生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)李峰 李榮 張建平 編湖南文理學(xué)院生命科學(xué)系前 言生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是以生物為研究對象，利用生物化學(xué)的原理和方法，闡明生物體內(nèi)化學(xué)分子的結(jié)構(gòu)與化學(xué)反應(yīng)的機(jī)理，從分子水平探討生命現(xiàn)象的本質(zhì)，并為人類服務(wù)的一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)，是生物科學(xué)、農(nóng)學(xué)、動物科學(xué)專業(yè)、生命學(xué)科相關(guān)專業(yè)本科生及與湖南省中學(xué)生物學(xué)教師及科技人員重要的專業(yè)基礎(chǔ)技術(shù)。它是在植物生物學(xué)、動物生物學(xué)、微生物學(xué)等普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)有比較全面了解及一定基礎(chǔ)訓(xùn)練基礎(chǔ)上開設(shè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。旨在培養(yǎng)具有現(xiàn)代生物學(xué)知識，掌握現(xiàn)代生物化學(xué)技術(shù)的創(chuàng)新人才培養(yǎng)具有現(xiàn)代生物學(xué)知識前沿、掌握現(xiàn)代生物學(xué)基本技術(shù)，具有綜合設(shè)計(jì)、創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ膭?chuàng)新人才。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指

2、導(dǎo)是熊大勝教授主持的“生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)531課程體系研究”的實(shí)驗(yàn)教材之一。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)K按生物化學(xué)及生化大實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)功能構(gòu)建，承擔(dān)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)及生物化學(xué)與分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)K以提高學(xué)生應(yīng)用生物化學(xué)原理和方法，解決生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題為目標(biāo)，改革以往生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱，從加強(qiáng)基礎(chǔ)的觀點(diǎn)出發(fā)，側(cè)重于學(xué)生基本技能，綜合能力，創(chuàng)新能力三個(gè)層次的培養(yǎng)，同時(shí)也注意增加一些新近發(fā)展起來的重要的生物化學(xué)研究方法和技術(shù)。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)K共包括15個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)注重加強(qiáng)學(xué)生基本技能的培養(yǎng)，使學(xué)生掌握蛋白質(zhì)和核酸的基本結(jié)構(gòu)及組分鑒定方法；掌握蛋白質(zhì)性質(zhì)的綜合測定，了解蛋白質(zhì)沉淀和變性等重要概念；掌握最

3、常用的蛋白質(zhì)制備、分離和純化過程和方法；通過淀粉酶的提取，活性測定以及淀粉酶動力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)，加深對酶的特性認(rèn)識；進(jìn)一步熟悉掌握微量滴定法的基本操作技術(shù)；注重培養(yǎng)學(xué)生綜合能力，通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作，掌握氨基酸含量的測定方法；掌握核酸的提取過程以及核酸含量和純度的測定技術(shù)；熟悉掌握電泳技術(shù)的基本原理和操作技術(shù)；血糖的定量測定和脂肪酸的氧化實(shí)驗(yàn)，掌握有關(guān)物質(zhì)代謝中生理生化指標(biāo)的測定方法；在生化大實(shí)驗(yàn)中開設(shè)了總RNA的提取及鑒定和半定量RT-PCR檢測基因的表達(dá)差異兩個(gè)綜合性大實(shí)驗(yàn)；本實(shí)驗(yàn)?zāi)K還開設(shè)了為期6周的選修開放項(xiàng)目基因的克隆、鑒定及生物信息學(xué)分析（創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)），使學(xué)生更

4、好的將基礎(chǔ)知識與專業(yè)技術(shù)銜接。通過該實(shí)驗(yàn)課的基本訓(xùn)練，使學(xué)生掌握常見生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的原理和方法，提高學(xué)生獨(dú)立思考、觀察、分析問題和解決問題的能力，同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識、科學(xué)素養(yǎng)和科研能力。通過實(shí)驗(yàn)，鞏固和加深生物化學(xué)課程的基礎(chǔ)理論知識，為今后的科學(xué)研究打下堅(jiān)實(shí)的生物化學(xué)基礎(chǔ)。編者于湖南文理學(xué)院2004年12月目 錄第一篇 常用生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及原理第一章 透析 （1）一、膜 （1）二、溶劑 （1）三、物理?xiàng)l件 （2）四、Donnan 平衡 （2）第二章 層析法 （3）一、柱層析法的一般技術(shù)（3）二、幾種常見的層析法 （5）第三章 電泳技術(shù) （18）一、電泳技術(shù)的基本原理（19）二、

5、紙電泳 （21）三、醋酸纖維薄膜電泳（22）四、瓊脂糖凝膠電泳 （22）五、聚丙烯酰胺凝膠電泳 （23）第二篇 學(xué) 生 實(shí) 驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn) （30）實(shí)驗(yàn)二 牛乳中蛋白質(zhì)的提取與鑒定（35）實(shí)驗(yàn)三 氨基酸的分離鑒定紙層析法（37）實(shí)驗(yàn)四 酶的特性（39）實(shí)驗(yàn)五 酵母核糖核酸的分離及組分鑒定（46）實(shí)驗(yàn)六 紫外分光光度法測定核酸的含量（49）實(shí)驗(yàn)七維生素C的定量測定（51）實(shí)驗(yàn)八 血糖的定量測定GOD-PAP法（54）實(shí)驗(yàn)九脂肪酸的氧化（57）實(shí)驗(yàn)十 DNA的瓊脂糖凝膠電泳（60）實(shí)驗(yàn)十一 蛋白質(zhì)的透析（62）實(shí)驗(yàn)十二 聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳血清蛋白的分離 （64）實(shí)驗(yàn)十三 總RNA的

6、提取及鑒定（69）實(shí)驗(yàn)十四 半定量RT-PCR檢測基因的表達(dá)差異（76）實(shí)驗(yàn)十五 基因的克隆、鑒定及生物信息學(xué)分析（82）62第一篇 常用生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及原理第一章 透析透析是利用小分子能通過,而大分子不能通過半透膜的原理把它們分開的一種重要手段。通常的做法是將小分子和大分子的混合物放進(jìn)用半透膜制成的透析袋里并沉沒在大量的水中。袋內(nèi)的小分子就不斷通過膜進(jìn)入外部溶劑中待達(dá)到平衡為止。如果對流水透析或不斷更換透析袋的溶劑可以做到袋內(nèi)的混合物幾乎不含小分子。透析的速度受一些因素的影響。下面就粗略地討論這些因素。一、膜1、材料 火棉膠是最常用的透析袋材料。各種規(guī)格的火棉膠袋已做成商品出售。也可用玻璃

7、紙代替火棉膠。2、制備 先將一適當(dāng)大小和長度的透析管放在堿性EDTA溶液中沸騰30分鐘以避免待透析的分子損失活性。然后，用蒸餾水洗滌透析管。結(jié)扎管的一端并將所研究的材料充滿透析管（袋），然后結(jié)扎頂部。透析最好在新制備的管中進(jìn)行，因?yàn)闈竦耐肝龃浅Ｈ菀资芪⑸锔腥尽Ｈ绻仨毐４嫱肝龃?，則應(yīng)有溶液中加入痕量的苯甲酸。3、通透性 透析袋的通透性因袋的大小和預(yù)處理的方法不同而異。但透析過夜時(shí)，半透膜大體可以允許相對分子質(zhì)量（Mr）30000以下的化合物通過。實(shí)際上沒有嚴(yán)格的界限，透析時(shí)間延長時(shí)稍大的分子也透過膜。有一系列的商品材料有更高的透析速度和更精細(xì)的通透范圍可做精細(xì)分離之用。二、溶劑1、水溶液

8、一般說，透析的速度在蒸餾水中最大，雖然通常需要特定的pH和離子強(qiáng)度的水溶液來穩(wěn)定所研究的分子。2、大分子溶液 透析時(shí)水將進(jìn)入透析袋，因此應(yīng)該將透析袋裝滿以避免透析的材料過于稀釋。如果用一種不活潑的高分子化合物如聚乙烯醇6000代替通常使用的水溶液作為溶劑，則透析時(shí)水就會由透析袋中滲出，用這種方法透析過夜，可將200mL溶液濃縮至幾mL。三、物理?xiàng)l件1、溫度 透析速度也受溫度的影響，溫度越高透析速度越快。提高溫度時(shí)，溶劑的粘度降低而擴(kuò)散速度增加。此外，許多大分子對溫度很敏感，因此蛋白質(zhì)等的透析通常在低溫條件下進(jìn)行。2、壓力 大分子和小分子的分離也受通過膜時(shí)的壓力梯度影響?？蓪⑼肝龃旁谡婵罩校ǘ?/p>

9、不放在溶液中），并敞開透析袋的一端，此時(shí)水和小分子會滲出透析袋形成超濾液，而留在透析袋中的大分子被濃縮。這個(gè)過程稱為超濾。四、董南（Donnan）膜平衡由于大分子電解質(zhì)的存在，而使一般電解質(zhì)不均等分配在半透膜兩側(cè)的平均狀態(tài)，稱為膜的平衡。蛋白質(zhì)溶液的滲透壓與溶液的pH有關(guān)系。有酸性pH下，蛋白質(zhì)以陽離子存在，帶有正電荷；而在堿性pH下，以陰離子存在，帶有負(fù)電荷。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)鹽溶液透析時(shí)，帶電的蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜，而溶液中對立的陰離子或陽離子就要通過半透膜以平衡電荷，這就導(dǎo)致離子的膜兩邊不均等的分布，同時(shí)關(guān)系到pH的變化。這種現(xiàn)象有就稱為董南效應(yīng)，又稱分布，同時(shí)產(chǎn)生pH的變化。這種現(xiàn)象就稱為董

10、南效應(yīng)，又稱董南平衡。如帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)鹽溶液對水透析時(shí)，蛋白質(zhì)不能透過透析袋，而它的反離子可以通過，結(jié)果造成環(huán)境介質(zhì)中陽離子過多。為了保持中性，水就分解出氫離子移進(jìn)透析袋內(nèi)，蛋白質(zhì)部分的pH因此下降而水部分的pH上升。反之，如蛋白質(zhì)帶正電荷，則pH的變化相反。董南效應(yīng)可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀或變性，因而是不可取的。為減少董南效應(yīng)，透析通常對具有適當(dāng)濃度的鹽溶液進(jìn)行。第二章 層析法層析法也稱色譜法，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的（稱為固定相），另一個(gè)相則流過此固定相（稱為流動相）并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到

11、分離。層析法是近代生物化學(xué)最常用的分析方法之一，運(yùn)用這種方法可以分離性質(zhì)極為相似，而用一般化學(xué)方法難以分離的各種化合物，如各種氨基酸、核苷酸、糖、蛋白質(zhì)等。層析法有許多種類，可以根據(jù)所用兩個(gè)相的狀態(tài)和操作方式不同進(jìn)行分類如表3-1。表2-1層析法的一般分類固定相流動相操作方式名稱固體：吸咐劑離子交換劑固體液體液體液體固體液體液體液體液體液體液體氣體氣體柱型薄層柱層薄層紙柱型柱型吸附層析離子交換層析吸附薄層層析分配層析分配薄層層析紙層析氣體吸咐層析氣體分配層析此外，還有凝膠層析、親和層析和高壓液相層析等方法。在討論幾種常用的層析法之前，先介紹一下柱層析法的一般技術(shù)。一、柱層析法的一般技術(shù)1、柱

12、層析柱通常是玻璃的?？偟恼f來，長柱分辨力好，但大量物質(zhì)的處理則用粗的柱比較適宜。2、層析材料的準(zhǔn)備許多材料都可在層析法中使用。在裝柱前這些材料要用溶劑平衡，另外還需作一些預(yù)處理。例如，凝膠層析材料需要溶脹，吸附劑需要加熱或酸處理來活化，離子交換樹脂需要用酸堿處理來得到需的電離形式。在用溶劑平衡時(shí)，先使材料沉淀，用傾瀉法除去懸浮的細(xì)顆粒，否則由于細(xì)顆粒的堵塞，溶劑的流速將顯著降低3、裝柱 層析柱的填裝是先關(guān)閉出口，用溶劑灌注至1/3體積，并使支持板下的“死體積”不存有氣泡，再慢慢地向溶劑中加漿狀物，要小心地沿著玻棒傾注以防止氣泡存留在柱內(nèi)。讓懸浮液沉淀，并放出過多的溶劑，為了避免分層，最好一次裝

13、完，如需分幾次填裝，則在二次填裝前應(yīng)先在已經(jīng)沉淀的表面用玻棒攪拌后再傾注，重復(fù)這個(gè)過程，直至裝到需要的高度。用溶液徹底洗滌層析柱后使液面降到比層析床表面略高一點(diǎn)。最后覆蓋一張圓形濾紙或尼龍布，以免加樣時(shí)擾亂床表面。4、加樣 上柱前，先將樣品溶解在溶劑里或?qū)ο疵撘和肝?，樣品溶液的濃度?yīng)該盡可能高些，以減少樣品溶液體積，使區(qū)帶狹窄。將樣品仔細(xì)加到層析床的表面，打開旋塞至液面與床面齊，然后連接溶劑池，保持一定高度的液面。5、洗脫 下一步是用適當(dāng)?shù)南疵撘喊迅鹘M分依次從柱上洗脫下來。在取代擴(kuò)展法中，溶劑與層析材料的相互作用比柱上的物質(zhì)與層析材料的相互作用要強(qiáng)，于是與柱結(jié)合的分子被取代。每一個(gè)柱能結(jié)合多少

14、物質(zhì)都有一個(gè)限度（即總柱容量）。在取代擴(kuò)展的情況下，當(dāng)樣品上柱量差不多達(dá)到總柱容量的50%時(shí)，一般尚能完全完分離。但是為了得到更好的分辨力，洗脫法更為可取。洗脫法是最常用的方法。使用洗脫法，上柱量不超過總柱容量的10%，溶劑與柱相互作用比溶質(zhì)與柱的相互作用弱，溶劑越過結(jié)合的分子，逐漸地將它們從柱上沖洗下來。在沖洗過程中各組分因?yàn)槲搅Σ煌饾u分離。在一個(gè)組分被洗脫后可以更換洗脫液，這就是所謂的分步洗脫。另外，還有一個(gè)可行的方法是逐漸改充溶劑的性質(zhì)，形成一個(gè)離子強(qiáng)度、pH或極性的遞增梯度從而使各組分依次被洗脫，這種方法稱梯度洗脫，它的優(yōu)點(diǎn)之一是能夠減少拖尾現(xiàn)象。6、部分收集及分析 柱的流出液可

15、以用人工的方法收收集到一系列試管中或使用部人收集器。這種裝置能使每一管按預(yù)定的時(shí)間或滴數(shù)收集流出液，然后自動移位，下一管再繼續(xù)收集。洗脫完畢后可選用各種適宜的方法將已收集的許多部分流出液進(jìn)行定量分析，并畫出洗脫物的量對流出液體積的洗脫曲線。第一部分的蛋白質(zhì)或核酸的含酸的含量可以讓流出液通過一個(gè)流動小室測定其280nm或260nm的光吸收來進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。二、幾種常用的層析法（一）吸附層析這是首次由Tswett用來分離色素的層析方法。吸附劑的經(jīng)典含義可能說成是一種表面具有吸咐分子的特性的固體（特別是當(dāng)它是多孔的和分得很細(xì)的時(shí)候）。如氧化鋁、硅膠、活性炭等固體物質(zhì)都具有吸附性能，可以將一些物質(zhì)自溶液

16、中吸附到它的表面。它和離子交換換樹脂不同，吸附劑表面和分子的吸引力，理論上不含有靜電力。吸附可以是非常特異的，以致于可以從一個(gè)混合物中選擇性地吸附一種物質(zhì)。用這種方法所以能進(jìn)行各種成分的分離是由于它們被吸附劑所吸附的程度以及它們在分離用的溶劑中的溶解度有差異。當(dāng)然這些特點(diǎn)是由各成分的分子結(jié)構(gòu)所決定的。例如，在柱吸附層析中，混合物的分離是在裝有適當(dāng)吸附劑的玻璃柱中進(jìn)行的?；旌衔锛拥街?，然后用一個(gè)適當(dāng)?shù)娜軇?或是混合溶劑)通過這個(gè)柱。混合物就隨著溶劑的流動而逐漸分開。最初溶劑剛倒在吸附柱上時(shí)，混合物被吸附劑逐漸分開。最初溶劑剛倒在吸附柱上時(shí)，混合物全被吸附劑吸附在柱的上層，當(dāng)繼續(xù)加入溶劑時(shí)，柱中

17、就會連續(xù)不斷地發(fā)生混合物中各物質(zhì)的溶解，吸附，再溶解，再吸附的反復(fù)交替過程。如被吸附的某物質(zhì)被溶劑解出來（解吸作用）后就隨著溶劑向下面流動，當(dāng)遇到新的吸附顆粒時(shí)，又從溶劑中吸附出來，后面繼續(xù)流下來的新溶液又再把它溶解出來并被帶著往下移動，又再被吸附。就這樣，經(jīng)過一段時(shí)間之后，混合物中各物質(zhì)都會從柱頂向下移動一段距離，但是由于各物質(zhì)被吸附劑吸附的程度以及它們被溶劑溶解的能力不同而向下移動的距離不同因而彼此分離。吸附性弱的，就比較容易被溶劑溶出，又因?yàn)樗俦晃降牧α勘容^弱，所以在柱中移動的距離就大些。經(jīng)過適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，混合物中各物質(zhì)就可以完全分開?，F(xiàn)在一般最常用的方法是在各組分離以后，讓柱繼續(xù)展

18、開，用溶劑把被吸附的物質(zhì)由吸附柱上沖洗出來，部分地收集從柱上流出的洗脫液，隨后再進(jìn)行分析。對任何一種特殊的吸附劑和溶劑洗脫系統(tǒng)的選擇由所要完成的分離來決定。在選擇吸附劑時(shí)必須小心，因?yàn)橛袝r(shí)一些吸附劑在分離時(shí)可引起某些化合物的降解。吸附層析的操作方式在柱型和薄層兩種。具體操作技術(shù)請見本章“一、柱層析法的一般技術(shù)”和“（四）薄層層析”兩部分。（二）離子交換層析離子交換層析利用含有能與周圍介質(zhì)進(jìn)行離子交換的不穩(wěn)定離子的不溶性基質(zhì)來分離分離物質(zhì)。1、離子交換基質(zhì) Adams和Holnes有1935年通過酚、甲醛和磺酸縮聚成不溶性樹脂，制成了第一個(gè)人工合成的離子交換材料。從此以后，人工合成的離子交換樹脂

19、日見增多（多數(shù)是從芳香族化合物合成的），由苯乙烯及交聯(lián)劑二乙烯苯聚合得到的物質(zhì)是一種常用的樹脂基質(zhì)。通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)再將可電離基團(tuán)引入到芳香環(huán)上，二乙烯苯和苯乙烯的相對含量決定了聚苯乙烯鏈之間的交聯(lián)度。交聯(lián)度是指這種樹脂骨架中含有二乙烯苯的重量百分率。國產(chǎn)樹脂的交聯(lián)度一般為4%14%。樹脂的交聯(lián)度小時(shí)，則水溶性強(qiáng)，加水后樹脂的膨脹性大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)眼大，交換反應(yīng)快，交換選擇性低。相反，樹脂的交聯(lián)度大時(shí)，則水溶性弱，加水后樹脂的膨脹性小，網(wǎng)眼小，交換慢，具有一定的選擇性。離子交換樹脂適合分離小分子物質(zhì)，如氨基酸，但對于大分子，如蛋白質(zhì)是不適合的，因?yàn)榇蠓肿硬荒苓M(jìn)入樹脂緊密交聯(lián)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部。因此大分子

20、可以用取代的纖維素和葡聚糖來分離，這些物質(zhì)的分子是纖維狀的，它們的大部分功能基團(tuán)在表面。2、可電離基團(tuán) 按照離子交換樹脂對陰離子或陽離子的親合特性可以分為陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂。例如，陽離子交換樹脂交換周圍介質(zhì)的陽離子，也就是說，決定樹脂究竟是陰離子的還是陽離子樹脂的可交換離子所帶的電荷，而不是基質(zhì)上所帶的電荷。這兩種類型又可進(jìn)一步分成含有強(qiáng)電離基團(tuán)的，如強(qiáng)酸型和強(qiáng)堿型；及弱電離基團(tuán)的，如弱酸型和弱堿型。強(qiáng)離子交換樹脂是完全電離的，并以帶電形式存在（在極端pH值時(shí)例外）。弱離子交換樹脂所含基團(tuán)的電離程度依pH一個(gè)狹窄的pH范圍有最大交換容量方能使用。一般含羥基的樹脂在pH6左右有最大容

21、量，而帶有氨基的那些樹脂在pH低于6時(shí)才有效。離子交換纖維素含有取代了纖維素一OH的弱電離基團(tuán)，這些基團(tuán)的密度比較低，因?yàn)槿〈鄷r(shí)就會使纖維素變得可溶。對于分離結(jié)合較弱的大分子時(shí)，用弱電離部位密度較低的交換劑適合，而且在溫和條件下容易解析。3、離子交換平衡 典型的離子交換反應(yīng)過程說明，在這里用含有氨基的陰離子交換樹脂分離兩個(gè)負(fù)電性離子。樹脂可電離基團(tuán)的濃度幾乎可以達(dá)到610mol/L，因此有很高的交換容量。雖然一般以為離子交換樹脂的作用僅僅是通過離子交換過程來分離物質(zhì)，但實(shí)際上也可能存在吸附作用和分子篩作用。4、結(jié)合離子的洗脫 結(jié)合離子可以通過改變緩沖的pH來洗脫。例如，當(dāng)pH靠近一種蛋白質(zhì)

22、分子的等電點(diǎn)時(shí)，這種蛋白質(zhì)分子的凈電荷就減少，與樹脂的結(jié)合就減弱而被洗脫，別的帶電的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，這樣就達(dá)到了分離的目的。另外，溶劑中的離子要與結(jié)合離子對離子交換劑的可電離基團(tuán)發(fā)生競爭，溶劑中的離子濃度高時(shí)，就會取代結(jié)合離子，所以增加離子強(qiáng)度也可將結(jié)合離子洗脫。pH或離子強(qiáng)度可以通過更換洗脫緩沖液陡然地改變，可用前面介紹的梯度方法逐漸地改變。離子與樹脂的結(jié)合是一種動態(tài)平衡，其結(jié)合程度取決于樹脂的性質(zhì)、溫度、離子強(qiáng)度和溶劑成分。同時(shí)還與樹脂的電離度和被分離的物質(zhì)有關(guān)。高價(jià)離子最容易結(jié)合而不易洗脫，所以在用一種高價(jià)離子取代結(jié)合離子時(shí)應(yīng)使用稀溶液，而如果要導(dǎo)入一種低價(jià)離子時(shí)則需用濃溶液。5、

23、離子交換材料的準(zhǔn)備 樹脂和取代多糖（取代纖維素、取代葡聚糖）首先要在蒸餾水中吸脹，并去掉過細(xì)的顆粒。商品樹脂，特別是陽離子交換劑會含有鐵或其他重金屬，可以用24mol/L的鹽酸洗滌去除。通過用適當(dāng)?shù)娜芤合礈炜色@得所需要的離子形式的離子交換材料。例如，氫型的陽離子交換樹脂是先用鹽酸洗滌，然后用水洗滌直至流出液呈中性為止。同樣制備鈉型是用氯化鈉或氫氧化鈉溶液洗滌樹脂，再用水洗滌至中性。裝柱前的最后一步是用洗脫緩沖液平衡樹脂，顯然緩沖離子必須是不與樹脂結(jié)合的。6、離子交換層析的操作技術(shù) 詳見本書第三篇演示實(shí)驗(yàn)二。（三）分配層析常用吸附層析分離法易溶于有機(jī)溶劑而難于水的混合物?？呻婋x的水溶性混合物最適

24、宜用離子交換層析法分離。分配層析法界于二者之間，在水和有機(jī)溶劑中都可溶的混合物用分配層析法易分離。當(dāng)把一種物質(zhì)在兩種不混溶的溶劑中振蕩時(shí)，它將在這兩相中不均勻的分配。達(dá)到平衡時(shí)，這種物質(zhì)在兩種溶劑中的濃度之比是一個(gè)常數(shù)，也就是所謂的分配系數(shù)（a）。分配層析法實(shí)際上是一種連續(xù)抽提法。在這里，一種溶劑通常是被結(jié)合在固定的惰性支持物（柱或膜）上的水，另外一相由流動的被水飽和的有機(jī)溶劑構(gòu)成，它流過固定相，如果某一混合物的各組分在這兩相中的分配系數(shù)有足夠的差異，它們就可以被分離。1、紙層分析的理論 Consden，Gordom和Martin首先用濾紙作支持物并以茚三酮為靈敏顯色劑，建立了微量而簡便的分離

25、蛋白質(zhì)水解液中氨基酸的方法。不久又發(fā)現(xiàn)除了氨基酸外，糖、核苷酸、甾體激素、維生素、抗生素等很多物質(zhì)都能用紙上層析法分離，因而紙層析成為生物化學(xué)工作中一種常用的分離分析方法。濾紙是理想的支持介質(zhì)。在紙上，水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相。由于纖維素上的羥基具有親水性，和水以氫鍵相連，使這部分水不易擴(kuò)散，所以能與跟水混合的溶劑仍然形成類似不相混合的兩相。當(dāng)有機(jī)相沿紙流動經(jīng)過層析點(diǎn)時(shí)，層析點(diǎn)上溶劑就在水相和有機(jī)相之間進(jìn)行分配，且部分溶質(zhì)離開原點(diǎn)隨有機(jī)相移動而進(jìn)入水相。當(dāng)有機(jī)相不斷流動時(shí)，溶質(zhì)就沿著有機(jī)相流動的方向移動，不斷進(jìn)行分配。溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動速率也不同，因而可以彼此分開。紙

26、上層析法的一般操作是將混合物點(diǎn)到紙上，干后讓溶劑從樣品的一端經(jīng)毛細(xì)作用流到紙的另一端。等紙干后，可用適當(dāng)?shù)娘@色方法使混合物中各組分在紙上的位置顯示出來，物質(zhì)移動的距離與溶劑移動距離之比就是Rf值。某一種物質(zhì)在特定的溶劑系統(tǒng)、紙、展層方式、溫度、pH等條件下的Rf值基本上是常數(shù)。如果固定相不完全是惰性的，那么既發(fā)生分配，又有吸附作用和可能的離子交換，Rf和a的關(guān)系等式就會有例外。2、樣品的制備和點(diǎn)樣 在研究生物材料時(shí)，做層析以前樣品要脫鹽（用離子交換或電滲析），過量的鹽會使層析譜擴(kuò)散和Rf值改變，同時(shí)還會影響辨認(rèn)分離組分的化學(xué)反應(yīng)。在層析前還可用超濾或葡聚糖來除掉蛋白質(zhì)。然后用微量點(diǎn)樣管將樣品溶

27、液（220L）點(diǎn)于紙上，點(diǎn)的直徑不超過0.30.5cm，如樣品太稀需重復(fù)點(diǎn)幾次時(shí)，每次點(diǎn)之前均應(yīng)吹干，點(diǎn)間距離約23cm。3、紙的選擇 濾紙的質(zhì)地必須均一、平整及厚薄均勻，要有一定的強(qiáng)度。一般分析工作可采用新華1號濾紙（或Whatman1號），若有較多的樣品需要在紙上分離提純時(shí)則適合采用新華3號（或whatman3號）厚紙，可是其分辨力比1號濾紙差。溶劑順著紙的紋道擴(kuò)展速度快，否則速度慢。必要時(shí)，使用前可將濾紙用緩沖液浸泡或經(jīng)乙?；饔眠M(jìn)行化學(xué)修飾。4、溶劑的選擇 溶劑的選擇與紙的選擇一樣，主要是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)也取決于所要分析的物質(zhì)。如果在溶劑A中樣品物質(zhì)移動離溶劑A的前沿近，那就是溶解度太大

28、；如果在溶劑B中它們靠近原點(diǎn)周圍，那就是溶解度不夠大，因而合適的溶劑應(yīng)該是A和B的適當(dāng)?shù)幕旌衔?，以使樣品各組分的Rf值能在整個(gè)紙的長度上散布開，在某些分離中pH是一個(gè)重要因素，很多溶劑含有乙酸或氨以形成一個(gè)酸性或堿性的環(huán)境。5、展層 雖然展層的方式可以不同，但其共同點(diǎn)都是將點(diǎn)好樣品的濾紙固定，使其一邊與溶劑槽接觸，讓溶劑擴(kuò)展，整個(gè)裝置扣在密閉的容器內(nèi)，槽壁襯墊浸透溶劑的濾紙以保持恒定的蒸氣壓并且放在恒溫室里，溫度的波動全使溶劑走得不均勻，并改變Rf值。展層方式有上行、下行和環(huán)行。上行層析是比較常用的方法，它的優(yōu)點(diǎn)是可以在兩個(gè)方向上進(jìn)行（即雙向?qū)游觯；旌衔锵仍诘谝环N溶劑中被分離（溶劑應(yīng)是揮發(fā)性

29、的），干燥后將紙轉(zhuǎn)900，再在第二種溶劑中進(jìn)行層析。顯色或用其他方法定位后得到的層析圖譜與在相同條件下已知物的層析圖譜比較就能鑒定混合物的各組分。下行層析適用于一些Rf值接近的混合物。因?yàn)槿軇┑坞x紙的底部，這就能使各組分較充分地分離。當(dāng)然在這種情況下不能測定Rf值，而只能與標(biāo)準(zhǔn)參考物，如葡萄糖相比較。6、顯色 大部分化合物是無色的，可以用特殊的顯色劑使其顯色，配制顯色劑時(shí)最好使用與水不混溶且揮發(fā)性較大的溶劑。顯色劑可用噴霧器噴霧或迅速將紙?jiān)陲@色劑中浸漬。如果被分離物質(zhì)本身具有紫外吸收性質(zhì)，可在紫外線照射下與紙的熒光背景對照顯出暗的斑點(diǎn)。另外，有些化合物在紫外線下發(fā)出特殊的熒光。（四）薄層層析3

30、MaJIOB和IIIpaep在1938年敘述了植物萃取物在氧化鋁薄層上的分離，但是直到1956年以后薄層層析才逐漸引起各方面的注意和重視。薄層層析法是將支持物在玻璃板上均勻地鋪成薄層，把待分析的混合物加到薄層上，然后選擇合適的溶劑進(jìn)行展開，而達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析兼有柱層析和紙層析的優(yōu)點(diǎn)。它操作方便，設(shè)備簡單，展開時(shí)間短，一般只需幾分鐘到幾十分鐘。它靈敏度高，適用于微量樣品的分析（小到0.01mg），但是加大薄層的厚度則又能分離較多（大到500mg）的樣品。薄層層析還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是除了可用一般顯色劑外，對某些薄層材料還可用腐蝕性顯色劑，另外，還可以在支持物中加熒光染料以有助于點(diǎn)的鑒別。薄層

31、層析法分離物質(zhì)的原理依所用不同支持物的性質(zhì)而不同，可以是吸附層析、離子交換層析、分配層析或是凝膠過濾。1、薄層的制作 在玻璃板上涂鋪一層薄層，最簡單的方法是在一根玻棒的兩端繞幾圈膠布，用玻棒壓在玻板上，把支持物向一個(gè)方向推動，即成薄層。有時(shí)用上述方法制得薄層不太均勻，可能用有機(jī)玻璃自制一個(gè)涂鋪器即能取得滿意的結(jié)果。薄層厚度小于200um時(shí)將影響Rf值，一般情況下厚度為250um比較合適?？勺霰硬牧系奈镔|(zhì)很多，如硅膠、氧化鋁、纖維素粉、DEAE纖維素、葡聚糖等，具體選擇哪一種依所研究的問題而定。硅膠對大多數(shù)的物質(zhì)分離都是適宜的。有時(shí)在硅膠中加入煅石膏作為粘合劑，這時(shí)一旦與水調(diào)合就需快速操作。2

32、、展開 薄層層析的加樣與紙層析基本相同。薄層的展開需在密閉的器皿中進(jìn)行，溶劑必須達(dá)到飽和，可以在器皿內(nèi)部貼上浸濕了溶劑的濾紙條。薄層層析的展開方式與紙層析一樣，可以是上行、下行、單向或雙向。3、定位 和紙層析一樣，可用適當(dāng)?shù)娘@色劑噴霧或根據(jù)組分的紫外線吸收或熒光來定位。在有放射性物質(zhì)時(shí)用掃描來定位。（五）凝膠層析1、凝膠層析也稱凝膠過濾法，是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種簡便有效的生物化學(xué)分離分析方法。這種方法的基本原理是用一般的柱層析方法使相對分子質(zhì)量不同的溶質(zhì)通過具有分子篩性質(zhì)的固定相（凝膠），從而使物質(zhì)分離。用作凝膠的材料有多種，如交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠、聚苯乙烯和多孔玻璃珠

33、等?，F(xiàn)以利用交聯(lián)葡聚糖分離物質(zhì)和測定相對分子質(zhì)量為例說明凝膠層析法的基本原理和應(yīng)用。交聯(lián)葡聚糖（商品名Sephadex）是由細(xì)菌葡聚糖（以右旋葡萄糖為殘基的多糖）用交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形式的有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物?？刂破暇厶呛徒宦?lián)劑的配比及反應(yīng)條件就可決定其交聯(lián)度的大小（交聯(lián)度大，“網(wǎng)眼”就小），從而得到各種規(guī)格的交聯(lián)葡聚糖，即不同型號的凝膠?！癎”表示交聯(lián)度，G越小，交聯(lián)度越大，吸水量也就越小。把經(jīng)過充分溶脹凝膠裝入層析柱中，在加入樣品以后，由于交聯(lián)葡聚糖的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子能夠進(jìn)入凝膠，較大的分子則被排阻在交聯(lián)網(wǎng)狀物之外，因此各組分在層析床中移動的速度因分子的大小而不同。相對分子質(zhì)量

34、（Mr）大的物質(zhì)只是沿著凝膠顆粒間的孔隙隨溶劑流動，其流程短，移動速度快，先流出層析床。相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)可以透入凝膠顆粒，流程長，移動速度慢，比相對分子質(zhì)量大的物質(zhì)遲流出層析柱。經(jīng)過分部收集流出液，相對分子質(zhì)量（Mr）不同的物質(zhì)便互相分離。SpladexG-10到G-50通常用于分離肽或脫鹽。G-10到G-50通常用于分離肽或脫鹽。G-75到G-200可用于分離相對分子質(zhì)量大于10000的蛋白質(zhì)。交聯(lián)葡聚糖分子含有大量的羥基，極性很強(qiáng)，易吸水，所以使用前必須用水充分溶脹。1g干重凝膠充分溶脹時(shí)所需的水量（mL）稱為凝膠的得水值（Wr）。因?yàn)榈盟挡灰诇y定，故常用溶脹度即床體積來表示凝膠的得

35、水性，其定義是每克干重凝膠顆粒在水中充分溶脹后所具有的凝膠總體積。2、凝膠柱的總體積（總床體積）Vt是干膠體積Vg，在凝膠顆粒內(nèi)部的水的體積Vi及凝膠顆粒外部的水的體積Vo之和。Vt也可從柱的直徑及高度計(jì)算。Vo也稱外水體積。常常用洗脫一個(gè)已知完全被排阻的物質(zhì)（如藍(lán)葡聚糖2000）的方法來測定，此時(shí)其洗脫體積就等于Vo。Vi稱為內(nèi)部體積或內(nèi)水體積，可以從凝膠干重（mg）和得水值Wr計(jì)算： Vi = mg. WrVi也可以從洗脫一個(gè)小于凝膠工作范圍下限的小分子化合物，如鉻酸鉀來測定，其洗脫體積等于Vi+Vo。某一物質(zhì)的洗脫體積Ve為：Ve=Vo + KdViKd為溶質(zhì)在流動相和固定相之間的分配比

36、例（分配系數(shù)），每一溶質(zhì)都有特定的Kd值，它與層析柱的幾何形狀無關(guān)。如果分子完全被排阻，則Kd=0，Ve=Vo。如果分子可以完全進(jìn)入凝膠，那么Kd=1，Ve=Vo+Vi。在通常的工作范圍內(nèi)Kd是一個(gè)常數(shù)（0Kd1），有時(shí)Kd可能大于，則說明發(fā)生了凝膠對溶質(zhì)的吸附。溶質(zhì)的洗脫特征的有關(guān)參數(shù)（Ve/Vo，Ve/Vt，Kd，Kav）都與溶質(zhì)相對分子質(zhì)量（Mr）對數(shù)成線性關(guān)系，先洗脫幾個(gè)已知相對分子質(zhì)量（Mr）的球蛋白，用Ve/Vo對logMr對作圖，然后在同樣條件下洗脫未知樣品，從其Ve/Vo值，在圖上即可找出相對應(yīng)的logMr，從而進(jìn)一步算出其相對分子質(zhì)量（Mr）。不同規(guī)格的凝膠都有一定的工作范圍

37、。一般說，在工作范圍之內(nèi)所得的曲線是線性的，超出工作范圍曲線就不成線性。（六）親和層析親和層析法是分離蛋白質(zhì)酶等生物大分子的一種極為有效的方法。它在蛋白質(zhì)分離技術(shù)中占有特殊的地位。前面討論的各種分離方法是根據(jù)混合物中蛋白質(zhì)之間的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)(如蛋白質(zhì)的溶解度、電荷、分子大小或疏水作用等)的差別來純化的。這些方法的主要缺點(diǎn)是具有相似性質(zhì)的蛋白質(zhì)，由于性質(zhì)差別微小而難于分離，而親和層析是根據(jù)某種蛋白蛋對于某種配體的生物專一性。因此，如果能利用這種不同的生物專一性作為分離的基礎(chǔ)，就會產(chǎn)生一種有效的純化蛋白質(zhì)的方法。早在1910年，就有人發(fā)現(xiàn)淀粉能吸附淀粉水解酶，在1951年，有人以“免疫吸附劑

38、”的形式來分離抗體；1967年，Werle等人開始用胰蛋白酶的不溶酶提純胰蛋白酶抑制劑，等等。經(jīng)過幾十年的研究，逐漸發(fā)展成一種新型的分離技術(shù)親和層析。細(xì)胞內(nèi)任何一種蛋白質(zhì)都有專一作用的對象。因此，從原則上講，所有的蛋白質(zhì)都能通過親和層析來分離和純化。與蛋白質(zhì)發(fā)生親和作用的基團(tuán)稱為配體（ligand）。配體是指能被生物大分子所識別并與之結(jié)合的原子、原子基團(tuán)和分子。例如，酶的作用底物、輔酶、調(diào)節(jié)效應(yīng)物、激素的受體、抗原與抗體互為配體。1、親和層析的基本原理 蛋白質(zhì)與配體之間有一種特殊的親和力，在一定的條件下，它們都緊密結(jié)合成復(fù)合物，如果將復(fù)合物的某一方固定在不溶性載體上，就可以從溶液中專一性地分離

39、和提純另一方。與其他方法相比，親和層析能產(chǎn)生絕對的純化作用，因此，可達(dá)到較高的純度。采用一般的方法是提純酶、抑制劑等生物制劑，操作十分復(fù)雜，而采用親和層析，只需一步就能提純百倍，甚至千倍，從而得到純的產(chǎn)品，產(chǎn)率可達(dá)到75%95%。2、親和層析的基本方法 先將提純的某種蛋白質(zhì)的配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)，共價(jià)的連接在載體顆粒表面的功能團(tuán)上。這種載體材料在其他性能方面，允許蛋白質(zhì)自由通過，當(dāng)含有待提純的蛋白質(zhì)則與其特異的配體結(jié)合，因而被吸附在配體的載體的顆粒表面，而其他的蛋白質(zhì)因?qū)@個(gè)配體不具有特異性的結(jié)合位點(diǎn)，將通過柱子而流出。被特異地結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì)，可用自由配體的溶液洗脫下來，或通過改變?nèi)芤?/p>

40、的pH、離子強(qiáng)度，或采用一些弱的變性試劑減弱其結(jié)合，或采用某種更強(qiáng)的結(jié)合物質(zhì)與其競爭，使其從柱中分離出來，達(dá)到純化的目的。3、固相載體介質(zhì) 一般用作凝膠過濾的介質(zhì)，大都適用于親和層析的介質(zhì)。它們具有穩(wěn)定的物理和化學(xué)性質(zhì)，具有均勻、多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，允許大分子物質(zhì)自由通過，流動性好，非特異性吸附少。這些固相載體首先要用化學(xué)方法進(jìn)行活化，使其具備與特定的配體相結(jié)合的化學(xué)活性基團(tuán)。最常用的活化方法是用溴化氰（CNBr）活化瓊脂糖，目前已有商品出售。載體中的鄰位羥基和溴化氰反應(yīng)形成亞氨碳酸基因。此基因通?？梢院秃被蛄u基的配體反應(yīng)，使配體結(jié)合在固相載體上。用溴化氰活化直接把配體結(jié)合在載體上，能使配體和

41、載體偶聯(lián)緊密，但是在生物大分子特異結(jié)合時(shí)，由于空間位阻的效應(yīng)，會影響大分子結(jié)合的效率。改進(jìn)的方法是在載體上連接一個(gè)臂（一般含6個(gè)碳原子），臂的未端為一活性基團(tuán)，如氨基、羧基、活化的酯基等，靠這些活化的基團(tuán)和配體結(jié)合在一起。如CH-Sepharose 4B帶有一個(gè)6碳長的臂及活性的末端羧基；環(huán)氧活化的Sepharose6B，臂上帶有一個(gè)活化的酯基；AH-Sepharose4B，其臂末端帶一氨基；CDI-agarose含有N-氨基甲酸烷基酯。親和層析的載體多為凝膠，可分成兩類：一類是大孔型的凝膠，如瓊脂糖凝膠其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑較大，容許大分子自由進(jìn)出凝膠。另一類為微孔型的凝膠，如交聯(lián)葡聚糖凝膠和聚丙

42、烯酰胺基，它們是小孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，使分子被排阻在凝膠顆粒之外。瓊脂糖凝膠最為常見但缺點(diǎn)是當(dāng)用變性劑溶液洗脫時(shí)易于收縮。今年來出現(xiàn)的，由有機(jī)親水聚合物組成的凝膠，如乙烯聚合物，可抗壓、抗酶降解，化學(xué)穩(wěn)定性好，適于中等壓力下進(jìn)行大規(guī)模分離提純。聚丙烯酰胺含有大量的羰酰胺基，可以作為支持物載體，其缺點(diǎn)是孔徑太小。表面修飾的硅膠也可以作為親和層析的介質(zhì)，而且已應(yīng)用于高效液相色譜中，這就是高效液相親和層，它正成為生物工程的一種新工具。4、配體的選擇 配體是親和層析中最重要的成分。首先，配體必須和被分離的大分子物質(zhì)能形成適當(dāng)親和力的、特異的和可逆的結(jié)合。親和力過低，大分子物質(zhì)不能和配體有效結(jié)合，但過

43、高的親和力，需要在較強(qiáng)的條件下才能解析下來，而且有可能使某些被分離的大分子物質(zhì)變性。所以一般要求配合和大分子物質(zhì)的解離常數(shù)為5*0.0015*0.00000001mol/L。選擇好的配體有3個(gè)原則。一是能和欲分離的生物大分子專一性結(jié)合，而且親和力越大越好；二是結(jié)合后又能解離，而且無損于生物大分子的生物活性；三是配體上必須含有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，通過這些基團(tuán)可以用化學(xué)方法把配體偶聯(lián)到載體介質(zhì)上去，而且這種偶聯(lián)不損害配體與生物大分子的專一性結(jié)合。用于親和層析的配體大體分為3類：一是對特定蛋白質(zhì)具有親和力的小分子配體，如酶的底物（或底物類似物）、調(diào)節(jié)配體、效應(yīng)物、酶的輔助因子等；二是對特定蛋白質(zhì)有親和力

44、的大分子，如抗體、伴刀豆球蛋白A、蛋白質(zhì)類抑制劑、維生素或激素的結(jié)合蛋白或受體等；三是共價(jià)親和層析中的配體，它含有能與目的蛋白質(zhì)共價(jià)可逆作用部分。小分子配體與目的蛋白質(zhì)的結(jié)合專一性往往較差。如用固定化NAD純化脫氫酶時(shí)，很多脫氫酶和其他蛋白質(zhì)都能以類似的親和力結(jié)合NAD，在緩沖液中加入共配體（coligand）和尋找最佳實(shí)驗(yàn)條件可增強(qiáng)目的蛋白質(zhì)對配體的親和力。大分子配體有3類：一類是凝集類蛋白質(zhì)，能結(jié)合蛋白質(zhì)上的糖，可用于純化糖蛋白，如伴刀豆球蛋白A、抗生物素蛋白能共價(jià)結(jié)合許多生物素的酶。蛋白質(zhì)A能結(jié)合IgG分子的Fc部分，且親和力很強(qiáng)；二類是抗體，使用抗體作配體的親和層析稱為免疫親和層析；三

45、類是對某種蛋白質(zhì)有很強(qiáng)親和力的蛋白質(zhì)，如a-乳清蛋白，它在糖配體（N-乙酰葡萄糖胺）存在下，能與半乳糖轉(zhuǎn)移酶發(fā)生強(qiáng)烈的親和作用。第三章 電泳技術(shù)帶電質(zhì)點(diǎn)在電場子中移動的現(xiàn)象稱為電泳。電泳現(xiàn)象早在19世紀(jì)初期就被人們發(fā)現(xiàn)了，并用于膠體化學(xué)中，但是電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用則在20世紀(jì)40年代左右。近年來各種類型的電泳技術(shù)發(fā)展十分迅速。例如，紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、纖維素或淀粉粉末電泳、瓊脂糖凝膠電電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、線絲電泳等。在電泳形式上更是豐富多樣，有在溶液中進(jìn)行的，有將支持物做成薄膜或薄層的，也有做成平板的或柱狀的。由于與光學(xué)系統(tǒng)和自動分部收集器相結(jié)合，又組成了等電聚焦儀，等速電泳儀等等，

46、大大地發(fā)展和擴(kuò)大了電泳技術(shù)的應(yīng)用范圍。各種類型的電泳技術(shù)概括如下表3-1：表3-1電泳技術(shù)的種類類別名稱型式不用支持物的電泳技術(shù)1、 Tiselleus式微量電泳2、 顯微電泳3、 等電聚焦電泳4、 等速電泳5、 密度梯度電泳屬自由電泳用支持物的電泳技術(shù)1、 紙上電泳2、 醋酸纖維薄膜電泳3、 薄層電泳4、 非凝膠支持物區(qū)帶電泳支持物有：淀粉、纖維素粉、玻璃粉、硅膠、合成樹脂粉末包括常壓、高壓電泳（水平式或垂直式）水平式或垂直式（平板法、柱狀法及線絲法）類別名稱型式用支持物的電泳技術(shù)5、凝膠支持物區(qū)帶電泳（1）淀粉凝膠（2）聚丙烯酰胺凝膠1）圓盤電泳2）平板電泳3）SDS-圓盤電泳（3）瓊脂糖

47、凝膠電泳（4）瓊脂凝膠電泳垂直式（柱狀法）垂直式或水平式垂直式（測相對分子質(zhì)量）平板法或柱狀法（如免疫電泳）用法1、 雙向電泳2、 電泳-層析相結(jié)合技術(shù)3、 交叉電泳法4、 連續(xù)紙電泳一、電泳技術(shù)基本原理任何一種物質(zhì)的質(zhì)點(diǎn)，由于基本身在溶液中的解離或由于其表面對其他帶電質(zhì)點(diǎn)的吸附，會在電場中向一定的電極移動。倒如，氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、激素、核酸及其衍生物等物質(zhì)都具有許多可解離的酸性和堿性基因，它們在溶液中會解離而帶電。一般說來，在堿性溶液中（即溶液的pH值大于等電點(diǎn)pI），分子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。而在酸性溶液中，分子帶正電荷，在電場中分子向負(fù)極移動。移動的速度取決于帶電的多少和分子的

48、大小。不同的質(zhì)點(diǎn)在同一電場中泳動速度不同，常用泳動度（或遷移率）來表示。泳動度的定義是帶電質(zhì)點(diǎn)在單位電場強(qiáng)度下的泳動速度。泳動度首先取決于帶電質(zhì)點(diǎn)的性質(zhì)，即質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大小和質(zhì)點(diǎn)的形狀。一般來說，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，質(zhì)點(diǎn)直徑越小，越接近于球形，則在電場中的泳動速度越快；反之，則越慢。泳動度除受質(zhì)點(diǎn)本身性質(zhì)的影響外，還受其他外界因素的影響，如溶液的粘度等。影響泳動速度的主要外界因素還有下列幾種：（一）電場強(qiáng)度（電勢梯度）電場強(qiáng)度是指cm的電壓降，它對泳動速度起著十分重要的作用。例如，紙上電泳的支持物濾紙兩端相距20cm，如電壓降為200V，則電場強(qiáng)度為200V/20cm=10V/c

49、m。電場強(qiáng)度越高，帶電質(zhì)點(diǎn)移動速度越快，根據(jù)電場強(qiáng)度的大小，可將電泳分為常壓（100500V）電泳和高壓（50010000V）電泳。常壓電泳的電場強(qiáng)度一般為210V/cm，電泳分離時(shí)間較長，有時(shí)需要幾小時(shí)至幾天；高壓電泳的電場強(qiáng)度為20200V/cm，電泳分離時(shí)間較短，有時(shí)僅需幾分鐘。常壓電泳多用于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，而高壓電泳則用來分離氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物質(zhì)。在生產(chǎn)中有時(shí)需要進(jìn)行快速的中間分析，如果沒有高壓電泳設(shè)備，可以把常壓電泳小型化，縮短濾紙兩端距離，也可達(dá)到高壓快速的目的。如將原來兩端相距20cm的濾紙改為5cm，外加電壓仍為200v，電場強(qiáng)度則變?yōu)?0v/cm，這樣就加

50、快了電泳速度。（二）溶液的pH值溶液的pH值決定帶電質(zhì)點(diǎn)解離的程度，也決定物質(zhì)質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的多少。對蛋白質(zhì)、氨基酸等兩性電解質(zhì)而言，pH值距等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，泳動速度也越快；反之，則越慢。因此，當(dāng)分離某一蛋白質(zhì)混合物時(shí),應(yīng)選擇一個(gè)合適的pH值，使各種蛋白質(zhì)所帶凈電荷的量差異較大，以利于分離。為了使電泳過程中溶液的pH值恒定，必須采用緩沖溶液。（三）溶液的離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度代表所有類型的離子所產(chǎn)生的靜電力，也就是全部的離子效應(yīng)，它取決于離子電荷的總數(shù)，而與溶液中鹽類的性質(zhì)無關(guān)。溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電質(zhì)點(diǎn)的泳動速度越慢；離子強(qiáng)越低，質(zhì)點(diǎn)泳動的速度越快。一般最適合的離子強(qiáng)度在0.02

51、0.2之間.在稀溶液中，離子強(qiáng)度的計(jì)算方法，是將每一離子濃度乘以其價(jià)數(shù)的平方，再將所有乘積相加，以2除和。計(jì)算公式如下：離子強(qiáng)度（I）=0.5CZZ式中：C為離子的摩爾濃度（mol/L）； Z為離子的價(jià)數(shù)。（四）電滲現(xiàn)象液體在電場中對于一個(gè)固體支持物的相對移動，稱為電滲現(xiàn)象。例如，在紙電泳時(shí)，由于紙上帶有負(fù)電荷，而與紙接觸的水溶液因?yàn)殪o電感應(yīng)帶有正電荷，在電場的作用下溶液便向負(fù)極移動并帶動著質(zhì)點(diǎn)向負(fù)極移動。假如這時(shí)進(jìn)行電泳，則質(zhì)點(diǎn)移動的表面速度是質(zhì)點(diǎn)移動速度和由于溶液移動而產(chǎn)生的電滲速度的加和。若質(zhì)點(diǎn)原來向負(fù)極移動，則其表面速度比電泳速度快。若質(zhì)點(diǎn)原來向正極移動，則其表面速度比電泳速度慢。因此

52、，在電泳時(shí)應(yīng)盡量避免使用具有高電滲作用的支持物。二、紙電泳紙電泳是用濾紙作為支持物的電泳技術(shù)。它包括電泳槽和電泳儀兩大部分。電泳槽是進(jìn)行電泳的裝置，其中包括電極、緩沖液槽，電泳介質(zhì)的支架和不一個(gè)透明的罩。常見的電泳槽有水平式和懸駕式等。電泳儀是提供直流電源的裝置，它能控制電壓和電流的輸出。紙電泳可分為低壓電泳和高壓電泳兩類。低壓電泳儀的電壓一般為100500V，電流為0150mA。高壓電泳儀的電壓主為50010000V，電流為50400mA。電泳儀既能輸出穩(wěn)定的電壓，又能輸出穩(wěn)定的電流。紙電泳的設(shè)備簡單，應(yīng)用廣泛，是最早使用的一種電泳技術(shù)。在早期的生物化學(xué)研究中，曾發(fā)揮重要作用。由于紙電泳時(shí)間

53、長，分辨率較差，近年來逐漸為其他快速、簡便、分辨率高的電泳技術(shù)所代替。三、醋酸纖維薄膜電泳采用醋酸纖維薄膜作業(yè)支持物的電泳方法，稱為醋酸纖維薄膜電泳。醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。將它溶于有機(jī)溶劑（如丙酮、氯信、氯乙烯、乙酸、乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜，干燥后就成為醋酸纖維薄膜?，F(xiàn)有國產(chǎn)醋酸纖維薄膜成品出售。醋酸纖維薄膜具有泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120m，有很強(qiáng)的通透性，對分子移動阻力很小。醋酸纖維膜電泳是近年來推廣的一種新技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)、生化產(chǎn)品分析和臨床化驗(yàn)，如血清蛋白、血紅蛋白，球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白，類固醇、同工酶等的分離和鑒定，這種方

54、法具有簡單、快速、樣品量少、區(qū)帶清晰、靈敏度高、便于照相和保存等特點(diǎn)。它的分辨力雖然比不上淀粉和聚丙烯酰胺凝膠電泳，但是比紙電泳要強(qiáng)得多，所以現(xiàn)在趨向用醋酸纖維薄膜電泳代替紙電泳。四、瓊脂凝膠電泳在凝膠電泳中，瓊脂凝膠電泳是最早得到廣泛應(yīng)用的。因?yàn)樗哂邢铝袃?yōu)點(diǎn)：在瓊脂凝膠中含有瓊脂1%1.5%，其余都是水，在這種凝膠中電泳，近似自由界面電泳，可是樣品擴(kuò)散又比自由界面電泳??；瓊脂凝膠電泳支持物均勻，電泳區(qū)帶整齊，分辨率高，重復(fù)性好；液相與固相界面無明顯界限，電泳速度快；瓊脂凝膠透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀測定；區(qū)帶容易染色，樣品容易洗脫，利于制備；干膜可以長期保存。除以上的優(yōu)點(diǎn)外，

55、瓊脂凝膠電泳也有它的不足之處，因?yàn)榄傊且环N強(qiáng)酸性物質(zhì)，能造成嚴(yán)重的電滲現(xiàn)象，影響電泳的速度，而且瓊脂所含可溶性雜質(zhì)難于除去。瓊脂凝膠電泳肺癆板式和柱式兩種，一般采用平板式。其實(shí)驗(yàn)步驟如下：1、配置緩沖溶液 瓊脂凝膠電泳常用緩沖溶液的pH值多在69之間，離子強(qiáng)度為0.020.05。離子強(qiáng)度過高時(shí)，由于大量電流通過瓊脂板將產(chǎn)生熱量，使板中水分大量蒸發(fā)而析出鹽的結(jié)晶，甚至使用瓊脂板斷裂，電流中斷。常用的緩沖溶液，有硼酸鹽緩沖液和巴比妥緩沖液。2、制板 制板常用的瓊脂濃度為1%1.5%。因?yàn)橛眠@個(gè)濃度制成的凝膠富有彈性、堅(jiān)固不脆。將一定兩的瓊脂用水浴加熱熔化，趁熱與等體積預(yù)熱至60的緩沖液混合，使其

56、濃度為1%1.5%，繼續(xù)加熱至表面無氣泡，迅速將凝膠倒在水平玻璃板上，使其厚度約為3mm，冷卻后即成瓊脂板（注意這里所用緩沖液的離子強(qiáng)度必須比電泳時(shí)的離子強(qiáng)度高1倍）。3、點(diǎn)樣 加樣方法二：一是挖槽法，在瓊脂板的中央挖一長方形小槽，將在水浴上熔化至4245的瓊脂與樣品等量混合，倒入小槽中，也可直接將樣品倒入小槽中；另一種是濾紙插入法，在瓊脂板上適當(dāng)?shù)奈恢糜玫镀幸涣芽p，插入蘸有樣品的厚濾紙片，紙片的寬度與瓊脂板厚度一致。樣品濃度一般以4%5%為宜。4、電泳 加樣完畢后，將瓊脂板輕輕放在電泳槽上，兩端用幾層濾紙與電極槽緩沖液連接。接通電源，調(diào)節(jié)電壓。一般電場強(qiáng)度為6V/cm。5、固定和染色 將電泳后的瓊脂板浸入70%酒精配