玉環(huán)疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書

1、玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第1頁1目的與適用范圍本標準規(guī)定了各種染色法、培養(yǎng)基和試劑。本標準適用于食品和食物中毒樣品中各類微生物的檢驗。2 染色液配制及染色法2.1 革蘭氏染色法（可按成品試劑上的說明操作）2.1.1 結(jié)晶紫染色液結(jié)晶紫1g95%乙 醇20mL1%草酸銨水溶液80mL將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。2.1.2 革蘭氏碘液碘1g碘化鉀2g蒸餾水300mL將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至 300mL。2.1.3 沙黃復(fù)染液沙黃0.25g95%乙 醇

2、10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。2.1.4 染色法2.1.4.1 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。2.1.4.2 滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。2.1.4.3 滴加95%乙醇脫色，約 30s ;或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s。2.1.4.4 水洗，滴加復(fù)染液，復(fù)染1min。水洗，待干，鏡檢。2.1.5 結(jié)果革蘭氏陽性菌呈紫色。革蘭氏陰性菌呈紅色。注：亦可用1: 10稀釋石炭酸復(fù)紅染色液作復(fù)染液，復(fù)染時間僅需10s。2.2吉氏染色法（可按成品試劑上的說明操作）吉氏粉0.5g中性甘油25mL甲醇25mL將染

3、粉加少量甘油研磨，邊研邊加，至甘油加完為止，傾入100mL玻塞瓶內(nèi)，加入甘油，塞緊瓶塞，充分搖勻，置室溫下35天，即為原液，臨用時稀釋。2.2.4 染色法2.2.4.1 將血片用甲醇固定約1 min。2.2.4.2 滴加10%染液染45 min。水洗，待干，鏡檢。2.3 硼砂美藍染色法玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第2頁2.3.1 硼砂3g2.3.2 美藍2g置研缽內(nèi)，邊研邊加水，待溶解后沖入瓶中，加蒸餾水100mL配成原液，過濾后備用.染色時取原液 5mL,加清水配成稀釋液。2.3.3 染色法血片染35 min，使血

4、膜呈天藍色，水洗，待干，鏡檢。2.4 耐酸性染色法（萎倪二氏法）（可按成品試劑上的說明操作）2.4.1 石炭酸品紅染色液堿性品紅0.3g95%乙 醇10mL5%酚水溶液90mL將品紅溶解于乙醇中，然后與酚溶液混合。2.4.2 3%鹽酸乙醇濃鹽酸3mL95%乙 醇97mL2.4.3 復(fù)染液呂氏堿性美藍染色液。2.4.4 染色法2.4.4.1 將涂片在火焰上加熱固定，滴加石炭酸品紅染色液，徐徐加熱至有蒸氣出現(xiàn)，但切不可使沸騰。染液如因蒸發(fā)減少時，應(yīng)隨時添加。染5min，傾去染液，水洗。2.4.4.2 滴加鹽酸乙醇脫色，直至無紅色脫落為止（所需時間視涂片厚薄而定，一般為13min），水洗。2.4.4

5、.3 滴加呂氏堿性美藍染色液，復(fù)染30s1min，水洗，待干，鏡檢。2.4.5 結(jié)果：耐酸性細菌呈紅色，其他細菌、細胞等物質(zhì)呈藍色。3 生化試驗培養(yǎng)基和試劑3.1生理鹽水氯化鈉8.5g蒸餾水1000mL溶解后，分裝121C高壓滅菌 20min。3.2 磷酸鹽緩沖液3.2.1 儲存液磷酸二氫鉀34g1mol/L氫氧化鈉溶液175mL蒸餾水825mL3.2.2 制法先將磷酸鹽溶解于500mL蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液校正pH7.2后，再用蒸餾水稀釋至 1000mL。3.2.3 稀釋液：取儲存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL。分裝每瓶 100mL或每管10mL, 121C 高壓滅

6、菌15min。3.3 75% 乙醇玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第3頁95%乙 醇790mL蒸餾水210mL混勻后備用。3.4蛋白胨水（靛基質(zhì)試驗用）（可用微量發(fā)酵管）3.4.1成分蛋白胨（或胰蛋白胨）20g氯化鈉5g蒸餾水1000mLpH7.43.4.2制法按上述成分配制，分裝小試管，121C高壓滅菌15min。343靛基質(zhì)試劑（可按成品試劑上的說明操作）343.1 柯凡克試劑：將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后緩慢加入濃鹽酸25mL。343.2 歐波試劑：將1g對二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇

7、內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽酸20mL。3.4.4試驗方法挑取小量培養(yǎng)物接種，在 36 ± 1C培養(yǎng)12d ,必要時可培養(yǎng) 45d。加入柯凡克試劑 約0.5mL,輕搖試管，陽性者于試劑層呈深紅色；或加入歐波試劑約 0.5mL,沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)液表面，陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。注：蛋白胨中應(yīng)含有豐富的色氨酸。每批蛋白胨買來后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可 使用。3. 5尿素瓊脂（可用微量發(fā)酵管）3.5.1 成分蛋白胨1g氯化鈉5g葡萄糖1g磷酸二氫鉀2g0.4%酚紅溶液3mL瓊脂20g蒸餾水1000mL20%尿素溶液100mLpH7.2± 0.13.5.2制法將除尿素和瓊脂以外

8、的成分配好，并校正pH,加入瓊脂，加熱溶化并分裝燒瓶。 121C高壓滅菌15min。冷至5055C,加入經(jīng)除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2%,最終pH應(yīng)為7.2 ± 0.1。分裝于滅菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆谩?.5.3 試驗方法挑取瓊脂培養(yǎng)物接種，在36± 1C培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。尿素酶陽性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第4頁3.6 氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基（可按成品試劑上的說明操作或者用微量發(fā)酵管）361成分蛋白胨10g氯化鈉5g磷酸二氫鉀0.225g磷酸氫二鈉5

9、.64g蒸餾水1000mL0.5%氰化鉀溶液20mLpH7.63.6.2 制法將除氰化鉀以外的成分配好后分裝燒瓶，121C高壓滅菌15min。放在冰箱內(nèi)使其充分冷卻。每100mL培養(yǎng)基加入 0.5%氰化鉀溶液2.0mL（最后濃度為1 : 10000），分 裝于 12mmc 100mm滅菌試管，每管約4mL,立刻用滅菌橡皮塞塞緊，放在4C冰箱內(nèi)，至少可保存兩個月。同時，將不加氰化鉀的培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，分裝試管備用。3.6.3 試驗方法將瓊脂培養(yǎng)物接種于蛋白胨水內(nèi)成為稀釋菌液，挑取1環(huán)接種于氰化鉀 （KCN）培養(yǎng)基。并另挑取1環(huán)接種于對照培養(yǎng)基。在 36 ± 1C培養(yǎng)12d,觀察結(jié)果

10、。如有細菌生長即為陽 性（不抑制），經(jīng)2d細菌不生長為陰性 （抑制）。注：氰化鉀是劇毒藥物，使用時應(yīng)小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養(yǎng)基應(yīng)在 冰箱內(nèi)進行。試驗失敗的主要原因是封口不嚴，氰化鉀逐漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出， 以致藥物濃度降低，細菌生長，因而造成假陽性反應(yīng)。試驗時對每一環(huán)節(jié)都要特別注意。3.7 氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基（可用微量發(fā)酵管）3.7.1 成分蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g蒸餾水1000mL1.6%滇甲酚紫一乙醇溶液1mLL氨基酸或 DL氨基酸0.5或1g/100mLpH6.83.7.2 制法除氨基酸以外的成分加熱溶解后，分裝每瓶100mL,分別加入各種氨基酸：賴氨酸、

11、精氨酸和鳥氨酸。L 氨基酸按 0.5%加入，DL氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。對照培養(yǎng)基不加氨基酸。分裝于滅菌的小試管內(nèi)，每管0.5mL,上面滴加一層液體石蠟，115C高壓滅菌 10min。3.7.3 試驗方法從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于36 ± 1C培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。氨基酸脫羧酶陽性者由于產(chǎn)堿，培養(yǎng)基應(yīng)呈紫色。陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S 色。對照管應(yīng)為黃色。3.8 糖發(fā)酵管（可用微量發(fā)酵管）玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第5頁pH7.43.8.2制法3.8.1 成分

12、牛肉膏5g蛋白胨10g氯化鈉3g磷酸氫二鈉（NazHPO 12出0）2g0.2%滇麝香草酚藍溶液12mL蒸餾水1000mL3.8.2.1 葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分裝于有一個倒置小管的小試管內(nèi)，121 °C高壓滅菌15min。3.8.2.2 其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后，分裝每瓶100mL, 121C高壓滅菌15min。另將各種糖類分別配好10%溶液，同時高壓滅菌。將5mL糖溶液加入于100mL培養(yǎng)基內(nèi)，以無菌操作分裝小試管。注：蔗糖不純，加熱后會自行水解者，應(yīng)采用過濾法除菌。3.8.3試驗方法：從瓊脂斜面上挑取小量培養(yǎng)物接種，于36 ±

13、1 C培養(yǎng)，一般觀察23d。遲緩反應(yīng)需觀察1430d。3.9 ONPG培養(yǎng)基（可用微量發(fā)酵管）3.9.1 成分鄰硝基酚 3 - D-半乳糖昔（ONPG）60mg(0 Nitrophe nyl 3 D galactopyra no side)0.01mol/L 磷酸鈉緩沖液 (pH7.5)10mL1%蛋白胨水(PH7.5)30mL3.9.2 制法將ONPG溶于緩沖液內(nèi)，加入蛋白胨水，以過濾法除菌，分裝于10mrhC 75mm試管，每管0.5mL，用橡皮塞塞緊。3.9.3 試驗方法自瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物1滿環(huán)接種，于 36± 1C培養(yǎng)13h和24h觀察結(jié)果。如果3 半乳糖苷酶產(chǎn)生，則于1

14、3h變黃色，如無此酶則24h不變色。3.10 丙二酸鈉培（可用微量發(fā)酵管）3.10.1成分酵母浸膏1g硫酸銨2g磷酸氫二鉀0.6g磷酸二氫鉀0.4g氯化鈉2g丙二酸鈉3g0.2%溴麝香草酚藍溶液12mL蒸餾水1000mLpH6.8玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第6頁3.10.2 制法先將酵母浸膏和鹽類溶解于水，校正pH后再加入指示劑，分裝試管，121C高壓滅菌15min。3.10.3 試驗方法用新鮮的瓊脂培養(yǎng)物接種，于36± 1C培養(yǎng) 48h，觀察結(jié)果。陽性者由綠色變?yōu)樗{色。3.11 葡葡糖銨培養(yǎng)基(可按成品

15、試劑上的說明操作)3.11.1 成分氯化鈉5g硫酸鎂(MgSO4 7H2O)0.2g磷酸二氫銨1g磷酸氫二鉀1g葡萄糖2g瓊脂20g蒸餾水1000mL0.2%溴麝香草酚藍溶液40mLpH6.83.11.2制法先將鹽類和糖溶解于水內(nèi)，校正pH,再加瓊脂，加熱溶化，然后加入指示劑，混合均405g0.2g1g1g5g20g1000mL40mLpH,再加瓊脂，加熱溶化。然后加入指示劑，混合均勻后勻后分裝試管，121C高壓滅菌15min，放成斜面。3.11.3 試驗方法用接種針輕輕觸及培養(yǎng)物的表面，在鹽水管內(nèi)做成極稀的懸液，肉眼觀察不見混濁， 以每一接種環(huán)內(nèi)含菌數(shù)在20100之間為宜。將接種環(huán)滅菌后挑取

16、菌液接種，同時再以同法接種普通斜面一支作為對照。于36 ± 1C培養(yǎng)24h。陽性者葡萄糖銨斜面上有正常大小的 菌落生長；陰性者不生長，但在對照培養(yǎng)基上生長良好。如在葡萄糖銨斜面生長極微小的 菌落可視為陰性結(jié)果。注：容器使用前應(yīng)用清潔液浸泡。再用清水、蒸餾水沖洗干凈，并用新棉花做成棉塞, 干熱滅菌后使用。如果操作時不注意，有雜質(zhì)污染時，易造成假陽性的結(jié)果。3.12 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基(可用微量發(fā)酵管)3.12.1 成分氯化鈉硫酸鎂(MgSO4 7H2O)磷酸二氫銨 磷酸氫二鉀 檸檬酸鈉 瓊脂蒸餾水0.2%溴麝香草酚藍溶液pH6.83.12.2 制法先將鹽類溶解于水內(nèi)，校正玉環(huán)縣疾病預(yù)

17、防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第7頁分裝試管，121C高壓滅菌15min。放成斜面。3.12.3試驗方法挑取少量瓊脂培養(yǎng)物接種，于36 ± 1C培養(yǎng) 4d,每天觀察結(jié)果。陽性者斜面上有菌落生長，培養(yǎng)基從綠色轉(zhuǎn)為藍色。3.13 氧化酶試驗（可用紙片法）3.13.1 試劑3.13.1.1 1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液：少量新鮮配制，干冰箱內(nèi)避光保存。3.13.1.2 1%a -萘酚乙醇溶液。3.13.2 試驗方法3.13.2.1 取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者呈現(xiàn) 粉紅色，并逐漸加深；再加 a -

18、萘酚溶液一滴，陽性者于半分鐘內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍色。陰性于兩 分鐘內(nèi)不變色。3.13.2.2 以毛細吸管吸取試劑，直接滴加于菌落上，其顯色反應(yīng)與以上相同。3.14甲基紅（MR）試驗（可按成品試劑上的說明操作）自瓊脂斜面挑取少量培養(yǎng)物接種緩沖葡萄糖蛋白胨水中，于36± 1 C培養(yǎng) 25d，哈夫尼亞菌則應(yīng)在 2225C培養(yǎng)。滴加甲基紅試劑一滴，立即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽性，黃色 為陰性。甲基紅試劑配法：10mg甲基紅溶于 30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸餾水。3.15 V P試驗（可按成品試劑上的說明操作）用瓊脂培養(yǎng)物接種緩沖葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，于36± 1C培養(yǎng)24d。哈夫尼

19、亞菌則應(yīng)在2225C培養(yǎng)。加入 6%a 萘酚乙醇溶液 0.5mL和40%氫氧化鉀溶液 0.2mL ,充 分振搖試管， 觀察結(jié)果。陽性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色，如為陰性，應(yīng)放在36± 1C下培養(yǎng)4h再進行觀察。3.16 0.25% 氯化鈣氯化鈣2.5 g蒸餾水1000 mL3.17 緩沖葡萄糖蛋白胨水（可用微量發(fā)酵管）3.17.1 成分磷酸氫二鉀5g多胨7g葡萄糖5g蒸餾水1000mLpH7.03.17.2 制法溶化后校正 pH,分裝試管，每管1mL, 121C高壓滅菌15min。3.18 3% 過氧化氫溶液30%過氧化氫溶液臨用時稀釋10倍。3.19 20%碳酸鈉溶液碳酸鈉20g

20、滅菌蒸餾水100mL3.20 甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基（可用微量發(fā)酵管）玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第8頁牛肉膏5g甘露醇10g蛋白胨10g氯化鈉5g0.2%麝香草酚藍溶液12mL蒸餾水1000mL3.20.2制法將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，校正pH7.4后，加入甘露醇和3.20.1 成分指示劑，分裝試管，121C高壓滅菌20min。3.21 1.5%硫代硫酸鈉硫代硫酸鈉15g蒸餾水1000mL121 C高壓滅菌20min。3.22 10%硫代硫酸鈉硫代硫酸鈉100g蒸餾水1000mL121 C高壓滅菌2

21、0min。3.23 0.1% 硫代硫酸鈉肉湯硫代硫酸鈉1g肉湯1000mL121 C高壓滅菌20min。3.24 3%(W/V)吐溫80和0.3%卵磷脂肉湯吐溫8030g卵磷脂3g肉湯1000mL121C高壓滅菌20min。3.25 0.3% 甘氨酸肉湯甘氨酸3g肉湯1000mL115 C高壓滅菌15min。3.26 3%(W/V)吐溫80吐溫8030g肉湯1000mL121C高壓滅菌20min。4 一般培養(yǎng)基和專用培養(yǎng)基4.1 營養(yǎng)瓊脂（可按成品試劑上的說明操作）4.1.1成分蛋白胨10g牛肉膏3g玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2

22、版，共26頁第9頁氯化鈉5g瓊脂1520g蒸餾水1000mL4.1.2 制法將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL,校正pH至7.27.4。加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化。分裝燒瓶，121C高壓滅菌15min。注：此培養(yǎng)基可供一般細菌培養(yǎng)之用，可傾注平板或制成斜面。如用于菌落計數(shù)，瓊 脂量為1.5% ;如作成平板或斜面，則應(yīng)為 2%4.2 乳糖膽鹽發(fā)酵管（可按成品試劑上的說明操作）4.2.1 成分蛋白胨20g豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g乳糖10g0.04% 滇甲酚紫水溶液25mL蒸餾水1000mLpH7.44.2.2 制法10mL,并放入將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，

23、校正pH,加入指示劑，分裝每管個小倒管，115C高壓滅菌15min。注：雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。PH,分裝于燒瓶內(nèi)，121 C高壓滅菌 5055 C,加入伊紅和美藍溶液，搖4.3 伊紅美藍瓊脂（EMB）（可按成品試劑上的說明操作）4.3.1成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂17g2%伊紅Y溶液20mL0.65%美藍溶液10mL蒸餾水1000mLpH7.14.3.2制法將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，校正 15min備用。臨用時加入乳糖并加熱溶化瓊脂，冷至 勻，傾注平板。4.4 乳糖發(fā)酵管（可用微量發(fā)酵管）4.4.1 成分蛋白胨20g乳糖10g0.04% 溴甲

24、酚紫水溶液25mL蒸餾水1000mL玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第10頁pH7.4442制法將蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH,加入指示劑，按檢驗要求分裝 30mL、10mL或3mL，并放入一個小倒管，115C高壓滅菌15min。注：雙料乳糖發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。30mL和10mL乳糖發(fā)酵管專供醬油及醬類檢驗用， 驗用。4.5 EC肉湯（可按成品試劑上的說明操作）3mL乳糖發(fā)酵管供大腸菌群證實試4.5.1 成分胰蛋白胨20g3號膽鹽（或混合膽鹽）1.5g乳糖5g磷酸氫二鉀4g磷酸二氫鉀1.5g氯化鈉5g蒸餾水

25、1000mL4.5.2 制法將上述成分混合，溶解后，分裝有發(fā)酵倒管的試管中, 為 6.9 ± 0.2。4.6 緩沖蛋白胨水（BP）（可用微量發(fā)酵管）121C高壓滅菌15min，最終pH4.6.1 成分蛋白胨I0g氯化鈉5g磷酸氫二鈉（NazHPQ 12H2O）9g磷酸二氫鉀1.5g蒸餾水1000mLpH7.24.6.2 制法按上述成分配好后以大燒瓶裝，121C高壓滅菌 注：本培養(yǎng)基供沙門氏菌前增菌用。15min。臨用時無菌分裝每瓶225mL。4.7氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）（可按成品試劑上的說明操作）4.7.1 甲液胰蛋白胨5g氯化鈉8g磷酸二氫鉀1.6g蒸餾水1000mL4.7.2

26、 乙液氯化鎂（化學(xué)純）40g蒸餾水100mL4.7.3 丙液玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第11頁0.4%孔雀綠水溶液。4.7.4 制法分別按上述成分配好后，121C高壓滅菌15min備用。臨用時取甲液90mL、乙液9mL、丙液0.9mL，以無菌操作混合即可。注：本培養(yǎng)基亦稱Rappaport 10（R 10）增菌液。4.8亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）（可按成品試劑上的說明操作）4.8.1成分蛋白胨5g乳糖4g亞硒酸氫鈉4g磷酸氫二鈉5.5g磷酸二氫鉀4.58L-胱氨酸0.01g蒸餾水1000mL4.8.2 1%L-胱

27、氨酸氫氧化鈉溶液的配法：稱取L 胱氨酸 0.1g（或DL胱氨酸0.2g），力口 1mol/L氫氧化鈉1.5mL，使溶解，再加入蒸餾水 8.5mL即成。4.8.3 制法：將除亞硒酸氫鈉和L胱氨酸以外的各成分溶解于900mL蒸餾水中，加熱煮沸，俟冷備用。另將亞硒酸氫鈉溶解于100mL蒸餾水中，加熱煮沸，候冷，以無菌操100mL,作與上液混合。再加入1%L骯氨酸-氫氧化鈉溶液1mL。分裝于滅菌瓶中，每瓶pH 應(yīng)為 7.0 ± 0.1。4.9 SS瓊脂（可按成品試劑上的說明操作）4.9.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基5g5g3.5g17g1000mL15min，保存?zhèn)溆?。牛肉膏脙胨三號膽鹽瓊脂蒸餾水再將兩液

28、混合，121C高壓滅菌4.9.2完全培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基100mL乳糖10g檸檬酸鈉8.5g硫代硫酸鈉8.5g10%檸檬酸鐵溶液10mL1%中性紅溶液2.5mL0.1%煌綠溶液0.33mL加熱溶化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按比例加入上述染料以外之各成分，充分混合均勻，校正至48h內(nèi)使用。pH7.0，加入中性紅和煌綠溶液，傾注平板。注：制好的培養(yǎng)基宜當(dāng)日使用，或保存于冰箱內(nèi)于10d以內(nèi)使用?；途G溶液配好后應(yīng)在玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第12頁可以購用 SS瓊脂的干燥培養(yǎng)基。4.10 三糖鐵瓊脂（換用方法）（可按成品試劑上的說明操作）1

29、5g5g3g3g10g10g1g5g0.2g0.3g 12g0.025g1000mL4.10.1 成分蛋白胨脙胨牛肉膏酵母膏乳糖蔗糖葡萄糖氯化鈉硫酸亞鐵硫代硫酸鈉瓊脂酚紅 蒸餾水pH7.44.10.2 制法將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH。加入瓊脂，加熱煮沸，以溶121C高壓滅菌15min，放置高層斜面?zhèn)溆谩?.11半固體瓊脂（可按成品試劑上的說明操作）4.11.1成分蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化鈉0.5g瓊脂0.35 0.4g蒸餾水100mLpH7.44.11.2制法按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH。分裝小試管。121C高壓滅菌15min。直立H抗原位相變異試驗等用。

30、（可按成品試劑上的說明操作）化瓊脂。加入 0.2%酚紅水溶液12.5mL，搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到較高的底 層。凝固備用。注：供動力觀察、菌種保存、4.12 亞硫酸鉍瓊脂 （BS）4.12.1成分蛋白胨10g牛肉膏5g葡萄糖5g硫酸亞鐵0.3g磷酸氫二鈉4g玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第13頁煌綠0.025g檸檬酸鉍銨2g亞硫酸鈉6g瓊脂18 20g蒸餾水1000mLpH7.54.12.2制法4.12.2.1將前面5種成分溶解于 300mL蒸餾水中。4.12.2.2將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉另用50mL蒸餾水

31、溶解。4.12.2.3將瓊脂于600mL蒸餾水中煮沸溶解，冷至80C4.12.2.4將以上三液合并，補充蒸餾水至1000mL,校正 pH,.冷至 5055C,傾注平皿。加0.5%煌綠水溶液 5mL,搖勻。注：此培養(yǎng)基不需高壓滅菌。制備過程不宜過分加熱.以免降低其選擇性。應(yīng)在臨用前天制備，貯存于室溫暗處。超過48h不宜使用。4.13 GN增菌液（可按成品試劑上的說明操作）4.13.1 成分胰蛋白胨20g葡萄糖1g甘露醇2g檸檬酸鈉5g去氧膽酸鈉0.5g磷酸氫二鉀4g磷酸二氫鉀1.5g氯化鈉5g蒸餾水1000mLpH7.04.13.2 制法按上述成分配好，加熱使溶解，校正pH。分裝每瓶 225mL

32、, 115C高壓滅菌15min。4.14 麥康凱瓊脂（可按成品試劑上的說明操作）4.14.1 成分蛋白胨脙胨豬膽鹽（或牛、羊膽鹽氯化鈉瓊脂蒸餾水乳糖0.01%結(jié)晶紫水溶液0.5%中性紅水溶液17g3g)5g5g17g1000mL10g10mL5mL玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第14頁4.14.2 制法4.1421將蛋白胨、膽鹽和氯化鈉溶解于 400mL蒸餾水中，校正pH7.2。將瓊脂加入600mL蒸餾水中，加熱溶解。將兩液合并，分裝于燒瓶內(nèi)，121C高壓滅菌15min備用。4.14.2.2 臨用時加熱溶化瓊脂，趁熱加

33、入乳糖，冷至5055C時，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。注：結(jié)晶紫及中性紅水溶液配好后須經(jīng)高壓滅菌。4.15 葡萄糖半固體發(fā)酵管（可按成品試劑上的說明操作）4.15.1 成分蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化鈉0.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1mL葡萄糖1g瓊脂0.3g蒸餾水100mLpH7.44.15.2 制法將蛋白胨、牛肉膏和氯化鈉加入于水中，校正pH后加入瓊脂加熱溶解，再加入指示劑和葡萄糖，分裝小試管，滅菌121C 15 min。4.16 5%乳糖發(fā)酵管（可按成品試劑上的說明操作）4.16.1 成分蛋白胨0.2g氯化鈉0.5g乳糖5g2%溴麝香草酚藍水溶液1.2mL蒸餾水100

34、mLpH7.44.16.2 制法除乳糖以外的各成分溶解于50mL蒸餾水內(nèi)，校正 pH。將乳糖溶解于另外50mL蒸餾水內(nèi)，分別滅菌 121C 15min，將兩液混合，以無菌操作分裝于滅菌小試管內(nèi)。注：在此培養(yǎng)基內(nèi)，大部分乳糖遲緩發(fā)酵的細菌可于1d內(nèi)發(fā)酵。4.17 營養(yǎng)肉湯（可按成品試劑上的說明操作）4.17.1成分蛋白陳10g牛肉膏3g氯化鈉5g蒸餾水1000mLpH7.44.17.2制法玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第15頁按上述成分混合，溶解后校正pH,分裝燒瓶，每瓶225mL, 121C高壓滅菌15min葡萄糖5g

35、牛膽鹽20g磷酸氫二鈉8g磷酸二氫鉀2g煌綠0.015g蒸餾水1000mL4.18.2制法按上述成分配好，加熱使溶解，校正pH7.2。分裝每瓶 30mL, 115C高壓滅菌15min。4.19 氯化鈉結(jié)晶紫增菌液（可按成品試劑上的說明操作）4.19.1成分蛋白胨20g氯化鈉40g0.01%結(jié)晶紫溶液5mL蒸餾水1000mLpH 9.04.19.2制法除結(jié)晶紫外，其他按上述成分配好，加熱溶解。約加30%氫氧化鉀溶液4.5mL，校正加熱煮沸，過濾。再加入結(jié)晶紫溶液,混合后分裝試管。121 C咼壓火菌15min。4.20 氯化鈉蔗糖瓊脂（可按成品試劑上的說明操作）4.20.1成分蛋白胨10g牛肉膏1

36、0g氯化鈉50g蔗糖10g瓊脂18g0.2%溴麝香草酚藍溶液20mL蒸餾水1000mLpH7.84.20.2制法將牛肉膏、蛋白胨及氯化鈉溶解于蒸餾水中，校正pH。加入瓊脂，加熱溶解，過濾。10g備用。臨用前在 100mL培養(yǎng)基內(nèi)加入pH。4.18腸道菌增菌肉湯（可按成品試劑上的說明操作）4.18.1 成分蛋白胨1加入指示劑，分裝燒瓶100mL。121C高壓滅菌 15mi n蔗糖1g,加熱溶化并冷至50 C，傾注平板。4.21嗜鹽菌選擇性瓊脂（可按成品試劑上的說明操作）4.21.1 成分蛋白胨20g40g氯化鈉玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號

37、：第 2版，共26頁第16頁瓊脂17g0.01%結(jié)晶紫溶液5mL蒸餾水1000mLpH8.74.21.2 制法除結(jié)晶紫和瓊脂外，其他按上述成分配好，校正pH。加入瓊脂，加熱溶解。再加入結(jié)晶紫溶液，分裝燒瓶，每瓶100mL。4.223.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂（可按成品試劑上的說明操作）4.22.1 成分三糖鐵瓊脂1000mL氯化鈉30g4.22.2 制法按4.10配制三糖鐵瓊脂，再加入氯化鈉30g，分裝試管，121C高壓滅菌15min。放置高層斜面?zhèn)溆谩?.23嗜鹽性試驗培養(yǎng)基4.23.1成分蛋白胨2g氯化鈉按不同量加蒸餾水100mLpH7.74.23.2制法配制2%蛋白胨水，校正pH,共配制5瓶

38、，每瓶100mL。每瓶分別加入不同量的氯化鈉： 不加；（2）3g ; （3）7g ; （4）9g ; （5）11g。待溶解后分裝試管。121C高壓滅菌 15min。4.24 3.5%氯化鈉生化試驗培養(yǎng)基（可按成品試劑上的說明操作）4.24.1 成分及制法根據(jù)所需糖的種類按3.8配制。只是將氯化鈉含量改為3.5% , pH為7.74.25 7.5%氯化鈉肉湯（可按成品試劑上的說明操作）4.25.1 成分蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉75g蒸餾水1000mLpH7.44.25.2 制法將上述成分加熱溶解，校正pH,分裝試管，121C高壓滅菌15min。4.26 血瓊脂（可按成品試劑上的說明操作）4.

39、26.1 成分pH7.47.6豆粉瓊脂100mL脫纖維羊血（或兔血）510mL4.26.2 制法玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第17頁加熱溶化瓊脂，冷至50 C，以滅菌手續(xù)加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。亦可分裝滅菌試管，置成斜面。亦可用其他營養(yǎng)豐富的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制血瓊脂。4.27 Baird Parker氏培養(yǎng)基（可按成品試劑上的說明操作）4.27.1 成分胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰（LiCI 6H 2O）5g瓊脂20g蒸餾水950mLPH7.54.27.2 增菌劑的配法30%

40、卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞蹄酸鉀溶液 10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。4.27.3 制法將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解。冷至25C,校正pH。分裝每瓶95mL,121C高壓滅菌 15min。臨用時加熱溶化瓊脂，冷至50C,每95mL加入預(yù)熱至 50C的卵黃亞蹄酸鉀增菌劑5mL,搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲存不得超過48h。4.28 3.8%檸檬酸鈉溶液4.28.1 成分檸檬酸鈉3.8g蒸餾水100mL4.28.2 制法取檸檬酸鈉 3.8g，加蒸餾水到 100mL,溶解后過濾，裝瓶，121C高壓滅菌15min。注：兔（人）血漿制備：取3.8%檸檬酸鈉溶液一

41、份加兔（或人）全血四份，混好靜置之,則血球下降，即可得血漿進行試驗。4.29葡萄糖肉湯4.29.1成分牛肉膏5g氯化鈉5g蛋白胨10g葡萄糖10g蒸餾水1000mLpH7.2 /7 7.44.29.2制法將上述成分溶于蒸餾水中，調(diào)pH,加熱溶解，分裝試管,121C高壓滅菌 15min后備用。玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第18頁4.30 甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂（可按成品試劑上的說明操作）4.30.1 成分蛋白胨牛肉膏甘露醇氯化鈉瓊脂蒸餾水0.2%酚紅溶液50%卵黃液多粘菌素B10g1g10g10g15g1000mL13

42、mL50mLpH7.44.30.2制法100國際單位/mL將前面五種成分加入于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH，加入酚紅溶液。分裝燒瓶，每瓶100mL, 121C高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂，冷至50C，每瓶加入 50%卵黃液5mL及多粘菌素 B10000國際單位，混勻后傾注平板。4.31硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基（可按成品試劑上的說明操作）4.31.1 成分蛋白胨酵母浸膏硝酸鉀亞硝酸鈉 蒸餾水4.31.2 制法將蛋白胨與酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱溶解，校正,分裝到加有小倒管的試管中，10g3g2g0.5g1000mL入硝酸鉀和亞硝酸鈉溶解均勻4.32pH7.2。煮沸過濾后補足液量，加115

43、C高壓滅菌 20min 。4.32.1蛋白胨牛肉膏明膠蒸餾水4.32.2明膠培養(yǎng)基（可按成品試劑上的說明操作）成分5g3g120g1000mL制法將上述成分混合，置流動蒸氣滅菌器內(nèi)，加熱溶解，校正濾。分裝試管，121C滅菌 15min，備用。4.33孟加拉紅培養(yǎng)基（虎紅培養(yǎng)基）（可按成品試劑上的說明操作）4.33.1 成分pH至7.07.2，用絨布過蛋白胨5g葡萄糖10g磷酸二氫鉀1g玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第19頁硫酸鎂(MgSO 7H2O)0.5g瓊脂20g1/3000孟加拉紅溶液100mL蒸餾水1000mL

44、氯霉素0.1g4.33.2制法上述各成分加入蒸餾水中溶解后，再加孟加拉紅溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加 入培養(yǎng)基中，分裝后，121C滅菌20min。4.33.3 用途分離霉菌及酵母。4.34 煌綠肉湯增菌液4.34.1 成分肉浸液肉湯（或牛肉膏湯）1000mL磷酸氫二鉀1g2%煌綠溶液0.510mL4.34.2 制法4.34.2.1 將肉浸液肉湯加入磷酸氫二鉀（原已有磷酸氫二鉀者可不加），校正pH,分裝燒瓶，每瓶 100mL, 121 °C高壓滅菌20min。4.34.2.2 2%煌綠水溶液于臨用前配制。4.34.2.3 按比例見 GB 4789.19 94食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗蛋與

45、蛋制品檢驗于肉湯內(nèi)加入煌綠溶液，搖勻，備用。注：加入煌綠溶液時，肉湯溫度不宜過高，一般以放冷為宜?；途G的純度不應(yīng)低于93%4.35 （ T-M）培 養(yǎng)基 （按成品試劑上的說明操作）用途：淋球菌培養(yǎng)4.36 SF（按成品試劑上的說明操作）用途：沙門菌增菌4.37 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（可按成品試劑上的說明操作）4.37.1 成份蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化鈉5g溴甲酚紫乙醇溶液（16g/L ） 1ml蒸餾水1000ml4.37.2 制法將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于蒸餾水中，調(diào)整pH為7.27.4，再加入1ml溴甲酚紫乙醇溶液 （16g/L ），充分混勻，分裝于裝有倒管的試管中，115 C

46、高壓滅菌 20min ,儲存于冷暗處備用。4.38亮綠乳糖培養(yǎng)液（BGB （可按成品試劑上的說明操作）標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第20頁4.38.1 成分蛋白胨10g乳糖10g牛膽鹽2g亮綠0.0133g蒸餾水1000ml4.38.2 制法除亮綠外，將其他成分溶于蒸餾水中，調(diào)pH到7.2,加入亮綠,混勻，分裝到帶有倒管的試管中,每管10ml,115C 20min 火菌。4.39 SCDLP液體培養(yǎng)基（可按成品試劑上的說明操作）4.39.1 成分酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1g吐溫807g蒸餾水1000ml4.39.2 制法將各種成分混

47、合 （如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨可用日本多價胨代替）,加熱溶解，調(diào)pH至7.27.3,分裝,121C火菌20min,搖勻，避免吐溫80沉于底部冷至 25 C后使用。玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-0014.40十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)液（可按成品試劑上的說明操作）4.40.1 成分牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g十八烷三甲基溴銨0.3g瓊脂20g蒸餾水1000ml4.40.2 制法除瓊脂外，上述各成分混合加熱溶解,調(diào)pH至7.47.6,然后加入瓊脂,115 C滅菌20min,冷至55 C左右，傾注平皿。4.41綠膿菌素測定用培養(yǎng)基斜面（可按成品試劑上的說明操作）4.4

48、1.1 成分蛋白胨20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油（化學(xué)純）10g玉環(huán)縣疾病預(yù)防控制中心作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YJKZ/ZYW6-001標題：試劑配制版號：第 2版，共26頁第21頁蒸餾水加至1000ml4.41.2 制法將蛋白胨 氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH至7.4,加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝試管,115 C滅菌20min,制甩斜面?zhèn)溆谩?.42沙氏瓊脂培養(yǎng)基（可按成品試劑上的說明操作）4.42.1 成分蛋白胨 葡萄糖 瓊脂蒸餾水4.42.2 制法10g40g20g1000ml用700ml蒸餾水將瓊脂溶解,300ml蒸餾水將葡萄糖與蛋白胨溶解,混合上述兩部分，搖0.1g/L的氯霉素或者勻后分裝，115 C滅菌15min,即可。使用前，用過濾除菌方法加入0.03g/L 的鏈霉素。4.43堿性蛋白胨水（堿胨水）（可按成品試劑上的說明操作）4.43.1 成份蛋白胨10g氯化鈉10g蒸餾水1000mlPH 8.64.43.2 制法混勻后分裝試管,15磅20分鐘高壓蒸汽滅菌。80-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（可按成品試劑上的說明操作）20g5g15g3g1g7g1000ml4.44 4號瓊脂（按成品試劑上的說明操作）4.45卵磷脂、吐溫4.45.1 成分蛋白胨氯化鈉瓊脂牛肉膏卵