用 鑒定與已知融合蛋白質(zhì)相互作用的未知蛋白質(zhì)； 鑒定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之問(wèn)是否存在相互作用。32五、FRET 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(Fluorescen

15、ce Resonance Energy Transfer, FRET)檢測(cè)活體中生物大分子納米級(jí)距離和納米級(jí)距離變化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、細(xì)胞生理研究、免疫分析等方面有著廣泛的應(yīng)用。 熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。33 原理：當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個(gè)分子的距離在10nm范圍以?xún)?nèi)時(shí)，就會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)（敏化熒光）。 34 青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein, CFP)與黃

16、色熒光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)為目前蛋白-蛋白相互作用研究中最廣泛應(yīng)用的FRET對(duì)。CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜相重疊。 將供體蛋白CFP和受體蛋白YFP分別與兩種目的蛋白融合表達(dá)。當(dāng)兩個(gè)融合蛋白之間的距離在5-10nm的范圍內(nèi)，則供體CFP發(fā)出的熒光可被YFP吸收，并激發(fā)YFP發(fā)出黃色熒光，此時(shí)通過(guò)測(cè)量CFP熒光強(qiáng)度的損失量來(lái)確定這兩個(gè)蛋白是否相互作用。35 兩個(gè)蛋白距離越近，CFP所發(fā)出的熒光被YFP接收的量就越多，檢測(cè)器所接收到的熒光就越少。 在生物體內(nèi)，如果兩個(gè)蛋白質(zhì)分子的距離在10nm之內(nèi)，一般認(rèn)為這兩個(gè)蛋白質(zhì)分子存在直接相互作用。

17、 36 優(yōu)點(diǎn)：（1）蛋白質(zhì)之間的相互作用是發(fā)生在活細(xì)胞內(nèi)，比較完整地反映了蛋白質(zhì)在生理狀態(tài)的活動(dòng)。（2）利用這種方法，可以觀察到蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位。37六、BiFC雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)是由Hu 等在2002 年最先報(bào)道的一種直觀、快速地判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用的新技術(shù)。在GFP的兩個(gè)片層之間的環(huán)結(jié)構(gòu)上有許多特異位點(diǎn)可以插入外源蛋白而不影響GFP的熒光活性，BiFC技術(shù)正是利用該熒光蛋白家族的這一特性，將熒光蛋白分割成兩個(gè)不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標(biāo)蛋白連接。如果兩個(gè)目標(biāo)蛋白因

18、為有相互作用而接近，就使得熒光蛋白的兩個(gè)分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團(tuán)而發(fā)出熒光。38基本過(guò)程1. 將目的基因插入到含有N片段或C片段的載體中，構(gòu)建成融合蛋白表達(dá)載體； 2. 浸染植株，獲得抗性苗；3. 熒光顯微鏡下觀察是否有熒光并判斷是否有相互作用。3940優(yōu)勢(shì)1. 能在顯微鏡下直接觀察到蛋白相互作用而且不依賴(lài)于其它次級(jí)效應(yīng)； 2. 該相互作用可以在活細(xì)胞中進(jìn)行觀察，排除了由于細(xì)胞裂解或固定可能帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果；3. 蛋白質(zhì)在近似生理?xiàng)l件的環(huán)境下表達(dá)，表達(dá)水平及特性如翻譯后修飾極大地接近于內(nèi)源蛋白；4. 不需要蛋白質(zhì)有特別的理論配比，能檢測(cè)到不同亞群蛋白質(zhì)間的相互作用； 5

19、. 多色BiFC技術(shù)不僅能同時(shí)檢測(cè)到多種蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成，還能夠?qū)Σ煌鞍踪|(zhì)間產(chǎn)生相互作用的強(qiáng)弱進(jìn)行比較；6. BiFC技術(shù)除了熒光倒置顯微鏡外，不要求特殊的設(shè)備。41七、TAP 串聯(lián)親和純化技術(shù)(tandem affinity purification, TAP)是近年來(lái)發(fā)展的一種能夠快速研究生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)相互作用、揭示蛋白質(zhì)復(fù)合體相互作用網(wǎng)絡(luò)的新技術(shù)，如今已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)被廣泛采納的工具。此技術(shù)使用特別設(shè)計(jì)的純化標(biāo)簽在非常接近于生理?xiàng)l件的情況下，能捕捉出特定的蛋白質(zhì)及其作用伙伴，借助于質(zhì)譜分析技術(shù)，即可鑒別出這種蛋白質(zhì)相互作用組。42基本過(guò)程帶有TAP標(biāo)簽的融合蛋白在細(xì)胞中表達(dá)，且與內(nèi)源相互作用蛋白形成復(fù)合物，細(xì)胞裂解后經(jīng)IgG偶聯(lián)的層析柱純化，蛋白A與IgG特異結(jié)合，從而使含有標(biāo)簽的復(fù)合物得到第一次純化。為除去與柱填料非特異結(jié)合的蛋白，用TEV酶切割分離蛋白A標(biāo)簽，使含有靶蛋白的復(fù)合物與層析柱分離，并經(jīng)過(guò)鈣調(diào)素偶聯(lián)的親