實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1、學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法一般用分光光度法測(cè)物質(zhì)的含量，先要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出所測(cè)物質(zhì)的含量?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍(lán)G250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beers law）。此染料與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘結(jié)合，通過(guò)測(cè)定595nm吸光度可測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。另外，反應(yīng)體系中呈現(xiàn)的顏色變化主要是G-250分子間疏水

2、相互作用形成的聚集體聚集程度不同引起的。單體形式表現(xiàn)為藍(lán)色，單體和聚集體共存時(shí)表現(xiàn)為綠色，全為聚集體形式呈現(xiàn)為棕紅色。影響因素主要為溶液體系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個(gè)很快的過(guò)程，約2min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來(lái)。（一）試劑1. 考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G250 100mg溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1000mL,濾紙過(guò)濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：純的牛血清

3、血蛋白(BSA)，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。（二）器材721型分光光度計(jì)、移液管（1mL，5mL）、試管及試管架試管編號(hào)0123451mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白（mL）00.20.40.60.810.15mol/L NaCl （mL）10.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)試劑 （mL）555555充分搖勻，20min內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照,在595nm測(cè)定A595nm以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)（六個(gè)點(diǎn)為200g、400 g、600g、800 g、1000 g），在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1. 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線查出回

4、歸方程。2. 用Excel作圖，測(cè)出回歸線性方程。即A595nm=aX。相關(guān)系數(shù)一般大于0.9。3. 未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定：測(cè)定方法同上，取合適體積的未知樣品(奶粉，1g奶粉溶于30mL 0.15mol/L NaCl，3000rpm離心5分鐘，取上清待用 )，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)（01000g），根據(jù)所測(cè)定的A595nm，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程求出相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的量（g），從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。一般被測(cè)樣品的A595nm值在0.10.5之間，所以上述樣品如果A595nm值太大，可以減少取樣量，如果仍然很大，可以定量稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。（一）蛋白質(zhì)與考馬斯

5、亮藍(lán)G-250結(jié)合的反應(yīng)十分迅速，在2min左右反應(yīng)達(dá)到平衡；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)基本穩(wěn)定。如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的520min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。（二）測(cè)定中，蛋白染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，實(shí)驗(yàn)證明此復(fù)合物的吸附量是可以忽略的。測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。1Bradford法由于染色方法簡(jiǎn)單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。2有些陽(yáng)離子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物質(zhì)不干擾測(cè)定，但大量的去污劑如TritonX-100、SDS等嚴(yán)重干擾測(cè)定。3測(cè)定時(shí)僅使用一套比色杯（2個(gè)），并從低濃度到高濃度依次測(cè)定。中間不要用蒸餾水潤(rùn)洗比色杯，僅用待測(cè)液潤(rùn)洗23次即可。另外，還要注意，玻璃儀器要