糞便基因組DNA快速提取試劑盒操作方法及步驟說明書

1、杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp:/ TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號 RP02 使用手冊 實驗室使用，僅用于體外 TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號 RP02 使用手冊 實驗室使用，僅用于體外 TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號 RP02 使用手冊 實驗室使用，僅用于體外糞便基因組DNA快速提取試劑盒目錄號：DN23目錄編號包裝單位DN230150次v 適用范圍：適用于快速提取各種糞便DNA v 試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：試劑盒組成保存50次緩沖液ASL室溫70 ml雜質清除劑AB室溫5 ml結合液CB室溫11 ml抑制物去除液IR室溫25

2、ml漂洗液WB室溫15 ml第一次使用前按說明加指定量乙醇洗脫緩沖液EB室溫15 ml蛋白酶K粉（可選）20mg/ml-2020mg吸附柱AC室溫50個收集管（2ml）室溫50個本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。雜質清除劑AB升級，可以室溫存放，使用更方便。儲存事項:1. 緩沖液ASL或者結合液CB低溫時可能出現析出和沉淀，可以在70水浴幾分鐘幫助重新充分溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。2. 為避免降低活性，方便運輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解，因為反復凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，20保存。3.

3、 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。v 產品介紹：常規(guī)的DNA純化方式并不能有效地去除糞便中存在的大量抑制因子而導致下游實驗的失敗，如PCR不能擴增出所需片段。該試劑盒采用DNA吸附柱和新型獨特的溶液系統(tǒng)，能有效去除動物糞便中各種影響下游實驗（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收糞便中的基因組DNA。動物糞便樣品經特殊緩沖液ASL重懸后，70處理5分鐘裂解細菌；離心去除不溶解的雜質，蛋白酶K消化進一步去除蛋白和雜質；然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜， 再通過一系列快速的漂洗離心的步驟， 抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物

4、、蛋白等雜質去除， 最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫。v 產品特點：1. 離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩(wěn)定的弊端。2. 不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。3. 快速，簡捷，單個樣品操作一般可在40分鐘內完成。4. 多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.71.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應。v 注意事項1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 541

5、5C 或者類似離心機。2. 開始實驗前將需要的水浴先預熱到70備用。3. 結合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。4. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA， 不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫， 但應該確保pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應該保存在20。DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。5. PCR可能被過量的DNA（一般大于1g）抑

6、制，使用最小用量的洗脫DNA（適當稀釋）反而可以得到更好的擴增。一般加入的洗脫DNA體積不要超過總PCR反應體積的10。我們建議在PCR反應體系中加入終濃度0.1 g/l的BSA（牛血清白蛋白）有助于得到最佳擴增效果。v 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）提示：第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!1. 收集約200-220mg糞便到一個2ml離心管，置冰上。如果是冰凍的標本，加入緩沖液ASL前不能解凍，否則DNA容易降解。2. 加1.4ml 緩沖液ASL，連續(xù)渦旋振蕩1分鐘或者直到完全混勻均一。注意完全渦旋

7、混勻，否則會嚴重降低產量。3. 將重懸物70溫育5分鐘。該加熱步驟可以提高3-5倍DNA產量，并且?guī)椭呀饧毦图纳x。對于某些難裂解的細胞（如革蘭氏陽性菌）可以提高到95。4. 渦旋振蕩15秒，室溫放置1分鐘。最高速離心1分鐘沉淀糞便顆粒。5. 轉移900l上清到一個1.5ml離心管，加入100l雜質清除劑AB，立刻渦旋振蕩1分鐘或者直到完全混勻均一，室溫放置1分鐘。最高速離心3分鐘去除雜質。6. 轉移所有上清到一個1.5ml離心管，最高速離心3分鐘。7. 轉移210l上清到一個1.5ml離心管，加入20l蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，加入200l 結合液CB，渦旋振蕩15秒，

8、充分混勻。70溫育10分鐘。如果產量偏低，可以轉移更多的上清，并且相應的按比例提高蛋白酶K和結合液的和后面的異丙醇使用量。8. 冷卻后加入100l 異丙醇，渦旋混勻。9. 將上一步所得溶液和可能出現的沉淀都加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。10. 加入500l抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。11. 加入600l漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。12. 加入600l漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。13. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,

9、000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。14. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100150l洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液可事先在 65-70水浴中預熱）， 室溫放置2分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于50l，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。15. DNA可以存放在2-8，如果要長時間存放，可以放置在20。v 問題與解決方法:問題評論與建議洗脫

10、液沒有DNA或者產量低*樣品儲存不當-建議：樣品應該儲存在4或者20*在緩沖液ASL中渦旋勻漿不充分-建議：樣品在ASL中充分的渦旋直到均一。*和結合液CB混勻不充分-建議：上清和結合液CB立即充分間斷渦旋混勻。*上離心柱前忘記加異丙醇-建議：記住加異丙醇* DNA洗脫不充分-建議：洗脫前在室溫放5分鐘*第一次使用前，漂洗液WB中忘記加無水乙醇-建議：在漂洗液WB中加入指定量無水乙醇。A260/A280比值異常高*殘留RNA過高-建議：洗脫緩沖液加RNase A，室溫10-30分鐘。DNA下游反應不正常* BSA沒有加到PCR反應體系-建議：PCR反應體系中加入終濃度0.1 g/l的BSA。*下游反應中使用的DNA過量了-建議：假如DNA使用太多，可能會抑制PCR反應，因此可減少洗脫DNA使用量*非特異性