DNA酶切及凝膠電泳

1、DAN酶切及凝膠電泳酶切及凝膠電泳DNA限制性內(nèi)切酶的酶切分析限制性核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子特定的核甘酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類DNA水解酶，是體外剪切基因片段的重要工具，常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。限制性核算內(nèi)切酶的相關知識：1. 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象2. 核酸限制性內(nèi)切酶的類型及基本特性3. 同裂酶和同尾酶4. 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素1. 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細胞的一種防衛(wèi)手段。限制性核酸內(nèi)切酶是由細菌產(chǎn)生的，其生理意義是提高自身的防御能力。限制酶限制外源

2、DNA存在于自身細胞內(nèi)，但合成這種酶的細胞自身的DNA不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的DNA進行了修飾，限制性酶對修飾過的DNA不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。2.核酸限制性內(nèi)切酶的類型及基本特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：型、型、型。型型：限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類酶如：EcoB 、EcoK等。型型：限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。這類限制酶識別的專一核苷酸順序常見的是4至

3、6個核苷酸，其識別順序是一個回文對稱順序回文對稱順序，即有一個中心對稱軸。型酶的切割有兩種方式，分別生成平頭末端、粘性末端。平頭末端平頭末端：在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端，這種末端可以通過DNA連接酶連接起來。例如EcoRV的識別位置是：5GATATC33CTA TAG5粘性末端粘性末端：是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，其斷裂的磷酸二酯鍵和氫鍵可通過DNA連接酶連接起來。例如：EcoRI的識別順序5GAA TT_C33C_TT AAG5型型：限制性內(nèi)切酶有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈，切割

4、后產(chǎn)生的一定長度D N A 片 段 ， 具 有 各 種 單 鏈 末 端 。 結(jié)論：結(jié)論：型限制性內(nèi)切酶的特性使它在分子克隆中得到了廣泛應用，是重組DNA的基礎。3.同裂酶和同尾酶同裂酶同裂酶：有時兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，其差別只在于當識別順序中有甲基化的核苷酸甲基化的核苷酸時，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。這些有相同切點的酶稱為同裂酶。同尾酶同尾酶：有時兩種酶切割順序不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶，可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生一個新的酶切位點。4.影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素a.

5、 DNA的純化b. DNA的甲基化程度c. 酶切消化反應的溫度d. DNA的分子結(jié)構(gòu)e. 溶液中離子濃度及種類f. 緩沖液的PH值用途用于DNA基因組物理圖譜的組建；基因的定位和基因分離；DNA分子堿基序列分析；比較相關的DNA分子和遺傳工程。電泳概述帶電質(zhì)點在電場中向與其相反的電極進行泳動的現(xiàn)象，稱為電泳或離子泳。基本原理基本原理：交替溶液中的蛋白質(zhì)、肽都具有可解離的基團，在溶液中形成帶正電荷或帶負電荷或咪唑基的質(zhì)點。在酸性溶液中，由于 H+濃度較大，它能抑制蛋白質(zhì)分子中的羥基解離出 H+，使更多的-NH2接受 H+形成-NH2+，因此，在酸性溶液中，蛋白質(zhì)帶有較多的正電荷，在外加電場中，向

6、負極移動；反之，在堿性溶液中，氫氧根離子中和羥基中的氫離子，蛋白質(zhì)帶有較多的負電荷，在外電場作用下，向正極移動。分類分類：按照分離原理的不同，可分為：區(qū)帶電泳、移界電泳、等速電泳、等電聚焦電泳應用應用：生物學上的可移動大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)及核酸等，具有可以電離的基團，在具有一定pH值的溶液中，能夠形成帶電荷的陽離子和陰離子，通過電泳方法可以將處于同一體系的不同組分分開。凝膠電泳技術 凝膠電泳是以各種具有網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)的凝膠為支持物的電泳技術。同時，凝膠電泳具有電泳和分子篩的雙重作用，有很高的分辨能力。凝膠電泳的支持介質(zhì)一般有以下幾種：（1）淀粉凝膠（2）瓊脂糖凝膠，適用于分離大分子核；

7、（3）聚丙烯酰胺凝膠，普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。 凝膠電泳優(yōu)點(1) 樣品不易擴散(2) 制備簡單，時間短；(3) 將分子篩效應和電荷效應結(jié)合在同一方法中，提高分辨能力； (4) 需要合成用的原料純凈，制成的多聚物的再現(xiàn)性高，因此樣品分離的重復性也比較高； (5) 可以隨意控制凝膠濃度，按需要可制作不同孔徑的凝膠；(6) 一定濃度范圍內(nèi)透明性好，機械輕度好，有彈性；(7) 鏈上具有不活潑的酰胺基，沒有帶電的其他離子基，所以電泳時不會產(chǎn)生電滲；(8) 用途廣泛，可以對核酸、蛋白質(zhì)等生物高分子進行分離、定量、定性、分子量的測定；(9) 需要樣品量少，1-100g 已經(jīng)足夠。瓊脂糖凝膠電泳

8、 瓊脂電泳是用瓊脂糖或優(yōu)質(zhì)瓊脂粉作支持物的一種電泳方法。該法主要用于研究核酸等大分子物質(zhì)，是分子生物學中不可缺少的研究手段之一。用瓊脂糖膠分離雙鏈 DNA時，其遷移率大小，主要與樣品的相對分子質(zhì)量有關，而與核酸的一級結(jié)構(gòu)一級堿基的組成無關。利用瓊脂糖電泳分離和分析蛋白質(zhì)和核酸的基本原理是電荷效應電荷效應及分子篩效應分子篩效應。 以瓊脂糖凝膠電泳實驗為例，待測 DNA 片段與已知濃度的DNA片段同時進行電泳，根據(jù)結(jié)合的溴化乙錠熒光強度，分析其含量： 1. 原理原理溴化乙錠(EB)在紫外線照射下能夠發(fā)射熒光。當 DNA 樣品在含有適量 EB 的瓊脂糖凝膠中進行電泳時，其中插入到 DNA 分子中的

9、EB 與之形成熒光混合物，使 DNA 發(fā)射的熒光增強幾十倍。熒光強度與 DNA 含量成正比關系。為了能夠比較出待測樣品的濃度，只需把已知濃度的標準樣品作為瓊脂糖凝膠電泳的對照。用肉眼可以檢測到0.010.1mg DNA，薄層分析掃描儀可以檢測到 510ng DNA。2.儀器紫外投射反射分析儀，電泳槽，電泳儀。圖1 電泳槽圖2 電泳儀電源3.試劑試劑(1) 6*上樣緩沖液：0.25%溴酚藍，40%（W/V）蔗糖水溶液； (2) 50*TAE電泳緩沖液：Trish 堿 242g，冰乙酸 57.1ml，0.5mol/L EDTA100ml，加水溶解后定量 1000ml； (3) 5mg/ml EB（

10、溴化乙錠）：0.5g EB，100ml 雙蒸水。4.操作步驟操作步驟(1) 稱取 1g 瓊脂糖凝膠干粉，加 100ml 1*TAE 電泳緩沖液，加熱使瓊脂糖熔化均勻，取出后室溫冷卻至 5060；（制作凝膠液） (2) 將膠倒入制膠槽中，并插入樣品梳，待充分凝固后拔出樣品梳；（插梳子） (3) 將凝膠板放入電泳槽中，加入 1*TAE 電泳緩沖液，使液面略高于凝膠 1*TAE電泳緩沖液；（加電泳緩沖液） (4) 5l DNA 樣品加 1l 6*凝膠加樣緩沖液，攪拌均勻后全部加入凝膠板的樣品孔中；在另一加樣孔中加 5l 已知片段大小的 DNA 標準溶液；（上樣）(5) 打開電源開關，電壓 100V，電泳約