儀器分析高效液相色譜

1、第第10章章 高效液相色譜高效液相色譜10.1 概述概述10.2 HPLC 儀器儀器 包括：包括： 高壓輸液裝置高壓輸液裝置; 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng); 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng); 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng);輔助系統(tǒng)輔助系統(tǒng)10.3 流動相和固定相簡介流動相和固定相簡介10.4 高效液相色譜方法簡述高效液相色譜方法簡述 分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜2022-6-20210.1 概述概述 高效液相色譜高效液相色譜（High performance liquid chromatography, HPLC） 是以溶劑液體為流動相的色譜方法

2、。是以溶劑液體為流動相的色譜方法。 按照固定相不同可分為：按照固定相不同可分為： 液液-液分配色譜；液分配色譜； 吸附色譜（液吸附色譜（液-固色譜）；固色譜）； 離子交換色譜；離子交換色譜； 尺寸排阻色譜（凝膠滲透色譜）尺寸排阻色譜（凝膠滲透色譜） 親和色譜親和色譜 平板色譜（薄層色譜）等。平板色譜（薄層色譜）等。 2022-6-203 早期液相色譜，包括早期液相色譜，包括Tswett的工作，都是在直徑的工作，都是在直徑15cm, 長長50500cm的玻璃柱中進行的。為保證有一定的柱流速，填充的玻璃柱中進行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在的固定相顆粒直徑多在150200 m范

3、圍內(nèi)。即使這樣，流速仍范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低（然很低（7時，該檢測器不夠靈敏）。時，該檢測器不夠靈敏）。 其它檢測器還包括：其它檢測器還包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector（光散射）、極譜等。（光散射）、極譜等。2022-6-202910.3 HPLC 流動相和固定相簡介流動相和固定相簡介一、流動相一、流動相 與與GC 流動相不同，流動相不同，HPLC 流動相為溶劑，它既有運載作流動相為溶劑，它既有運載作用，又和固定相一樣，參予對組分的競爭，因此溶劑的選擇用，又和固定相一樣，參予對組分的競爭，因此溶劑的選擇對分離十分重要。對分離十

4、分重要。理想的溶劑應(yīng)有下列特性：理想的溶劑應(yīng)有下列特性：1）對待測物具一定極性和選擇性；）對待測物具一定極性和選擇性；2）使用）使用UV檢測器時，溶劑截止波長要小于測量波長（為什檢測器時，溶劑截止波長要小于測量波長（為什么？）；使用折光率檢測器，溶劑的折光率要與待測物的折么？）；使用折光率檢測器，溶劑的折光率要與待測物的折光率有較大差別；光率有較大差別；3）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時可使截止波長）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時可使截止波長增加；增加；4）化學(xué)穩(wěn)定性好；）化學(xué)穩(wěn)定性好；5）適宜的粘度。粘度過高，柱壓增加；過低，產(chǎn)生氣泡。）適宜的粘度。粘度過高，柱壓增加；過低，產(chǎn)生

5、氣泡。2022-6-2030二、固定相載體二、固定相載體 由于各種由于各種HPLC 分離方法的流動相均為液體，因此，分離方法的流動相均為液體，因此，HPLC 通常是按照固定相載體或固定液的不同來分類的。通常是按照固定相載體或固定液的不同來分類的。1. 按承受壓力分按承受壓力分剛性固體：剛性固體：二氧化硅二氧化硅為基質(zhì)為基質(zhì) 耐壓為耐壓為7.01081.0109 Pa 主要用于吸附、分配和鍵合色譜；主要用于吸附、分配和鍵合色譜；硬硬 膠：膠： 以以聚合物聚合物為基質(zhì)（苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成）為基質(zhì)（苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成） 耐壓上限為耐壓上限為3.5 108 Pa 主要用于離子交換和尺寸排阻

6、色譜。主要用于離子交換和尺寸排阻色譜。2022-6-20312. 按孔隙深度分按孔隙深度分表面多孔型：表面多孔型：以以實心玻璃珠實心玻璃珠為基體，在基體表面覆蓋一層多為基體，在基體表面覆蓋一層多孔活性材料（如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰孔活性材料（如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等）。表面多孔型固定相的顆粒大（易裝柱）、多孔層厚胺等）。表面多孔型固定相的顆粒大（易裝柱）、多孔層厚度小且孔淺（滲透性好，出峰快）；但交換容量小。適于常度小且孔淺（滲透性好，出峰快）；但交換容量小。適于常規(guī)分離分析。規(guī)分離分析。全多孔型：全多孔型：全部由全部由硅膠或氧化鋁硅膠或氧化鋁微粒聚集而成，

7、因顆粒極細，微粒聚集而成，因顆粒極細，因而孔徑小、傳質(zhì)快、因而孔徑小、傳質(zhì)快、 柱效高。特別適于復(fù)雜混合物的分離。柱效高。特別適于復(fù)雜混合物的分離。3. 按分離原理分：按分離原理分： 分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜和色譜等等2022-6-203210.4 高效液相色譜方法各論高效液相色譜方法各論一、分配色譜一、分配色譜1. 原理：原理： 根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度溶解度不同，不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動相的移因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流

8、動相的移動，這種分配平衡需進行多次，造成各待測物的遷移速率動，這種分配平衡需進行多次，造成各待測物的遷移速率不同，從而實現(xiàn)分離的過程不同，從而實現(xiàn)分離的過程。2022-6-20332. 流動相流動相: 為防止固定相的流失，為防止固定相的流失，流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。或者說二者的極性相差越大越好。流動相與固定相極性的差別程度液液色譜分為：流動相與固定相極性的差別程度液液色譜分為： 正相分配色譜：正相分配色譜：流動相極性小于固定相極性，極性小流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離；的先流出，適于極性組分分離； 反相分配

9、色譜：反相分配色譜：流動相極性大于固定相極性，極性大流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離。的先流出，適于非極性組分分離。2022-6-20343. 固定相：固定相： 原則上，用于原則上，用于GC 的固定相也可用于的固定相也可用于HPLC 作固定相。作固定相。但但HPLC 固定液易流失，因此常用的只有幾種固定液易流失，因此常用的只有幾種- 按極性由高到低為：按極性由高到低為： , -氧二丙腈氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇、聚乙二醇(PEM)、十八烷、十八烷(C18)、角鯊?fù)?、角鯊?fù)?SQ)。 涂漬方法的不同分為：涂漬方法的不同分為：機械涂漬型和化學(xué)鍵合型機械涂漬型和化學(xué)鍵

10、合型，后者，后者應(yīng)用更為廣泛。應(yīng)用更為廣泛。2022-6-20351）機械涂漬固定相：）機械涂漬固定相：將固定液通過機械混合的方法涂漬到將固定液通過機械混合的方法涂漬到表面多孔型（表面多孔型（0.5-1.5%涂布量）或全多孔型載體（涂布量）或全多孔型載體（5-10%涂涂布量）上形成的液液色譜固定相。布量）上形成的液液色譜固定相。 最大的不足是：最大的不足是：固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。差，不適合梯度淋洗。 為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置前置柱柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固

11、定液，使流，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動相進入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。動相進入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。2022-6-20362）化學(xué)鍵合固定相：）化學(xué)鍵合固定相： 通過化學(xué)反應(yīng)將有機分子鍵合在載體表面所形成。具通過化學(xué)反應(yīng)將有機分子鍵合在載體表面所形成。具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點。有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點。 分離機理：分離機理：吸附和液液分配二者兼而有之吸附和液液分配二者兼而有之?；瘜W(xué)鍵合的。化學(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機理起主要作用。表面覆蓋度決定哪種機理起主要作用。 2022-6-2037通常，化學(xué)鍵合相的通常，化學(xué)鍵合相的載體載體主要是

12、主要是硅膠硅膠（表面有硅醇基）：（表面有硅醇基）：Si-O-R：對熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強極性會水解，使酯鏈斷裂，因?qū)岵环€(wěn)定、遇水、乙醇等強極性會水解，使酯鏈斷裂，因 此只適于以不含水或醇的流動相。此只適于以不含水或醇的流動相。Si-R(或或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方 便。使用水溶液作流動相時，其便。使用水溶液作流動相時，其pH應(yīng)在應(yīng)在4-8之間。之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對水穩(wěn)定。范圍內(nèi)對水穩(wěn)定。HClSiROSiiClSROHSi)(RSiClSi

13、OHSi)(ROSiOHROHSi)(33RMgClRLiSOClSOCl22 硅硅烷烷化化方方法法三三酰酰氯氯化化方方法法二二硅硅酯酯化化方方法法一一或或2022-6-2038固定相極性小固定相極性小 如硅膠如硅膠-C18，硅膠硅膠-苯基；苯基； 流動相極性大流動相極性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和無機鹽的緩沖液。水、水和無機鹽的緩沖液。 反相鍵合色譜法反相鍵合色譜法 分析對象分析對象 多用于多環(huán)芳烴多用于多環(huán)芳烴(PAHs)等低極性化合物分離；改變流等低極性化合物分離；改變流動相配比，動相配比，也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離解的化合物，如

14、有機解的化合物，如有機有機酸、有機酸、有有機機堿和酚堿和酚類類。 固定相極性固定相極性大大 硅膠硅膠-OH(或雙或雙-OH)，硅膠硅膠-CN 流動相極性流動相極性小小 烴類烴類+適量極性溶劑適量極性溶劑(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 正正相鍵合色譜法相鍵合色譜法 分析對象分析對象 多用于極性或中等極性化合物的分離。多用于極性或中等極性化合物的分離。還可用于分離還可用于分離異構(gòu)體、異構(gòu)體、極性不同的化合物以及不同類型的化合物。極性不同的化合物以及不同類型的化合物。 4. 正相和反相鍵合色譜法正相和反相鍵合色譜法 正相鍵合色譜中，隨流動相極性增加，組分分配比正相鍵合色譜中，隨流動相極性增加

15、，組分分配比k 增加。增加。1、在、在HPLC分析中，有時要在流動相中加入適量的鹽（碳酸銨、四烷基銨鹽）或酸，分析中，有時要在流動相中加入適量的鹽（碳酸銨、四烷基銨鹽）或酸，為為 什么？什么？答：加入鹽類是為了減少待測物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類答：加入鹽類是為了減少待測物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類 待測物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。這些措施均可防止峰形拖尾。待測物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。這些措施均可防止峰形拖尾。2、何為正相色譜，何為反相色譜？、何為正相色譜，何為反相色譜？2022-6-2039正相色譜：低極性流動相正相色譜：低極性流動相C

16、先流出先流出反相色譜：高極性流動相反相色譜：高極性流動相A先流出先流出中等極性流動相中等極性流動相中等極性流動相中等極性流動相時間時間時間時間時間時間時間時間正、反相色譜中極性和保留時間的關(guān)系正、反相色譜中極性和保留時間的關(guān)系待測物極性：待測物極性：ABC2022-6-2040時間，時間，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅膠硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可見：反相鍵合色譜中，可見：反相鍵合

17、色譜中，鍵合相碳鏈越長鍵合相碳鏈越長（極性越小極性越?。?，分離效果越好。），分離效果越好。2022-6-2041有機氯農(nóng)藥殘留量分析： 固定相：薄殼型硅膠(3750 m) 流動相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色譜柱：50 cm2.5 mm(內(nèi)徑) 檢測器：差示折光檢測器可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進行分析。多環(huán)芳烴分析： 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：20%甲醇-水100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1 mL/min 柱 溫：50C 柱 壓：70104 Pa 檢測器：紫外檢測器1.苯2.萘3.聯(lián)苯4.菲5.蒽6.熒蒽7.芘11.苯并芘12.苯并a芘1. 艾氏劑；

18、2. p,p-DDT; 3. p,p-DDT4. gama-六六六; 5. 蒽氏劑2022-6-2042二、離子交換色譜二、離子交換色譜 此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測定各類陰、陽離子的此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測定各類陰、陽離子的分離分析方法。它既適于無機離子，也適于有機物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、分離分析方法。它既適于無機離子，也適于有機物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。核酸等。1. 原理：利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來原理：利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來實現(xiàn)分離的。待測離子與離子交換樹脂固定相上帶

19、電荷基團或游離的離子發(fā)生實現(xiàn)分離的。待測離子與離子交換樹脂固定相上帶電荷基團或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：可逆交換反應(yīng)： 對陽離子，滯留時間從大到小的順序為：對陽離子，滯留時間從大到小的順序為：Fe3+, Ba2+, Pb2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, UO22+, Tl+, Ag+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+, Li+ 對陰離子，滯留時間從大到小的順序為：對陰離子，滯留時間從大到小的順序為：檸檬酸根檸檬酸根, SO42-, C2O42-, I-, HSO4-, NO3-, CrO42-, B

20、r-, SCN-, Cl-, HCOO-, CH3COO-, OH-, F- ClXNRRXClNR-R:HMSORMHSO-R:33-3-3陰離子交換陰離子交換陽離子交換陽離子交換2022-6-20432. 固定相固定相 按離子交換劑類型分四種：按離子交換劑類型分四種： 按固定相制作方法可分為：按固定相制作方法可分為： 多孔型離子交換樹脂（包括微孔型和大孔型）；多孔型離子交換樹脂（包括微孔型和大孔型）； 表面多孔型（包括薄膜型）離子交換樹脂；表面多孔型（包括薄膜型）離子交換樹脂； 離子交換鍵合型。離子交換鍵合型。 類型類型 官官能能團團 強強陽陽離離子子交換交換劑劑 -SO3- 陽陽離離子子

21、交換交換劑劑 弱弱陽陽離離子子交換交換劑劑 -CO2- 強強陰陰離離子子交換交換劑劑 -NR3+ 陰陰離離子子交換交換劑劑 弱弱陰陰離離子子交換交換劑劑 -NH2+ 2022-6-20441）多孔型：）多孔型： 聚苯乙烯聚苯乙烯 + 二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型和大孔型。交換基團多和大孔型。交換基團多交換容量大，交換容量大，穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速度慢。速度慢。2）表面多孔型：）表面多孔型： 薄膜型薄膜型 = 惰性核惰性核 + 樹脂薄層樹脂薄層(1-2 m) 多孔型多孔型 = 惰性核惰性核 + 樹脂薄層樹脂薄層 +硅膠微球。硅膠

22、微球。 克服了多孔型離子交換樹脂的不足，克服了多孔型離子交換樹脂的不足，但交換容量低，柱子易超負荷。但交換容量低，柱子易超負荷。3）離子交換鍵合相：）離子交換鍵合相： 利用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團鍵合到利用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。載體可以是薄殼玻珠，也惰性載體表面。載體可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子?？傻玫叫阅芊€(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子。微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型離子交換層離子交換層惰性核惰性核惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆離子交換劑硅

23、膠層涂覆2022-6-20453. 流動相流動相 離子交換色譜流動相為鹽類緩沖溶液（有一定離子交換色譜流動相為鹽類緩沖溶液（有一定pH和離子強度）和離子強度） ，通過改變，通過改變pH、緩沖劑類型、離子強度、加入有機試劑和配位劑等條件來控制分配比緩沖劑類型、離子強度、加入有機試劑和配位劑等條件來控制分配比k，從而改變，從而改變交換劑的選擇性、影響樣品中待測物的分離。交換劑的選擇性、影響樣品中待測物的分離。pH值：值：影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分數(shù)。當組分以分子形影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分數(shù)。當組分以分子形式存在時，則不被保留；離子分數(shù)越高，保留值越大。常用

24、的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、式存在時，則不被保留；離子分數(shù)越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。離子強度離子強度I：對保留值的影響比對保留值的影響比pH 更大更大。組分保留值受流動相中鹽類總濃度控制。組分保留值受流動相中鹽類總濃度控制。增加外加陰或陽離子將增加它們對增加外加陰或陽離子將增加它們對R+ 或或R- 的競爭能力，使組分保留值減小。的競爭能力，使組分保留值減小。通過加入不同種類的鹽，可影響柱的選擇性，因為不同物質(zhì)對交換劑的親和能力不通過加入不同種類的鹽，可影響柱的選擇性，因為不同物質(zhì)對交換劑的親和能力不同。同。有機溶劑：有機溶劑：外加有機

25、溶劑通常減小組分的保留值。外加有機溶劑通常減小組分的保留值。其極性越小，保留值越小。常用其極性越小，保留值越小。常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。的有機溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。配離子配離子L：當大量當大量 L 和組分和組分 X 隨流動相進入柱后，發(fā)生配位劑交換：隨流動相進入柱后，發(fā)生配位劑交換：RM-L+X RM-X+L該法用于分離各種氨基酸或堿類。該法用于分離各種氨基酸或堿類。思考：離子交換色譜法中，流動相常以無機鹽的緩沖液為流動相。請問緩沖液的思考：離子交換色譜法中，流動相常以無機鹽的緩沖液為流動相。請問緩沖液的pH值及離子強度對分離各有何影響？離子交換色譜

26、通常以什么為檢測器？值及離子強度對分離各有何影響？離子交換色譜通常以什么為檢測器？2022-6-2046三、離子色譜法三、離子色譜法 離子色譜（離子色譜（IC）是）是70年代發(fā)展的新方法。其分離原理與離子交換色譜原年代發(fā)展的新方法。其分離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用理一樣，只是流出的各種離子用電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器檢測。但由于流動相都是強電解質(zhì)，檢測。但由于流動相都是強電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測離子約高其電導(dǎo)率比待測離子約高2個數(shù)量級，這種強背景電導(dǎo)會完全掩蓋待測離子信個數(shù)量級，這種強背景電導(dǎo)會完全掩蓋待測離子信號。號。 為解決此問題，為解決此問題，1975年年Small 提出，

27、在離子交換柱之后，再串結(jié)一根提出，在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制抑制柱柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的高容量的離子交換樹脂。通過分離柱后。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的高容量的離子交換樹脂。通過分離柱后的的“樣品和流動相樣品和流動相”再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘霸俳?jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動相，從而可用電導(dǎo)檢測器檢測各種離子的含量。電導(dǎo)的流動相，從而可用電導(dǎo)檢測器檢測各種離子的含量。 例如：分析陽離子時，以例如：分析陽離子時，以無機酸無機酸為流動相，分離柱則采用為流動相，分離柱則采用陽離子交換劑陽離子交換劑，抑制柱為抑制柱為高容量的強堿性

28、陰離子交換樹脂高容量的強堿性陰離子交換樹脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+OH + HCl(流動相流動相)R+Cl- + H2O R+OH + MCl(待測物待測物) R+Cl + M+OH- 可見，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度可見，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。的堿。 同樣，若樣品為陰離子，以同樣，若樣品為陰離子，以無機堿無機堿為流動相，分離柱則采用為流動相，分離柱則采用陰離子交換劑陰離子交換劑，抑制柱為抑制柱為高容量強酸性陽離子交換劑高容量強酸性陽離子交換劑。2022-6-2047 該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生

29、、該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會展寬，降低分離度。譜峰在經(jīng)過抑制柱后會展寬，降低分離度。因此有人提出了使用電導(dǎo)率很低的溶液（如因此有人提出了使用電導(dǎo)率很低的溶液（如苯甲酸鹽稀溶液）作流動相。苯甲酸鹽稀溶液）作流動相。思考：思考：IC分離中，何為抑制柱？分析陰離子分離中，何為抑制柱？分析陰離子時，抑制柱中應(yīng)填充何種離子交換樹脂？時，抑制柱中應(yīng)填充何種離子交換樹脂？采用抑制柱的優(yōu)缺點是什么？采用抑制柱的優(yōu)缺點是什么？陰離子分析: 雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(325 cm)流動相：0.003 M NaHCO3+ 0.0024 M Na2CO3，流量2.3 mL/mi

30、n。 七種陰離子在20min內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在350 ppm。2022-6-2048四、離子對色譜法（四、離子對色譜法（IPC） 離子對色譜主要用來分離強極性有機酸或有機堿。離子對色譜主要用來分離強極性有機酸或有機堿。基本原理：將與待測物離子基本原理：將與待測物離子A電荷相反的離子電荷相反的離子B（稱為對離子或反離子）（稱為對離子或反離子）加入到流動相（多為有機相）中，使待測離子加入到流動相（多為有機相）中，使待測離子A與對離子與對離子B形成離子對形成離子對AB，該，該AB離子對離子對的性質(zhì)與的性質(zhì)與A離子離子或或B離子離子的性質(zhì)不同，即間接改變了的性質(zhì)不同，即間接改變了待測離

31、子的保留特性。待測離子的保留特性。 例如：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，于流動相中加例如：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，于流動相中加入與待測離子入與待測離子A-有相反電荷的離子有相反電荷的離子B+： 由于離子對由于離子對AB具有疏水性，因而被非極性固定相提取。其它待測具有疏水性，因而被非極性固定相提取。其它待測離子離子A1，A2，A3.因與因與B離子間的成對能力不同，而形成不同疏水離子間的成對能力不同，而形成不同疏水性的離子對，使得各待測物在柱內(nèi)的保留值不同，從而達到分離的目性的離子對，使得各待測物在柱內(nèi)的保留值不同，從而達到分離的目的。的。 有機相有機相水相水相水相水相BAB

32、A2022-6-2049陰離子分離陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；三甲銨作為對離子；陽離子分離陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；反相離子對色譜反相離子對色譜：非極性的疏水固定相：非極性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有對離子，含有對離子Y+的甲的甲醇醇-水或乙腈水或乙腈-水作為流動相，試樣離子水作為流動相，試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性進入流動相后，生成疏水性離子對離子對Y+ X -后；在兩相間分配。后；在兩相間分配。思考：有一強

33、極性有機酸混合物，若用離子對色譜法分離，請問在流思考：有一強極性有機酸混合物，若用離子對色譜法分離，請問在流動相中應(yīng)加入陰離子還是陽離子來形成離子對？動相中應(yīng)加入陰離子還是陽離子來形成離子對？2022-6-2050五、尺寸排阻色譜法五、尺寸排阻色譜法 尺寸排阻色譜又稱凝膠色譜，尺寸排阻色譜又稱凝膠色譜，主要用于大分子的分子分離主要用于大分子的分子分離。它是基于待測物分。它是基于待測物分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。包括凝膠過濾色譜（子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。包括凝膠過濾色譜（GFC，以水為流動相）和，以水為流動相）和凝膠滲透色譜（凝膠滲透色譜（GPC，以有機溶劑為流動相），以有機溶劑為

34、流動相）1. 分離原理：固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類似于分子篩，但孔徑更大。凝膠分離原理：固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類似于分子篩，但孔徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被淋內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被淋洗出來，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，最后流出色譜柱。即待測物分子按洗出來，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，最后流出色譜柱。即待測物分子按分子大小分子大小(分子量大小分子量大小)先后從柱中流出。先后從柱中流出。2. 固定相固定相3. 流動相的要求：能溶解樣品且與凝膠相似流動相的要求：能溶解樣品且

35、與凝膠相似(潤濕凝膠潤濕凝膠)、粘度小、粘度小(增加擴散速度增加擴散速度)。 類型類型 材料材料 型號型號 特點特點 流動相流動相 葡萄糖凝膠葡萄糖凝膠 Sephadax 水水 軟性凝膠軟性凝膠 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶脹溶脹,小分小分子分離子分離 有機溶劑有機溶劑 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有機溶劑有機溶劑 半剛性凝膠半剛性凝膠 聚乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶脹溶脹較小較小流速較小流速較小 有機溶劑有機溶劑 玻璃珠玻璃珠 CPG-10 有機溶劑和水有機溶劑和水 剛性凝膠剛性凝膠 多孔硅膠多孔硅膠 Porasil 剛性大、剛性大、高高流速分離流速分離 有機

36、溶劑和水有機溶劑和水 2022-6-2051 六、親合色譜六、親合色譜 主要用于生物大分子與固定相之主要用于生物大分子與固定相之間的特異親合力進行選擇性分離及純間的特異親合力進行選擇性分離及純化的方法?；姆椒?。分離原理：于載體表面先鍵合具有一分離原理：于載體表面先鍵合具有一般反應(yīng)性能的環(huán)氧或聯(lián)氨（稱為間隔般反應(yīng)性能的環(huán)氧或聯(lián)氨（稱為間隔臂），然后再連接上配基，臂），然后再連接上配基，如酶、抗如酶、抗原或激素。原或激素。 當含有復(fù)雜混合試樣的流動相流當含有復(fù)雜混合試樣的流動相流經(jīng)這種經(jīng)固定化的配基時，其中具有經(jīng)這種經(jīng)固定化的配基時，其中具有親合力特性的生物大分子與配基相互作用而被保留，無此作用

37、的則被親合力特性的生物大分子與配基相互作用而被保留，無此作用的則被洗出；隨后，改變流動相洗出；隨后，改變流動相pH或組成，再將被保留的大分子組分以純品或組成，再將被保留的大分子組分以純品的形式洗脫出來。的形式洗脫出來。特點：選擇性過濾、純化效果好。特點：選擇性過濾、純化效果好。2022-6-2052 七、色譜分離方法的選擇七、色譜分離方法的選擇分子量分子量 水溶水溶性性 方方 法法 流動相流動相 可溶可溶 排阻色譜排阻色譜 水水 2000 不溶不溶 排阻色譜排阻色譜 水水 分配色譜分配色譜(同系物同系物) 各種各種 吸附色譜吸附色譜(異構(gòu)物異構(gòu)物) 各種各種 不溶不溶 排阻色譜排阻色譜(分子大

38、小分子大小) 各種各種 反相液液色譜反相液液色譜 各種各種 可溶但不解離可溶但不解離 排阻色譜排阻色譜 水水 陽離子交換色譜陽離子交換色譜(堿堿) 緩沖液緩沖液 可溶且不解離可溶且不解離 陰離子交換色譜陰離子交換色譜(酸酸) 緩沖液緩沖液 2000 可溶離子或非離子可溶離子或非離子 反相離子色譜反相離子色譜 緩沖液緩沖液 2022-6-20531（bar）=105（Pa） 1（dyn/cm2）=0.1（Pa） 1（Torr）=133.322（Pa） 1（mmHg）=133.322（Pa）1毫米水柱（毫米水柱（mmH2O）=9.80665（Pa） 1工程大氣壓工程大氣壓=98.0665（kPa）

39、 1（kPa）=0.145磅磅/英寸英寸2（psi）=0.0102（kgf/cm2） =0.0098（atm） 1磅磅/英寸英寸2（psi）=6.895（kPa）=0.0703（kg/cm2）=0.0689（bar）=0.068（atm）1物理大氣壓（物理大氣壓（atm）=101.325（kPa）=14.696磅磅/英寸英寸2（psi）=1.0333（bar）2022-6-2054 液相色譜的柱子通常分為液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱正相柱和反相柱。 正相柱：正相柱：大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱；等官能團的鍵合

40、相硅膠柱； 反相柱：反相柱：填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團（十八烷基官能團（ODS）稱為）稱為C18柱，其它常用的反相柱還柱，其它常用的反相柱還有有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚柱，聚合物填料柱等。合物填料柱等。液相色譜柱的選擇、使用、維液相色譜柱的選擇、使用、維護和常見故障及排除護和常見故障及排除2022-6-2055一、反相色譜柱的選擇一、反相色譜柱的選擇 1柱子的柱子的pH值使用范圍值使用范圍 反相柱優(yōu)點是固定相穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。但硅反相柱優(yōu)點是

41、固定相穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料，使用時一定要注意流動相的膠為基質(zhì)的填料，使用時一定要注意流動相的PH范圍。范圍。一般的一般的C18柱柱PH值范圍都在值范圍都在2-8，流動相的，流動相的pH值小于值小于2時，會導(dǎo)致鍵合相的水解；時，會導(dǎo)致鍵合相的水解；當當pH值大于值大于7時硅膠易溶解；經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦時硅膠易溶解；經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相譜柱不盡相同。如果流動相pH較高或經(jīng)常使用緩沖液時，建議選擇較高或經(jīng)常

42、使用緩沖液時，建議選擇pH范圍大的柱子，例如戴安公司的范圍大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱柱pH 2-9或或Zorbax的的pH 2-11. 5的柱子。的柱子。2填料的端基封尾（或稱封口）填料的端基封尾（或稱封口） 把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進行端基封尾，可改善對極性把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進行端基封尾，可改善對極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時間重現(xiàn)性就好。如果待分析的離；填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，最好選

43、用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。樣品屬酸性或堿性的化合物，最好選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。2022-6-2056二、液相色譜柱的使用二、液相色譜柱的使用 色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結(jié)果保色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是最佳條件），只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。條件是最佳條件），只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。 注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫

44、等注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。條件的差異而有所不同。1、樣品的前處理：、樣品的前處理：a）最好使用流動相溶解樣品；）最好使用流動相溶解樣品；b）使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆）使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)吸附的雜質(zhì)c）使用）使用0.45m的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。 2022-6-20572、流動相的配制：、流動相的配制： 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備許多特點：達到分離的目的，

45、因此要求流動相具備許多特點：a）流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會）流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）；沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）； b）流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)；）流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)；2022-6-2058c）流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低）流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流柱壓降，延長泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）；動相的黏度）；d）流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用）流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測

46、器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制；檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制；e）流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無）流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進行；法進行；f）在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動）在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。氧與樣品發(fā)生作用。2022-6-20593、流動相流速的選擇：、流動相流速的選擇： 因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可因柱效是柱中流動相線

47、性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。，最好使用最佳流速。 內(nèi)徑為內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇的色譜柱，流速一般選擇1mlmin 內(nèi)徑為內(nèi)徑為4.0mm柱，流速柱，流速0.8mlmin為佳。為佳。 當選用最佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃赢斶x用最佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間（如使用反相柱時，可相的洗滌強度的方法以縮短分析時間（如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。適當增加甲醇或乙腈的含量）。2022-6-2

48、060注意：注意：a）含水流動相最好在臨實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶）含水流動相最好在臨實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不過夜。最好加入疊氮化鈉，液作為流動相不過夜。最好加入疊氮化鈉， 防止細菌生長。防止細菌生長。b）流動相要求使用）流動相要求使用0.45 m濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。c）使用）使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。譜柱的使用壽命，提高柱性能。2022-6-2061三三 色譜柱的維護色譜柱的維護1、色譜柱的平衡、色譜柱的平衡 反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。水中的。新柱應(yīng)新柱應(yīng)先使用先使用10-20倍柱體積