醫(yī)學生物化學及分子生物學第八版課件全套第二十四章疾病相關基因的鑒定與基因功能研究

1、目錄目錄目錄目錄第二十四章第二十四章 疾病相關基因的鑒定疾病相關基因的鑒定與基因功能研究與基因功能研究目錄目錄疾病相關基因是醫(yī)學分子生物學最重要的領域，因為疾病相關基因是醫(yī)學分子生物學最重要的領域，因為幾乎所有的疾病都與基因結(jié)構或表達變化有關，都是遺傳幾乎所有的疾病都與基因結(jié)構或表達變化有關，都是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。疾病相關基因疾病相關基因 致病基因致病基因：一種疾病的表型和一個基因型呈直接對應一種疾病的表型和一個基因型呈直接對應的因果關系，即該基因結(jié)構或表達的異常的因果關系，即該基因結(jié)構或表達的異常是導致該病發(fā)生的直接原因是導致該病發(fā)生的直接原因

2、疾病易感基因疾病易感基因：環(huán)境因素和遺傳因素均起著一定作用，環(huán)境因素和遺傳因素均起著一定作用，表現(xiàn)為表現(xiàn)為2個以上基因的個以上基因的“微效作用微效作用”的的相加，或者多基因間的相互作用，而單相加，或者多基因間的相互作用，而單一基因變異僅增加對疾病的易感性一基因變異僅增加對疾病的易感性目錄目錄第一節(jié)第一節(jié) 鑒定疾病相關基因的鑒定疾病相關基因的原則原則 目錄目錄一、鑒定疾病相關基因的關鍵是確定一、鑒定疾病相關基因的關鍵是確定疾病表型和基因間的實質(zhì)聯(lián)系疾病表型和基因間的實質(zhì)聯(lián)系正確的診斷正確的診斷是鑒定疾病基因的先決條件是鑒定疾病基因的先決條件 確定疾病的遺傳因素確定疾病的遺傳因素，即通過孿生子分析

3、，即通過孿生子分析，領養(yǎng)分析和同胞罹患率分析等確定遺傳因素領養(yǎng)分析和同胞罹患率分析等確定遺傳因素是否在疾病發(fā)病中的作用及其作用程度。是否在疾病發(fā)病中的作用及其作用程度。 目錄目錄二、鑒定克隆疾病相關基因需要多學科二、鑒定克隆疾病相關基因需要多學科多途徑的綜合策略多途徑的綜合策略疾病相關基因鑒定克隆策略示意圖疾病相關基因鑒定克隆策略示意圖 目錄目錄三、確定候選基因是多種克隆疾病三、確定候選基因是多種克隆疾病相關基因方法的交匯相關基因方法的交匯有許多途經(jīng)能夠達到最終鑒定疾病相關基有許多途經(jīng)能夠達到最終鑒定疾病相關基因的目的，這些方法最終將交匯在候選基因上。因的目的，這些方法最終將交匯在候選基因上。

4、一旦候選基因被鑒定，即可篩檢患者中該基因一旦候選基因被鑒定，即可篩檢患者中該基因的突變。候選基因可不依賴其在染色體位置而的突變。候選基因可不依賴其在染色體位置而予以鑒定，但常用的策略仍然是首先找出候選予以鑒定，但常用的策略仍然是首先找出候選染色體區(qū)域，然后在此區(qū)域內(nèi)鑒定候選基因。染色體區(qū)域，然后在此區(qū)域內(nèi)鑒定候選基因。 目錄目錄第二節(jié)第二節(jié) 疾病相關基因克隆的疾病相關基因克隆的策略和方法策略和方法目錄目錄一、不依賴染色體定位的疾病相關基一、不依賴染色體定位的疾病相關基因克隆策略因克隆策略 不依賴染色體定位的疾病相關基因克隆策不依賴染色體定位的疾病相關基因克隆策略包括功能克隆、表型克隆及采用位點

5、非依賴略包括功能克隆、表型克隆及采用位點非依賴的的DNA序列信息和動物模型來鑒定和克隆疾序列信息和動物模型來鑒定和克隆疾病基因。病基因。目錄目錄（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構出發(fā)克（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構出發(fā)克隆疾病基因隆疾病基因功能克?。üδ芸寺。╢unctional cloningfunctional cloning）采用的是從采用的是從蛋白質(zhì)到蛋白質(zhì)到DNADNA的研究路線，針對的是一些對影的研究路線，針對的是一些對影響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病 1 1依據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關基因依據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關基

6、因 2 2用蛋白質(zhì)的特異性抗體鑒定疾病基因用蛋白質(zhì)的特異性抗體鑒定疾病基因 目錄目錄（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關基因關基因表型克?。ū硇涂寺。╬henotype cloning）基于對疾病基于對疾病表型和基因結(jié)構或基因表達的特征聯(lián)系已經(jīng)有所表型和基因結(jié)構或基因表達的特征聯(lián)系已經(jīng)有所認識的基礎上來分離鑒定疾病相關基因認識的基礎上來分離鑒定疾病相關基因 目錄目錄1. 從從疾病的表型疾病的表型出發(fā)，比較患者基因組出發(fā)，比較患者基因組DNA與正常人基因與正常人基因組組DNA的不同，直接對產(chǎn)生變異的的不同，直接對產(chǎn)生變異的DNA片段進行克隆，片段進行克隆，而

7、不需要基因的染色體位置或基因產(chǎn)物的其他信息。而不需要基因的染色體位置或基因產(chǎn)物的其他信息。 2. 針對針對已知基因已知基因。如果高度懷疑某種疾病是由于某個特殊。如果高度懷疑某種疾病是由于某個特殊的已知基因所致，可通過比較患者和正常對照間該基因表的已知基因所致，可通過比較患者和正常對照間該基因表達的差異來確定該基因是否為該疾病相關基因。達的差異來確定該基因是否為該疾病相關基因。 3. 針對針對未知基因未知基因的，可通過比較疾病和正常組織中的所有的，可通過比較疾病和正常組織中的所有mRNA的表達種類和含量間的差異，從而克隆疾病相關基的表達種類和含量間的差異，從而克隆疾病相關基因。這種差異可能源于基

8、因結(jié)構改變，也可能源于表達調(diào)因。這種差異可能源于基因結(jié)構改變，也可能源于表達調(diào)控機制的改變?？貦C制的改變。依據(jù)依據(jù)DNA或或mRNA的改變與疾病表型的關的改變與疾病表型的關系，可有幾種策略：系，可有幾種策略： 目錄目錄針對未知基因常用的技術有針對未知基因常用的技術有mRNA差異顯示差異顯示（mRNA differential display，mRNA-DD）抑制消減雜交抑制消減雜交（suppressive substractive hybridization，SSH） 基因表達系列分析基因表達系列分析（SAGE） cDNA微陣列微陣列 （cDNA microarray） 基因鑒定集成法基因鑒定

9、集成法 （integrated procedure for gene identification） 目錄目錄RDA技術原理和基本過程示意圖技術原理和基本過程示意圖目錄目錄mRNA-DD技術原理和基本過程示意圖技術原理和基本過程示意圖 目錄目錄（三）采用動物模型鑒定克隆疾病相關基因（三）采用動物模型鑒定克隆疾病相關基因人類的部分疾病，已經(jīng)有相應的動物模型。人類的部分疾病，已經(jīng)有相應的動物模型。如果動物某種表型的突變基因定位于染色體的如果動物某種表型的突變基因定位于染色體的某一部位某一部位, 而具有相似人類疾病表型的基因很而具有相似人類疾病表型的基因很有可能存在于人染色體的同源部位。有可能存在于

10、人染色體的同源部位。另外，當疾病基因在動物模型上已完成鑒另外，當疾病基因在動物模型上已完成鑒定，還可以采用熒光原位雜交來定位分離人的定，還可以采用熒光原位雜交來定位分離人的同源基因。同源基因。 目錄目錄二、定位克隆是鑒定疾病相關基因的二、定位克隆是鑒定疾病相關基因的經(jīng)典方法經(jīng)典方法定位克?。ǘㄎ豢寺。╬ositional cloning）：僅根僅根據(jù)疾病基因在染色體上的大體位置，鑒定克隆疾據(jù)疾病基因在染色體上的大體位置，鑒定克隆疾病相關基因病相關基因。定位克隆的起點是基因定位，即確定疾病相關基因定位克隆的起點是基因定位，即確定疾病相關基因在染色體上的位置，然后根據(jù)這一位置信息，應用在染色體上的

11、位置，然后根據(jù)這一位置信息，應用DNA標記將經(jīng)典的遺傳學信息轉(zhuǎn)換為遺傳標記所代表的特定標記將經(jīng)典的遺傳學信息轉(zhuǎn)換為遺傳標記所代表的特定基因組區(qū)域，再以相關基因組區(qū)域的相連重疊群基因組區(qū)域，再以相關基因組區(qū)域的相連重疊群 （contig） 篩選候選基因，最后比較患者和正常人這些篩選候選基因，最后比較患者和正常人這些基因的差異，確定基因和疾病的關系?；虻牟町?，確定基因和疾病的關系。目錄目錄（一）基因定位的方法（一）基因定位的方法1體細胞雜交法通過融合細胞的篩查定位基因體細胞雜交法通過融合細胞的篩查定位基因 2染色體原位雜交是在細胞水平定位基因的常用方法染色體原位雜交是在細胞水平定位基因的常用方法

12、3. 染色體異常有時可提供疾病基因定位的替代方法染色體異常有時可提供疾病基因定位的替代方法 4連鎖分析是定位疾病未知基因的常用方法連鎖分析是定位疾病未知基因的常用方法目錄目錄（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1盡可能縮小染色體上的候選區(qū)域盡可能縮小染色體上的候選區(qū)域2構建目的區(qū)域的物理圖譜構建目的區(qū)域的物理圖譜3. 疾病相關基因的確定疾病相關基因的確定目錄目錄（三）假肥大型肌營養(yǎng)不良基因的克隆是（三）假肥大型肌營養(yǎng)不良基因的克隆是定位克隆的成功例證定位克隆的成功例證首先，根據(jù)患病女性首先，根據(jù)患病女性X染色體與第染色體與第21號常染色體的易號常染色體的易位

13、，以及男患兒發(fā)生小的位，以及男患兒發(fā)生小的Xp21.2缺失并伴發(fā)三種其他缺失并伴發(fā)三種其他X連連鎖隱性遺傳病，再運用鎖隱性遺傳病，再運用RFLP連鎖分析將連鎖分析將DMD基因定位于基因定位于Xp21。然后，分別克隆得到了基因的然后，分別克隆得到了基因的2個不同的片段，分別個不同的片段，分別命名為命名為XJ系列探針和系列探針和pERT87系列探針，根據(jù)兩片段的比系列探針，根據(jù)兩片段的比較，證明較，證明DMD基因約為基因約為2300 kb，占，占X染色體的染色體的1%以上，以上，該基因編碼肌營養(yǎng)不良蛋白（該基因編碼肌營養(yǎng)不良蛋白（dystrophin），影響橫紋?。绊憴M紋肌和心肌的結(jié)構和收縮功

14、能。和心肌的結(jié)構和收縮功能。假肥大型肌營養(yǎng)不良（假肥大型肌營養(yǎng)不良（DMD）目錄目錄三、確定常見病的基因需要全基因三、確定常見病的基因需要全基因組關聯(lián)分析和全外顯子測序組關聯(lián)分析和全外顯子測序全基因組的關聯(lián)研究（全基因組的關聯(lián)研究（genome-wide association study, GWAS）全外顯子測序（全外顯子測序（whole exon sequencing）目錄目錄四、生物信息數(shù)據(jù)庫貯藏豐富的疾病相四、生物信息數(shù)據(jù)庫貯藏豐富的疾病相關基因信息關基因信息人類基因組計劃和多種模式生物基因組測人類基因組計劃和多種模式生物基因組測序的完成序的完成, 生物信息學的發(fā)展生物信息學的發(fā)展,

15、計算機軟件的開計算機軟件的開發(fā)應用和互聯(lián)網(wǎng)的普及，人們通過已獲得的序發(fā)應用和互聯(lián)網(wǎng)的普及，人們通過已獲得的序列與數(shù)據(jù)庫中核酸序列及蛋白質(zhì)序列進行同源列與數(shù)據(jù)庫中核酸序列及蛋白質(zhì)序列進行同源性比較，或?qū)?shù)據(jù)庫中不同物種間的序列比較性比較，或?qū)?shù)據(jù)庫中不同物種間的序列比較分析、拼接，預測新的全長基因等，進而通過分析、拼接，預測新的全長基因等，進而通過實驗證實，從組織細胞中克隆該基因，這就是實驗證實，從組織細胞中克隆該基因，這就是所謂的所謂的電子克隆電子克隆 （in silico cloning）。）。 目錄目錄第三節(jié)第三節(jié) 疾病相關基因的功能疾病相關基因的功能研究研究目錄目錄基因的功能實際是基因的

16、功能實際是基因產(chǎn)物的功能基因產(chǎn)物的功能，也就是編碼，也就是編碼基因的蛋白質(zhì)功能和非編碼基因基因的蛋白質(zhì)功能和非編碼基因RNA的功能，前者是的功能，前者是本節(jié)討論的重點。本節(jié)討論的重點?；虍a(chǎn)物基因產(chǎn)物之一蛋白質(zhì)的之一蛋白質(zhì)的功能可以從三個不同水平來描述：功能可以從三個不同水平來描述： 生物化學水平生物化學水平，主要描述基因產(chǎn)物參與了何種生化過，主要描述基因產(chǎn)物參與了何種生化過程，如屬于激酶、轉(zhuǎn)錄因子等；程，如屬于激酶、轉(zhuǎn)錄因子等； 細胞水平細胞水平, 主要論述基因產(chǎn)物在細胞內(nèi)的定位和參與的主要論述基因產(chǎn)物在細胞內(nèi)的定位和參與的生物學途徑，例如，某蛋白質(zhì)定位于核內(nèi)，參與生物學途徑，例如，某蛋白質(zhì)

17、定位于核內(nèi)，參與DNA的修復過程，有可能并不了解確切的生物化學功能；的修復過程，有可能并不了解確切的生物化學功能； 整體水平整體水平, 主要包括基團表達的時空性及基因在疾病中主要包括基團表達的時空性及基因在疾病中的作用。的作用。目錄目錄一、基因比對及功能詮釋一、基因比對及功能詮釋 常用的兩大雙序列比對工具是常用的兩大雙序列比對工具是BLAST和和FASTA,分別由美國國立生物技術信息中心（分別由美國國立生物技術信息中心（NCBI）和歐洲生物信息學研究所（和歐洲生物信息學研究所（EBI）開發(fā)和維護。）開發(fā)和維護。NCBI的主頁是的主頁是/；EB

18、I的主頁是的主頁是http:/www.ebi.ac.uk/。 目錄目錄二、利用工程細胞研究基因功能二、利用工程細胞研究基因功能 （一）采用基因重組技術建立基因高表達工（一）采用基因重組技術建立基因高表達工程細胞系程細胞系（二）基因沉默技術抑制特異基因的表達（二）基因沉默技術抑制特異基因的表達 目錄目錄三、研究生物大分子間的相互作用可確三、研究生物大分子間的相互作用可確定基因功能定基因功能 在一些情況下在一些情況下, 即使對基因的序列、結(jié)構和表達模式有即使對基因的序列、結(jié)構和表達模式有清楚的認識，但仍然難以闡明基因所表達的蛋白質(zhì)的功能。清楚的認識，但仍然難以闡明基因所表達的蛋白質(zhì)的功能。此時通過研究該蛋白質(zhì)與已知功能蛋白質(zhì)的相互作用，無疑此時通過研究該蛋白質(zhì)與已知功能蛋白質(zhì)的相互作用，無疑將非常有助于對該蛋白質(zhì)功能的了解。將非常有助于對該蛋白質(zhì)功能的了解。 常用的高通量篩查蛋白質(zhì)間相互作用的方法是常用的高通量篩查蛋白質(zhì)間相互作用的方法是酵母雙雜酵母雙雜交技術交技術（見第二十章）和（見第二十章）和噬菌體展