反向遺傳學(xué)及其相關(guān)技術(shù)

1、第四章第四章 反向遺傳學(xué)及其相關(guān)技術(shù)反向遺傳學(xué)及其相關(guān)技術(shù)一、概述一、概述（一）遺傳研究的二條途徑（一）遺傳研究的二條途徑1、表、表里：里：正向遺傳學(xué)研究正向遺傳學(xué)研究雜交或誘變雜交或誘變表型觀察表型觀察遺傳規(guī)律遺傳規(guī)律確定存在確定存在的基因及數(shù)目的基因及數(shù)目基因的功能及作用性質(zhì)。基因的功能及作用性質(zhì)。這一途徑是從生物體的性狀、表型變化來研究這一途徑是從生物體的性狀、表型變化來研究遺傳物質(zhì)的組成、分布與傳遞規(guī)律，屬于正向遺傳物質(zhì)的組成、分布與傳遞規(guī)律，屬于正向遺傳學(xué)采用的研究方法。遺傳學(xué)采用的研究方法。2、里里表：表：反向遺傳學(xué)研究反向遺傳學(xué)研究在已知在已知DNA序列的基礎(chǔ)上，通過序列的基礎(chǔ)上

2、，通過DNA重組、重組、定點(diǎn)突變、插入定點(diǎn)突變、插入/缺失等缺失等遺傳修飾遺傳修飾手段創(chuàng)造突手段創(chuàng)造突變體并研究突變所造成的表型效應(yīng)，從而研究變體并研究突變所造成的表型效應(yīng)，從而研究基因的生物學(xué)功能，闡明生命的本質(zhì)現(xiàn)象與規(guī)基因的生物學(xué)功能，闡明生命的本質(zhì)現(xiàn)象與規(guī)律。律。與反向遺傳學(xué)相關(guān)的遺傳操作技術(shù)為反向遺傳與反向遺傳學(xué)相關(guān)的遺傳操作技術(shù)為反向遺傳學(xué)技術(shù)。學(xué)技術(shù)。（二）（二）RNA病毒的反向遺傳學(xué)病毒的反向遺傳學(xué) n 采用病毒的遺傳材料，在培養(yǎng)細(xì)胞或易感宿主中重采用病毒的遺傳材料，在培養(yǎng)細(xì)胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或類似病毒物質(zhì)。新拯救出活病毒或類似病毒物質(zhì)。 n 能夠拯救病毒的遺傳材料稱

3、為能夠拯救病毒的遺傳材料稱為感染性克隆感染性克隆，一般是，一般是在在細(xì)菌質(zhì)粒中含有整個(gè)病毒基因組的細(xì)菌質(zhì)粒中含有整個(gè)病毒基因組的cDNA拷貝拷貝，使得使得cDNA本身或從本身或從cDNA體外轉(zhuǎn)錄所得的體外轉(zhuǎn)錄所得的RNA具具有感染性。有感染性。 n RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)通過定向修飾病毒的基因病毒的反向遺傳系統(tǒng)通過定向修飾病毒的基因組序列，檢測(cè)被拯救的人工改造病毒的表型，可以組序列，檢測(cè)被拯救的人工改造病毒的表型，可以在體內(nèi)在體內(nèi)(in vivo)有效地研究病毒基因結(jié)構(gòu)、功能有效地研究病毒基因結(jié)構(gòu)、功能和病毒和病毒-宿主相互作用。宿主相互作用。 nRNA病毒的反向遺傳操作病毒的反向遺傳操作

4、RT-PCR構(gòu)建構(gòu)建RNA病毒的全長(zhǎng)病毒的全長(zhǎng)cDNA，并進(jìn)行遺傳修飾，并進(jìn)行遺傳修飾 與與RNA聚合酶啟動(dòng)子結(jié)合聚合酶啟動(dòng)子結(jié)合 體外轉(zhuǎn)錄病毒體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA 轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄物RNA感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞 拯救到活病毒拯救到活病毒 拯救病毒的表型變化拯救病毒的表型變化 病毒基因組的表達(dá)、調(diào)控、致病機(jī)理、病毒基因組的表達(dá)、調(diào)控、致病機(jī)理、 病毒與宿主細(xì)胞互作、疫苗制造等病毒與宿主細(xì)胞互作、疫苗制造等單正股單正股RNA病毒：病毒：RNA聚合酶聚合酶+mRNA + +中間型中間型 結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白+子代正股子代正股RNA單負(fù)股單負(fù)股RNA病毒：病毒：RNA聚合酶聚合酶 +結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白子

5、代負(fù)股子代負(fù)股RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNARNA/DNA中間體中間體逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA/DNA宿主宿主子代子代RNA正股正股RNA與負(fù)股與負(fù)股RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒?（三）真核生物的反向遺傳學(xué)（三）真核生物的反向遺傳學(xué)采用反向遺傳學(xué)鑒定基因功能是真核生物功采用反向遺傳學(xué)鑒定基因功能是真核生物功能基因組學(xué)的主要內(nèi)容。能基因組學(xué)的主要內(nèi)容。研究手段包括基因的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)、超表達(dá)、反研究手段包括基因的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)、超表達(dá)、反義抑制、基因敲除義抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段?；蚣せ畹仁侄巍＠没蚯贸蚧虺聊a(chǎn)生的功能變化利用基因敲除或基

6、因沉默而產(chǎn)生的功能變化研究基因功能是主要的反向遺傳學(xué)技術(shù)。研究基因功能是主要的反向遺傳學(xué)技術(shù)。二、反向遺傳學(xué)相關(guān)技術(shù)二、反向遺傳學(xué)相關(guān)技術(shù)1、基因的同源重組、基因的同源重組2、基因的位點(diǎn)突變、基因的位點(diǎn)突變3、基因沉默、基因沉默基因敲除基因敲除利用利用DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)，將含有目的基因和靶基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，將含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過載體與同源片段的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過載體與靶細(xì)胞染色體上同源序列間的重組，將外源基靶細(xì)胞染色體上同源序列間的重組，將外源基因整合入內(nèi)源基因組內(nèi)，使外源基因得以表達(dá)。因整合入內(nèi)源基因組內(nèi)，使外源基因得以表達(dá)。通過研究靶細(xì)胞或者個(gè)體在目的基因插

7、入前后通過研究靶細(xì)胞或者個(gè)體在目的基因插入前后遺傳特性的改變，達(dá)到研究基因功能的目的。遺傳特性的改變，達(dá)到研究基因功能的目的。1、基因的同源重組、基因的同源重組 完全敲除：通過同源重組直接將靶基因在完全敲除：通過同源重組直接將靶基因在細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的活性完全消除。細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的活性完全消除。 條件敲除：將某個(gè)基因的修飾限制于特定條件敲除：將某個(gè)基因的修飾限制于特定類型的細(xì)胞或個(gè)體發(fā)育特定的階段。類型的細(xì)胞或個(gè)體發(fā)育特定的階段。完全敲除完全敲除條件敲除條件敲除特定組織特定組織/時(shí)間基因敲除時(shí)間基因敲除基因敲除基因敲除1）通過同源重組的基因敲除步驟）通過同源重組的基因敲除步驟構(gòu)建重組載體

8、構(gòu)建重組載體 重組重組DNA轉(zhuǎn)入受體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞核內(nèi) 篩選目的細(xì)胞篩選目的細(xì)胞 轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)基因生物重組載體的類型：重組載體的類型：a)替換性載體系統(tǒng)：替換性載體系統(tǒng)：包括同源序列片段、替包括同源序列片段、替換基因的啟動(dòng)子、報(bào)道換基因的啟動(dòng)子、報(bào)道基因等成分。基因等成分。b)插入性載體系統(tǒng)：插入性載體系統(tǒng)：插入基因片段插入基因片段(目的基目的基因因)、同源序列片段、同源序列片段、標(biāo)志基因片段。標(biāo)志基因片段。用替換型（用替換型（a）或插入型（）或插入型（b）載體進(jìn)行完全基因敲）載體進(jìn)行完全基因敲除實(shí)驗(yàn)除實(shí)驗(yàn)2）Res同源重組系同源重組系統(tǒng)統(tǒng)源于源于噬菌體噬菌體Res重組酶的重組系重組酶的

9、重組系統(tǒng)統(tǒng)Ha 和和Hb: 同源重組區(qū)域同源重組區(qū)域 Pa 和和Pb: 引物位點(diǎn)引物位點(diǎn)sm: 篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記Red 同源重組技術(shù)用于基因打靶同源重組技術(shù)用于基因打靶3）Cre-LoxP同源重組系統(tǒng)同源重組系統(tǒng) 源自源自P1噬菌體的重組系統(tǒng)噬菌體的重組系統(tǒng) 屬于傳統(tǒng)的同源重組載體，但具有時(shí)空調(diào)控的功能。屬于傳統(tǒng)的同源重組載體，但具有時(shí)空調(diào)控的功能。該系統(tǒng)由該系統(tǒng)由P1噬菌體的噬菌體的Cre重組酶和重組酶和LoxP位點(diǎn)兩部位點(diǎn)兩部分組成。分組成。nCre重組酶：重組酶：由Cre基因編碼，識(shí)別LoxP位點(diǎn)，介導(dǎo)介導(dǎo)兩個(gè)兩個(gè)LoxPLoxP位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使位點(diǎn)（序列）之間的特異性重

10、組，使LoxPLoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。n LoxP位點(diǎn)：位點(diǎn)：由2個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和1個(gè)8bp的間隔區(qū)域構(gòu)成。Cre酶 Cre酶 Cre酶 CreCre重組酶重組酶13bp的反向重復(fù)序列的反向重復(fù)序列 Cre-LoxP 重組系統(tǒng)的特點(diǎn)重組系統(tǒng)的特點(diǎn) Cre 重組酶所催化的是一個(gè)可逆的重組事件重組酶所催化的是一個(gè)可逆的重組事件 Cre催化重組不需要任何輔助因子的參與催化重組不需要任何輔助因子的參與l 介導(dǎo)兩個(gè)同向介導(dǎo)兩個(gè)同向LoxP位點(diǎn)之間序列的插入位點(diǎn)之間序列的插入/缺失（下左）缺失（下左） 介導(dǎo)兩個(gè)反向介導(dǎo)兩個(gè)反向LoxP位點(diǎn)之間序列顛倒（

11、下右）位點(diǎn)之間序列顛倒（下右） 介導(dǎo)兩條含介導(dǎo)兩條含LoxP位點(diǎn)位點(diǎn)DNA鏈的交換或染色體易位。鏈的交換或染色體易位。 Cre-Loxp gene knock-out system模式動(dòng)物小模式動(dòng)物小鼠中完全基鼠中完全基因敲除的步因敲除的步聚聚近交系，白近交系，白色，易產(chǎn)生色，易產(chǎn)生免疫缺陷免疫缺陷 2、基因的位點(diǎn)突變、基因的位點(diǎn)突變1）點(diǎn)突變）點(diǎn)突變TILLING技術(shù)技術(shù)TILLING (targeting induced local lesions in genomes) 定向誘導(dǎo)基因組局部突變定向誘導(dǎo)基因組局部突變，是一種快速有效地從由化學(xué)誘變，是一種快速有效地從由化學(xué)誘變劑劑(EMS)

12、誘變過的突變?nèi)后w中鑒定出點(diǎn)突變的方法。誘變過的突變?nèi)后w中鑒定出點(diǎn)突變的方法。 先用化學(xué)誘變劑先用化學(xué)誘變劑(甲基磺酸乙酯，甲基磺酸乙酯，EMS)誘發(fā)產(chǎn)生誘發(fā)產(chǎn)生一系列的一系列的點(diǎn)突變點(diǎn)突變，再用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行，再用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性和退火形成擴(kuò)增產(chǎn)物變性和退火形成異源雙鏈核酸分子，再用特異切割錯(cuò)配的內(nèi)切酶異源雙鏈核酸分子，再用特異切割錯(cuò)配的內(nèi)切酶CELl酶切，最后變性處理后采用雙色聚丙烯酰胺酶切，最后變性處理后采用雙色聚丙烯酰胺凝膠凝膠(PAGE)電泳檢測(cè)分析。電泳檢測(cè)分析。（建池）（建池）TILLING特點(diǎn)：特點(diǎn)： TILLING技術(shù)屬

13、于高頻率點(diǎn)突變和技術(shù)屬于高頻率點(diǎn)突變和PCR篩選相結(jié)篩選相結(jié)合的技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)基因的錯(cuò)義突變、基因截短型合的技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)基因的錯(cuò)義突變、基因截短型損傷等突變類型。損傷等突變類型。u可獲得大量的等位基因系列，對(duì)長(zhǎng)度很小基因，可獲得大量的等位基因系列，對(duì)長(zhǎng)度很小基因，復(fù)等位基因等具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。復(fù)等位基因等具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。u可誘導(dǎo)產(chǎn)生高頻率的點(diǎn)突變，篩選目的基因需要可誘導(dǎo)產(chǎn)生高頻率的點(diǎn)突變，篩選目的基因需要較小的突變?nèi)后w。較小的突變?nèi)后w。u不依賴于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標(biāo)簽系統(tǒng)，無需不依賴于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標(biāo)簽系統(tǒng)，無需耗時(shí)的轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)。耗時(shí)的轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)。u需要知道

14、所研究基因的序列。需要知道所研究基因的序列。2）隨機(jī)插入突變）隨機(jī)插入突變T-DNA插入突變插入突變 以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的一種插入突變研究以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的一種插入突變研究方法，根據(jù)插入位點(diǎn)的基因序列與植物表型變異方法，根據(jù)插入位點(diǎn)的基因序列與植物表型變異等的相互關(guān)系可以從基因組中分離出相應(yīng)的基因等的相互關(guān)系可以從基因組中分離出相應(yīng)的基因并鑒定其功能。并鑒定其功能。構(gòu)建構(gòu)建T-DNA載體載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化突變體的篩選及遺傳分突變體的篩選及遺傳分析析分離分離T-DNA 插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列基因的基因的定位、結(jié)構(gòu)與功能分析。定位、結(jié)構(gòu)與功能分析。T-DNA法敲除植物基因法敲

15、除植物基因及突變體篩選：及突變體篩選： a.引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)。LP和和RP分別代表插入基因兩端的引分別代表插入基因兩端的引物，物，LB是指載體上的一段是指載體上的一段 引物。旁鄰序列是經(jīng)測(cè)序后引物。旁鄰序列是經(jīng)測(cè)序后獲得的獲得的DNA序列。序列。 b. PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和分別代表野生型、雜合子和純合子純合子PCR條帶。條帶。T-DNA插入特點(diǎn)：插入特點(diǎn)：n 不能控制其在生物體基因組中的插入位點(diǎn)。在植物不能控制其在生物體基因組中的插入位點(diǎn)。在植物中用中用T-DNA 插入來敲除一個(gè)特定基因仍需要運(yùn)氣。插入來敲除一個(gè)特定基因仍需要運(yùn)氣。n 隱性突變與顯性突變

16、：隱性隱性突變與顯性突變：隱性表型的變化只能在表型的變化只能在轉(zhuǎn)化體的部分后代中體現(xiàn)出來（基因敲除）；顯轉(zhuǎn)化體的部分后代中體現(xiàn)出來（基因敲除）；顯性性可以在轉(zhuǎn)化體中直接觀察到（基因激活）?？梢栽谵D(zhuǎn)化體中直接觀察到（基因激活）。n 某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不體現(xiàn)某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不體現(xiàn)出功能的喪失。原因：重要的功能基因突變致死和出功能的喪失。原因：重要的功能基因突變致死和冗余基因。冗余基因。n 染色體重排：突變體表型與染色體重排：突變體表型與T-DNA 插入無關(guān)。插入無關(guān)。n 效率不高，工作量大。建立飽和的突變體庫。效率不高，工作量大。建立飽和的突變體庫。 轉(zhuǎn)座

17、子插入突變轉(zhuǎn)座子插入突變利用某些能隨機(jī)插入基因序列的轉(zhuǎn)座子，在目標(biāo)細(xì)胞利用某些能隨機(jī)插入基因序列的轉(zhuǎn)座子，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。由轉(zhuǎn)座子引起的突變可以轉(zhuǎn)座子由轉(zhuǎn)座子引起的突變可以轉(zhuǎn)座子DNA為探針，從突變?yōu)樘结?，從突變體的基因組體的基因組DNA文庫中篩選到突變的基因，再利用這文庫中篩選到突變的基因，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因。部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因。

18、也可以利用也可以利用PCR的方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列，進(jìn)而的方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列，進(jìn)而得到完整的基因信息。得到完整的基因信息。轉(zhuǎn)座子插入特點(diǎn)：轉(zhuǎn)座子插入特點(diǎn)： 插入的是完整的元件，便于分析。插入的是完整的元件，便于分析。 可從插入位點(diǎn)切除，產(chǎn)生回復(fù)突變，因此不僅可以可從插入位點(diǎn)切除，產(chǎn)生回復(fù)突變，因此不僅可以據(jù)此確認(rèn)真正由轉(zhuǎn)座子引起的突變，還可以進(jìn)一步據(jù)此確認(rèn)真正由轉(zhuǎn)座子引起的突變，還可以進(jìn)一步驗(yàn)證突變基因的功能。驗(yàn)證突變基因的功能。 轉(zhuǎn)座子傾向于插入轉(zhuǎn)座子的臨近區(qū)域，可以用來研轉(zhuǎn)座子傾向于插入轉(zhuǎn)座子的臨近區(qū)域，可以用來研究基因組某一局部區(qū)域的結(jié)構(gòu)。究基因組某一局部區(qū)域的結(jié)構(gòu)。 通過不斷跳

19、動(dòng)產(chǎn)生新的突變，相對(duì)較少的起始轉(zhuǎn)化通過不斷跳動(dòng)產(chǎn)生新的突變，相對(duì)較少的起始轉(zhuǎn)化系就可以獲得整個(gè)基因組的飽和突變，大大減少了系就可以獲得整個(gè)基因組的飽和突變，大大減少了工作量。工作量。可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化效率不高的植物?？梢詰?yīng)用于轉(zhuǎn)化效率不高的植物。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng) Ac/ Ds 系統(tǒng)系統(tǒng) 由自主性元件（由自主性元件（Ac）和非自主性元件（）和非自主性元件（Ds）構(gòu)成。構(gòu)成。Ds元件能夠在元件能夠在Ac編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下移動(dòng)，去除移動(dòng)，去除Ac元件可使其自身不能轉(zhuǎn)座。元件可使其自身不能轉(zhuǎn)座。I. 通過遺傳雜交引入自主性元件，轉(zhuǎn)座子插入序通過遺傳雜交引入自主性元件，轉(zhuǎn)座子插入序

20、列可以重新移動(dòng)。因此，列可以重新移動(dòng)。因此，Ac/Ds 轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)只需要少量的轉(zhuǎn)基因品系（啟動(dòng)品系）作為轉(zhuǎn)座只需要少量的轉(zhuǎn)基因品系（啟動(dòng)品系）作為轉(zhuǎn)座源即可。源即可。在真核系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)座插入事件常不能產(chǎn)生可在真核系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)座插入事件常不能產(chǎn)生可見的表型，這是因?yàn)楣δ芑虻娜哂嗷蛟谠缫姷谋硇?，這是因?yàn)楣δ芑虻娜哂嗷蛟谠缙诋a(chǎn)生致死效應(yīng)。采用經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)座子可克期產(chǎn)生致死效應(yīng)。采用經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)座子可克服這些困難。服這些困難。修飾：轉(zhuǎn)座因子后帶一個(gè)報(bào)告基因，報(bào)告基修飾：轉(zhuǎn)座因子后帶一個(gè)報(bào)告基因，報(bào)告基因的表達(dá)只有在轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的情況下才能因的表達(dá)只有在轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的情況下才能獲得，這樣就

21、可以通過報(bào)告基因來檢測(cè)轉(zhuǎn)座獲得，這樣就可以通過報(bào)告基因來檢測(cè)轉(zhuǎn)座子的表達(dá)情況。子的表達(dá)情況。修飾的修飾的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)n增強(qiáng)子陷阱增強(qiáng)子陷阱( enhancer trap )：轉(zhuǎn)座子含：轉(zhuǎn)座子含有一個(gè)具弱小啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因。報(bào)告有一個(gè)具弱小啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因。報(bào)告基因的表達(dá)只有在轉(zhuǎn)座發(fā)生在內(nèi)源增強(qiáng)子附基因的表達(dá)只有在轉(zhuǎn)座發(fā)生在內(nèi)源增強(qiáng)子附近時(shí)才能獲得。近時(shí)才能獲得。n啟動(dòng)子陷阱啟動(dòng)子陷阱(promoter trap)：轉(zhuǎn)座子帶有：轉(zhuǎn)座子帶有一個(gè)無啟動(dòng)子的報(bào)告基因，這個(gè)基因只有在一個(gè)無啟動(dòng)子的報(bào)告基因，這個(gè)基因只有在轉(zhuǎn)座子插入一個(gè)植物活躍的內(nèi)源啟動(dòng)子下游轉(zhuǎn)座子插入一個(gè)植物活

22、躍的內(nèi)源啟動(dòng)子下游時(shí)才能表達(dá)。時(shí)才能表達(dá)。修飾的方法修飾的方法-增強(qiáng)子陷阱與啟動(dòng)子陷阱增強(qiáng)子陷阱與啟動(dòng)子陷阱 Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)n 轉(zhuǎn)座子打靶載體是以兩種噬菌體轉(zhuǎn)座子打靶載體是以兩種噬菌體Mu為基礎(chǔ)的為基礎(chǔ)的mini-Mu轉(zhuǎn)座子，每個(gè)轉(zhuǎn)座子上都攜帶標(biāo)記基因。轉(zhuǎn)座子，每個(gè)轉(zhuǎn)座子上都攜帶標(biāo)記基因。n 可以在擬刪除基因兩側(cè)各插入一個(gè)可以在擬刪除基因兩側(cè)各插入一個(gè)mini-Mu轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子，然后在兩個(gè)插入位點(diǎn)之間制造缺失。子，然后在兩個(gè)插入位點(diǎn)之間制造缺失。n 這種缺失可以使兩個(gè)轉(zhuǎn)座子加上靶區(qū)之間的部分這種缺失可以使兩個(gè)轉(zhuǎn)座子加上靶區(qū)之間的部分基因轉(zhuǎn)移?；蜣D(zhuǎn)移。n 特點(diǎn)：特點(diǎn)：u 不需要知道基因

23、組序列，僅已知外顯子即可不需要知道基因組序列，僅已知外顯子即可u 載體構(gòu)建迅速，技術(shù)簡(jiǎn)單載體構(gòu)建迅速，技術(shù)簡(jiǎn)單u 載體可以攜帶多種不同抗性基因，可以同時(shí)處理載體可以攜帶多種不同抗性基因，可以同時(shí)處理多基因。多基因。三、基因沉默技術(shù)三、基因沉默技術(shù)q 反義反義RNAq RNA干擾干擾（RNAi） 反義反義RNA技術(shù)技術(shù)反義反義RNA技術(shù)是根據(jù)技術(shù)是根據(jù)RNA序列人工合成的互補(bǔ)序列人工合成的互補(bǔ)RNA。根據(jù)反義。根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為三類：的作用機(jī)制可將其分為三類：1、反義、反義RNA是直接作用于靶是直接作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)的核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)或與靶或與靶mRNA直接結(jié)合形

24、成雙鏈直接結(jié)合形成雙鏈RNA，從而直接抑制，從而直接抑制mRNA的翻譯或被的翻譯或被RNA酶酶識(shí)別降解。識(shí)別降解。2、反義、反義RNA是與是與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)構(gòu)象的變化，從而抑制其翻譯。象的變化，從而抑制其翻譯。3、反義、反義RNA是作用于基因的啟動(dòng)子，直接抑制靶是作用于基因的啟動(dòng)子，直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。的轉(zhuǎn)錄。RNA干擾干擾(RNA interference，RNAi)與靶基因序列同源的雙鏈與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的所誘導(dǎo)的一種序列特異性轉(zhuǎn)錄后一種序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默基因沉默現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 RNA干擾干擾基因沉默基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基

25、因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)基因沉默基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（TGSTGS）是指基因在細(xì)胞核內(nèi)是指基因在細(xì)胞核內(nèi)RNARNA合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。轉(zhuǎn)錄水平基因沉默可以轉(zhuǎn)錄水平基因沉默可以通過有性世代傳遞，表現(xiàn)為減數(shù)分裂的可遺傳性。通過有性世代傳遞，表現(xiàn)為減數(shù)分裂的可遺傳性。 引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的機(jī)制主要有以下幾種：引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的機(jī)

26、制主要有以下幾種： 基因及其啟動(dòng)子甲基化基因及其啟動(dòng)子甲基化：通常發(fā)生在通常發(fā)生在DNADNA的的CGCG序列的堿基上，序列的堿基上，該區(qū)域堿基甲基化往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受抑制該區(qū)域堿基甲基化往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受抑制。 同源基因間的反式失活同源基因間的反式失活：擁有同源序列的沉默位點(diǎn)和其他擁有同源序列的沉默位點(diǎn)和其他位點(diǎn)的位點(diǎn)的DNADNA的相互作用而引起的基因沉默的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的甲基化并失活的基因能作為一種基因能作為一種“沉默子沉默子”，對(duì)其他具有同源性的靶基因施，對(duì)其他具有同源性的靶基因施加一種反式作用，使具有同源序列的靶基因發(fā)生甲基化并加一種反式作用，使具有同源序列的靶基因發(fā)

27、生甲基化并導(dǎo)致失活。反式失活的靶基因既可以與沉默基因是等位基導(dǎo)致失活。反式失活的靶基因既可以與沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。因，也可以是非等位基因。 后成修飾作用導(dǎo)致的基因沉默后成修飾作用導(dǎo)致的基因沉默：指轉(zhuǎn)基因的序列和堿基組指轉(zhuǎn)基因的序列和堿基組成不發(fā)生改變，但是其功能卻在個(gè)體發(fā)育的某一階段受到成不發(fā)生改變，但是其功能卻在個(gè)體發(fā)育的某一階段受到細(xì)胞內(nèi)因子的修飾作用后而關(guān)閉。細(xì)胞內(nèi)因子的修飾作用后而關(guān)閉。這種修飾作用所造成的這種修飾作用所造成的轉(zhuǎn)基因沉默是可以隨著修飾作用的解除而被消除。轉(zhuǎn)基因沉默是可以隨著修飾作用的解除而被消除。后成修后成修飾作用導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默與受體植物的核型構(gòu)成

28、有關(guān)。飾作用導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默與受體植物的核型構(gòu)成有關(guān)。 重復(fù)序列重復(fù)序列：外源基因如果以多拷貝形式整合到同一位點(diǎn)上，外源基因如果以多拷貝形式整合到同一位點(diǎn)上，形成首尾相連的正向重復(fù)或頭對(duì)頭、尾對(duì)尾的反向重復(fù)，形成首尾相連的正向重復(fù)或頭對(duì)頭、尾對(duì)尾的反向重復(fù)，則不能表達(dá)，而且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象越嚴(yán)重。這則不能表達(dá)，而且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象越嚴(yán)重。這種重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默可能是重復(fù)序列間自發(fā)配對(duì)，種重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默可能是重復(fù)序列間自發(fā)配對(duì)，甲基化酶特異性識(shí)別這種配對(duì)結(jié)構(gòu)而使其甲基化，從而抑甲基化酶特異性識(shí)別這種配對(duì)結(jié)構(gòu)而使其甲基化，從而抑制其表達(dá)。制其表達(dá)。 轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默轉(zhuǎn)

29、錄后水平基因沉默（PTGSPTGS）則是指基因能夠在細(xì)胞則是指基因能夠在細(xì)胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mRNAmRNA存存在的現(xiàn)象。在的現(xiàn)象。 引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制主要有以下幾種：引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制主要有以下幾種： 共抑制共抑制：由由NapoliNapoli在轉(zhuǎn)在轉(zhuǎn)CHSCHS基因的矮牽牛花中發(fā)現(xiàn)，普基因的矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)，普遍存在于轉(zhuǎn)基因植物中。其發(fā)生是由于外源基因編碼遍存在于轉(zhuǎn)基因植物中。其發(fā)生是由于外源基因編碼區(qū)與受體細(xì)胞基因間存在同源性而導(dǎo)致外源基因與內(nèi)區(qū)與受體細(xì)胞基因間存在同源性而導(dǎo)致外源基因與內(nèi)源基因的表達(dá)同時(shí)受

30、到抑制。源基因的表達(dá)同時(shí)受到抑制。 具有同源性的外基因和內(nèi)源基因在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄具有同源性的外基因和內(nèi)源基因在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄速率很高，但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無速率很高，但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無mRNAmRNA積累，是典型的轉(zhuǎn)錄積累，是典型的轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。共抑制的產(chǎn)生不僅同內(nèi)、外源基因后水平基因沉默。共抑制的產(chǎn)生不僅同內(nèi)、外源基因間編碼區(qū)的同源性有關(guān)，還與控制外源基因的啟動(dòng)子間編碼區(qū)的同源性有關(guān)，還與控制外源基因的啟動(dòng)子的強(qiáng)度等因素有關(guān)。的強(qiáng)度等因素有關(guān)。 基因壓制基因壓制：CogoniCogoni等首先在粗糙脈孢霉的轉(zhuǎn)化等首先在粗糙脈孢霉的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，外源基因可以抑制自身和相應(yīng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，外源基因可以

31、抑制自身和相應(yīng)內(nèi)源基因的表達(dá)，他們把這一現(xiàn)象定為基因壓制。源基因的表達(dá)，他們把這一現(xiàn)象定為基因壓制?；驂褐剖强赡娴模疫@種逆轉(zhuǎn)會(huì)伴隨有外基因壓制是可逆的，而且這種逆轉(zhuǎn)會(huì)伴隨有外源拷貝的丟失。基因壓制發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，源拷貝的丟失?；驂褐瓢l(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，導(dǎo)致已復(fù)制的穩(wěn)定態(tài)導(dǎo)致已復(fù)制的穩(wěn)定態(tài)mRNAmRNA大量減少。大量減少。 RNARNA干擾干擾：指將與靶基因的指將與靶基因的mRNAmRNA同源互補(bǔ)的雙鏈同源互補(bǔ)的雙鏈RNA (dsRNA) RNA (dsRNA) 導(dǎo)入細(xì)胞后并被切割成導(dǎo)入細(xì)胞后并被切割成21212323個(gè)個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短核苷酸雙鏈，在其它作用因子核苷酸長(zhǎng)度的短核苷酸雙鏈

32、，在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的的參與下能夠特異地與其同源的mRNAmRNA結(jié)合并導(dǎo)結(jié)合并導(dǎo)致其降解，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。致其降解，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。 RNAi是植物、果蠅、線蟲和包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的是植物、果蠅、線蟲和包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的許多生物抵抗病毒感染和限制轉(zhuǎn)座子運(yùn)動(dòng)的一種許多生物抵抗病毒感染和限制轉(zhuǎn)座子運(yùn)動(dòng)的一種自然存在的防御機(jī)制。自然存在的防御機(jī)制。RNAi可以作為一種簡(jiǎn)單、有效的代替基因敲除的可以作為一種簡(jiǎn)單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，來制備特定基因缺失表型的個(gè)體，從遺傳工具，來制備特定基因缺失表型的個(gè)體，從而研究該基因的功能而研究該基因的功能. 這

33、項(xiàng)技術(shù)在疾病的基因治療上也有光明的應(yīng)用前這項(xiàng)技術(shù)在疾病的基因治療上也有光明的應(yīng)用前景。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達(dá)，或景。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達(dá)，或者由蛋白過量表達(dá)引起的疾病。者由蛋白過量表達(dá)引起的疾病。( (二二) )、RNARNA干擾的發(fā)現(xiàn)干擾的發(fā)現(xiàn) 19941994年年 CogoniCogoni等證明真菌中亦等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象，此稱為有類似現(xiàn)象，此稱為基因壓制基因壓制(quelling)(quelling)。共抑制現(xiàn)象共抑制現(xiàn)象(cosuppression)(cosuppression)上世紀(jì)上世紀(jì)9090年代初，美國(guó)和荷蘭的年代初，美國(guó)和荷蘭的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)

34、組在對(duì)矮牽?jī)蓚€(gè)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組在對(duì)矮牽牛牛( (petuniaspetunias) )的研究中發(fā)現(xiàn)的研究中發(fā)現(xiàn): :轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達(dá)，反而使原有的色素基因也受達(dá)，反而使原有的色素基因也受到了抑制。到了抑制。19951995年，康乃爾大學(xué)的年，康乃爾大學(xué)的Su GuoSu Guo博士在博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)(C.elegans)的的par-1par-1基因?qū)嶒?yàn)中發(fā)現(xiàn)：基因?qū)嶒?yàn)中發(fā)現(xiàn)：反義反義RNARNA與正義與正義RNARNA（對(duì)照）都能切斷（對(duì)照）都能切斷par-1par-1基因的表達(dá)。該研究小組一直未

35、基因的表達(dá)。該研究小組一直未能給這個(gè)意外以合理解釋。能給這個(gè)意外以合理解釋。 Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620.秀麗新小桿線蟲轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)秀麗新小桿線蟲轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)反義反義RNA與正義與正義RNA？反義RNA -與靶核酸與靶核酸(如如mRNA或有義或有義DNA)鏈互補(bǔ)的鏈互補(bǔ)的RNA分子，可抑制靶核酸的功能。分子，可抑制靶核酸的功能。 正義正義RNA-與與mRNA對(duì)應(yīng)的對(duì)應(yīng)的RNA分子。分子。RNARNA干擾的發(fā)現(xiàn)干擾的發(fā)現(xiàn) 19981998年，年，F(xiàn)ireFire和和MelloMello（美）首次在秀麗新小桿線蟲中證明上（美）首次在

36、秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默基因沉默。他們發(fā)現(xiàn)。他們發(fā)現(xiàn)Su GuoSu Guo博士遇博士遇到的正義到的正義RNARNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的反義抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的反義RNARNA技術(shù)技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得對(duì)基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNARNA中污染了中污染了微量微量雙鏈雙鏈RNARNA而引起：而引起：將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNARNA純化后注射線蟲，基因抑制效應(yīng)變純化后注射線蟲，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNARNA卻正好相反，能夠高

37、效特卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，其抑制基因表達(dá)的效率比純化后異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，其抑制基因表達(dá)的效率比純化后的反義的反義RNARNA至少高至少高2 2個(gè)數(shù)量級(jí)。該小組將這一現(xiàn)象稱為個(gè)數(shù)量級(jí)。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNARNA干干擾擾。 Fire A, Xu S, Montgomery ME, et al. Nature. 1998,391:806-811.Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. （對(duì)照，缺（對(duì)照，缺mex-3 ，不著色），不著色）

38、(B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). （正常野生型，紫）（正常野生型，紫）(C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. （野生型

39、野生型+反義反義RNA，淺紫），淺紫）(D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) （野生型（野生型+雙鏈雙鏈RNA，不著色），不著色）Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endo

40、genous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization （原位雜交）（原位雜交）of 4-cell stage embryos. “沉默沉默”是是金金Fire與與Mello獲獲2006年諾年諾貝爾獎(jiǎng)貝爾獎(jiǎng)在在19991999年一年內(nèi)年一年內(nèi), ,發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)RNARNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌、干擾現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物細(xì)胞中。乎所有的真核生物細(xì)胞中。20002000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚年，又先

41、后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在胎中和大腸桿菌中也存在RNARNA干擾現(xiàn)象。干擾現(xiàn)象。20002000年提出年提出RNAiRNAi作用機(jī)制模型。作用機(jī)制模型。Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-3320012001年，年，RNAiRNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。象。NatureNature，20012001，411411（68366836）：）：494494498498RNAiRNAi技術(shù)被技術(shù)被Scie

42、nceScience評(píng)為評(píng)為20012001年度的十大科技進(jìn)展之一。年度的十大科技進(jìn)展之一。（三）、（三）、RNARNA干擾的機(jī)制干擾的機(jī)制 dsRNA：雙鏈：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈。，包含正義鏈和反義鏈。Dicer：屬于：屬于RNase 家族家族的一員的一員，是，是dsRNA的的特異性核酸內(nèi)切酶，特異性核酸內(nèi)切酶，能以一種能以一種ATP依賴的方式逐步依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈?zhǔn)揭氲碾p鏈RNA。siRNA (small interfering RNA) ：小干擾：小干擾RNA，是長(zhǎng)度為是長(zhǎng)度為21

43、-23個(gè)個(gè)nt大小的雙鏈大小的雙鏈RNA，為，為RNAi的關(guān)的關(guān)鍵效應(yīng)分子。鍵效應(yīng)分子。名詞解釋：名詞解釋：siRNAslong dsRNAsiRNARISC(RNA-inducing silencing complex)： RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，是一種核蛋白復(fù)合物，具有核酸誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，是一種核蛋白復(fù)合物，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性。內(nèi)切、外切以及解旋酶活性。RdRP（RNA-dependent RNA polymerases）：）： 依賴依賴RNA的的RNA聚合酶，是聚合酶，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞。可以在生物體內(nèi)傳遞。RISC: RNA-I

44、nduced Silencing ComplexExonucleaseHomology search activityEndonucleaseHelicase53Target mRNAOH35P核酸外切酶核酸外切酶 解旋酶解旋酶 核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶 dsRNA介導(dǎo)的同源性靶介導(dǎo)的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步：降解過程主要分為兩步：第一步（起始階段）第一步（起始階段）較長(zhǎng)較長(zhǎng)dsRNA在在ATP參與下，被參與下，被RNase的特異核酸酶切割加工成的特異核酸酶切割加工成2123nt的，由正的，由正義和反義鏈組成的義和反義鏈組成的小干擾小干擾RNA（small interfering RN

45、A，siRNA）。）。 siRNA的兩條單鏈末端為的兩條單鏈末端為5-磷酸和磷酸和3-羥基，且羥基，且3端均有端均有2個(gè)突出的核苷酸。個(gè)突出的核苷酸。 Dicer有解旋酶活性并含有有解旋酶活性并含有 dsDNA結(jié)合域和結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域。Dicer的類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動(dòng)物等機(jī)體中的類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動(dòng)物等機(jī)體中被發(fā)現(xiàn)。被發(fā)現(xiàn)。步驟步驟第二步（效應(yīng)階段）第二步（效應(yīng)階段）siRNA 在在ATP參與下被參與下被RNA解解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced

46、 silencing complex，RISC)?；罨幕罨腞ISC在單鏈在單鏈siRNA引導(dǎo)下識(shí)別互補(bǔ)的引導(dǎo)下識(shí)別互補(bǔ)的mRNA，并在并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo)鏈中引導(dǎo)鏈中心所對(duì)應(yīng)的靶基因位置切割靶心所對(duì)應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再，最后可能再被核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而干擾基因表達(dá)。被核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而干擾基因表達(dá)。RNAiRNAi的放大效應(yīng)機(jī)制的放大效應(yīng)機(jī)制siRNA不僅可引導(dǎo)不僅可引導(dǎo)RISC切割靶切割靶RNA，而且可作為引，而且可作為引物在物在RNA依賴的依賴的RNA聚合酶聚合酶(RdRP)作用下以靶作用下以靶mRNA

47、為模板合成新的為模板合成新的dsRNA。新合成的長(zhǎng)鏈新合成的長(zhǎng)鏈dsRNA同樣可被同樣可被RNase核酸酶切割、核酸酶切割、降解而生成大量的降解而生成大量的次級(jí)次級(jí)siRNA。次級(jí)。次級(jí)siRNA又可進(jìn)又可進(jìn)入合成入合成-切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大RNAi作用。作用。這種合成這種合成-切割的循環(huán)過程稱為切割的循環(huán)過程稱為隨機(jī)降解性隨機(jī)降解性PCR（random degradative PCR）。）。Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.異常的單鏈RNA依賴RNA的RNA聚合酶特異性核酸內(nèi)切酶RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合

48、物RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制；是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制；RNAiRNAi具有很高的特異性：具有很高的特異性： 只有只有dsRNA才能誘導(dǎo)產(chǎn)生才能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi； 只有針對(duì)編碼區(qū)的只有針對(duì)編碼區(qū)的dsRNA才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾；才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾； 注射同源注射同源dsRNA可以引起內(nèi)源性可以引起內(nèi)源性mRNA特異性的降解；特異性的降解； dsRNAdsRNA不得短于不得短于2121個(gè)堿基，大于個(gè)堿基，大于30bp30bp的的dsRNAdsRNA不能在哺乳動(dòng)不能在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)特異的物中誘導(dǎo)特異的RNARNA干擾，而是細(xì)胞非特異性和全面的基因干擾，而是細(xì)胞非特異性和

49、全面的基因表達(dá)受抑制凋亡；表達(dá)受抑制凋亡； RNAi具有具有高效性高效性： RNAi抑制基因表達(dá)具有很高的效率，可達(dá)到缺失突變體表抑制基因表達(dá)具有很高的效率，可達(dá)到缺失突變體表型的程度，而且相對(duì)很少量的型的程度，而且相對(duì)很少量的dsRNA分子就能完全抑制相分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，這是通過催化放大的方式進(jìn)行的；應(yīng)基因的表達(dá)，這是通過催化放大的方式進(jìn)行的；RNAi干擾的幾個(gè)重要生物學(xué)特征干擾的幾個(gè)重要生物學(xué)特征 RNAi具有很好的具有很好的穩(wěn)定性穩(wěn)定性：siRNA分子分子33端有突出的非配端有突出的非配對(duì)堿基的雙鏈分子，在細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定存在對(duì)堿基的雙鏈分子，在細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定存在3- 4d3-

50、4d，以，以33端端懸垂懸垂TTTT堿基的雙鏈堿基的雙鏈RNARNA尤為穩(wěn)定，半衰期遠(yuǎn)長(zhǎng)于反義寡聚核尤為穩(wěn)定，半衰期遠(yuǎn)長(zhǎng)于反義寡聚核苷酸。苷酸。 RNAi的的可傳播性和遺傳性可傳播性和遺傳性：RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以長(zhǎng)距離傳遞和維持信號(hào)甚至傳播至整個(gè)有機(jī)體以及可遺以長(zhǎng)距離傳遞和維持信號(hào)甚至傳播至整個(gè)有機(jī)體以及可遺傳給傳給F1，但，但F2往往恢復(fù)為野生型。往往恢復(fù)為野生型。 RNAi效應(yīng)的依賴性：只有連續(xù)產(chǎn)生效應(yīng)的依賴性：只有連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能產(chǎn)生長(zhǎng)期才能產(chǎn)生長(zhǎng)期效應(yīng)，否則只產(chǎn)生短暫的沉默反應(yīng)。效應(yīng)，否則只產(chǎn)生短暫的沉默反應(yīng)。 RNAi作用迅速，作用迅速，mRNA快

51、速降解；快速降解；miRNA及其作用機(jī)制及其作用機(jī)制miRNA(microRNA) : 微小微小RNA，指長(zhǎng)度約，指長(zhǎng)度約2125nt的小分子單鏈的小分子單鏈RNA，位于基因組的非編碼區(qū)，位于基因組的非編碼區(qū)，進(jìn)化上高度保守，可在進(jìn)化上高度保守，可在翻譯水平上翻譯水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)的RNA家族。其介導(dǎo)的沉默機(jī)制也屬于轉(zhuǎn)錄后家族。其介導(dǎo)的沉默機(jī)制也屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。的基因沉默。miRNA基因的表達(dá)具有特定模式基因的表達(dá)具有特定模式: 階段特異性和組階段特異性和組織特異性，在不同組織中表達(dá)有不同類型的織特異性，在不同組織中表達(dá)有不同類型的miRNA，在生物發(fā)育的不同階

52、段里有不同的在生物發(fā)育的不同階段里有不同的miRNA 表達(dá)。表達(dá)。miRNA的的作用機(jī)制作用機(jī)制相同點(diǎn)相同點(diǎn):長(zhǎng)度都約長(zhǎng)度都約22 nt 左右；左右；同是同是Dicer產(chǎn)物，因此具有產(chǎn)物，因此具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)；產(chǎn)物的特點(diǎn)；二者生成都需二者生成都需Argonaute 家族蛋白的存在；家族蛋白的存在；同是同是RISC的組分。的組分。miRNA與與siRNA比較比較 來源不同：來源不同：siRNA來源于轉(zhuǎn)基因或病毒來源于轉(zhuǎn)基因或病毒RNA，由長(zhǎng)，由長(zhǎng)dsRNA轉(zhuǎn)變而來；轉(zhuǎn)變而來；miRNA來源于內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本，是細(xì)胞內(nèi)來源于內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本，是細(xì)胞內(nèi)RNA的固的固有組分之一，由具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的有組分之

53、一，由具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的pre-miRNA轉(zhuǎn)變而來；轉(zhuǎn)變而來； 結(jié)構(gòu)不同：結(jié)構(gòu)不同：siRNA主要以雙鏈形式存在，其主要以雙鏈形式存在，其3端存在端存在2個(gè)非個(gè)非配對(duì)的堿基，通常為配對(duì)的堿基，通常為UU；miRNA主要以單鏈形式存在；主要以單鏈形式存在； 對(duì)靶對(duì)靶RNA 的特異性不同：的特異性不同： siRNA與靶與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；結(jié)合；miRNA與靶與靶RNA并不完全互補(bǔ)，存在錯(cuò)配現(xiàn)象。靶并不完全互補(bǔ)，存在錯(cuò)配現(xiàn)象。靶序列有一個(gè)核苷酸突變，就會(huì)影響到序列有一個(gè)核苷酸突變，就會(huì)影響到siRNA的作用功能，但的作用功能，但不會(huì)影響到不會(huì)影響到miRNA的功能；的功能； 作用

54、形式不同：作用形式不同：siRNA主要在轉(zhuǎn)錄后通過降解主要在轉(zhuǎn)錄后通過降解mRNA發(fā)揮作發(fā)揮作用，而用，而miRNA只在蛋白質(zhì)翻譯水平上負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。只在蛋白質(zhì)翻譯水平上負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。不同點(diǎn)不同點(diǎn):（四）、（四）、RNARNA干擾的研究方法干擾的研究方法 一般技術(shù)路線一般技術(shù)路線（五）、（五）、RNARNA干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 1.基因功能研究基因功能研究由于由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)

55、有力的研究工具。以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。已有研究表明已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)類似基因敲除的效應(yīng)。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近來操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研

56、究基因功能不可或?qū)⒊蔀檠芯炕蚬δ懿豢苫蛉钡墓ぞ?。缺的工具?2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療 使用使用RNAi技術(shù)來阻止艾滋病病毒進(jìn)入人體細(xì)胞。某技術(shù)來阻止艾滋病病毒進(jìn)入人體細(xì)胞。某研究小組設(shè)計(jì)合成的研究小組設(shè)計(jì)合成的lenti病毒載體引入病毒載體引入siRNA，激發(fā)，激發(fā)RNAi使其抑制了使其抑制了HIV-1的的coreceptor-CCR5（化介素（化介素受體，受體， HIV-1的輔因子的輔因子）進(jìn)入人體外周淋巴細(xì)胞，）進(jìn)入人體外周淋巴細(xì)胞，而不影響另一種而不影響另一種HIV-1主要的主要的coreceptor-CCR4，從，從而使以而使以lenti病毒載體為媒介引導(dǎo)病毒載體為媒介引

57、導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此治療生了免疫應(yīng)答，由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。病的可行性大大增加。艾滋病艾滋病2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療 Shlomai和和Shaul設(shè)計(jì)了各針對(duì)設(shè)計(jì)了各針對(duì)HBV基因基因19nt的兩種的兩種pSUPER載體：載體：pSUPER X-siRNA和和pSUPER core-siRNA。已轉(zhuǎn)染含。已轉(zhuǎn)染含1.3 X wt HBV基因質(zhì)粒載體基因質(zhì)粒載體的的Huh7細(xì)胞再被細(xì)胞再被 X-siRNA或或 core-siRNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染后，core蛋白水平分別降低了蛋白水平分別降低了89%、6

58、3%，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染X-siRNA的細(xì)胞中的細(xì)胞中HBsAg降低降低60%，但轉(zhuǎn)染，但轉(zhuǎn)染core-siRNA對(duì)對(duì)HBsAg表達(dá)無明顯影響表達(dá)無明顯影響（X-siRNA干擾沉干擾沉默了所有的病毒轉(zhuǎn)錄物，而默了所有的病毒轉(zhuǎn)錄物，而core-siRNA僅沉默僅沉默3.5kb、3.9kb的的mRNA）。）。 HBV（乙肝病毒）（乙肝病毒）2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療 Randall等證明了針對(duì)等證明了針對(duì)HCV RNA的的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞4天后可使細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的天后可使細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的HCV RNA降低降低80倍；將倍；將siRNA 轉(zhuǎn)染至已有轉(zhuǎn)染至已有HCV感染、復(fù)制的細(xì)胞，感染、復(fù)制

59、的細(xì)胞，siRNA對(duì)對(duì)98%以上可檢測(cè)到以上可檢測(cè)到HCV抗原、抗原、HCV復(fù)制活躍的細(xì)復(fù)制活躍的細(xì)胞有抑制作用；胞有抑制作用；siRNA干擾沉默干擾沉默HCV RNA具有劑量具有劑量依賴性和序列特異性。依賴性和序列特異性。Kapadia等等 也證明了也證明了siRNA特異抑制特異抑制HCV RNA復(fù)制、阻止相關(guān)蛋白表達(dá)的作用。復(fù)制、阻止相關(guān)蛋白表達(dá)的作用。 HCV（丙肝病毒）（丙肝病毒）2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療 RNAi還可應(yīng)用于其它病毒感染如脊髓灰質(zhì)炎病毒等，還可應(yīng)用于其它病毒感染如脊髓灰質(zhì)炎病毒等，siRNA已證實(shí)介導(dǎo)人類細(xì)胞的細(xì)胞間抗病毒免疫，用已證實(shí)介導(dǎo)人類細(xì)胞的細(xì)胞間抗病毒免疫，用siRNA對(duì)對(duì)Magi細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可使其對(duì)病毒的抵抗能細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可使其對(duì)病