分子生物學第六章：DNA損傷與修復

1、1 第六章第六章 湯湯 立立 軍軍中南大學生物科學與技術學院中南大學生物科學與技術學院分子生物學研究中心分子生物學研究中心2哺乳動物細胞哺乳動物細胞DNA損傷的發(fā)生頻率損傷的發(fā)生頻率345自發(fā)性自發(fā)性復制錯誤復制錯誤堿基脫落或部分脫落堿基脫落或部分脫落活性氧族活性氧族物理因素物理因素紫外線紫外線電離輻射電離輻射化學因素化學因素烷化劑烷化劑堿基類似物堿基類似物修飾劑修飾劑DNA第一節(jié)第一節(jié) DNA損傷的原因及后果損傷的原因及后果病原生物基因的整合病原生物基因的整合6一、一、DNADNA分子的自發(fā)性損傷分子的自發(fā)性損傷( (一一)DNA)DNA復制產(chǎn)生誤差復制產(chǎn)生誤差大腸桿菌中大腸桿菌中DNADN

2、A復制為例：復制為例： 堿基配對的錯誤率為堿基配對的錯誤率為1010-1-11010-2-2復制后經(jīng)校正系統(tǒng)校正，錯配率為復制后經(jīng)校正系統(tǒng)校正，錯配率為1010-9-9左右左右7（二）（二）DNADNA的自發(fā)性化學變化的自發(fā)性化學變化 1. 1. 堿基的異構互變堿基的異構互變 DNA DNA分子中的分子中的4 4種堿基各自的異構體間種堿基各自的異構體間都可以自發(fā)地相互變化都可以自發(fā)地相互變化( (例如酮式例如酮式- -烯醇式烯醇式或氨基或氨基- -亞氨基之間的結構互變亞氨基之間的結構互變) )，使配對，使配對堿基間的氫鍵改變。堿基間的氫鍵改變。8堿基的互變異構效應堿基的互變異構效應 堿基堿基T

3、 T和和G G能夠以酮式或烯醇能夠以酮式或烯醇式兩種互變異構的狀態(tài)出現(xiàn)式兩種互變異構的狀態(tài)出現(xiàn)堿基堿基C C和和A A能夠以氨基式或亞氨能夠以氨基式或亞氨基式兩種互變狀態(tài)出現(xiàn)基式兩種互變狀態(tài)出現(xiàn) 一般生理條件下，堿基互變一般生理條件下，堿基互變平衡反應傾向于酮式或氨基式，平衡反應傾向于酮式或氨基式，故故A TA T和和C GC G堿基配對堿基配對 9互變異構效應引起不正常的堿基配對互變異構效應引起不正常的堿基配對 堿基堿基T T以稀有的烯醇式形以稀有的烯醇式形式，新合成鏈中式，新合成鏈中T T對應的對應的不再是不再是A A，而是，而是G G 堿基堿基C C以稀有的亞氨基形以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)

4、，在式出現(xiàn)，在DNADNA復制到達復制到達這一位置的瞬間，則它這一位置的瞬間，則它對應的不是對應的不是G G，而是，而是A A10 2. 2. 堿基的脫氨基作用堿基的脫氨基作用 堿基的環(huán)外氨基有時堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會自發(fā)脫落，從而胞嘧啶(C)(C)變成尿嘧啶變成尿嘧啶(U)(U)，腺嘌，腺嘌呤呤(A)(A)變成次黃嘌呤變成次黃嘌呤(H)(H)、鳥嘌呤（鳥嘌呤（G G）變成黃嘌呤）變成黃嘌呤(X)(X)等。復制時等。復制時U U與與A A配對、配對、H H和和X X都與都與C C配對就會導致子代配對就會導致子代DNADNA序列的錯誤變化。序列的錯誤變化。11 3 3脫嘌呤與

5、脫嘧啶脫嘌呤與脫嘧啶 即堿基脫落，是即堿基脫落，是指從指從DNADNA上丟失了嘌呤上丟失了嘌呤或嘧啶，形成無堿基或嘧啶，形成無堿基位點，稱為位點，稱為APAP部位部位（apurineapurine, , apyrimidineapyrimidine site, site, APAP）。）。12u復制時可以插入任何核苷酸。復制時可以插入任何核苷酸。u脫落堿基后的脫氧核糖脫落堿基后的脫氧核糖3 3端的磷酸二酯端的磷酸二酯鍵易被水解，造成鍵易被水解，造成DNADNA鏈斷裂。鏈斷裂。u在哺乳動物細胞基因組中，每天每個細在哺乳動物細胞基因組中，每天每個細胞因胞因N-N-糖苷鍵自發(fā)水解約丟失糖苷鍵自發(fā)水解

6、約丟失10 00010 000個個嘌呤堿基和嘌呤堿基和200200個嘧啶堿基。個嘧啶堿基。13 細胞在正常生理活動中產(chǎn)生的活性氧細胞在正常生理活動中產(chǎn)生的活性氧會造成會造成DNADNA損傷，產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥損傷，產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可引起甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可引起DNADNA單單鏈斷裂等損傷。每個哺乳類細胞每天鏈斷裂等損傷。每個哺乳類細胞每天DNADNA單單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為五萬次。鏈斷裂發(fā)生的頻率約為五萬次。4 4堿基修飾與鏈斷裂堿基修飾與鏈斷裂145.5.環(huán)出效應環(huán)出效應15二、物理因素引起的二、物理因素引起的DNADNA損傷損傷( (一一) )紫

7、外線照射引起的紫外線照射引起的DNADNA損傷損傷 當當DNADNA受到最易被其吸收波長受到最易被其吸收波長( (260 nm)260 nm)的紫外線的紫外線照射時，同一條照射時，同一條DNADNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體，相鄰的兩個體，相鄰的兩個T T、或兩個、或兩個C C、或、或C C與與T T間都可以環(huán)丁基間都可以環(huán)丁基環(huán)環(huán)( (cyclobutanecyclobutane ring) ring)連成二聚體，其中最容易形成連成二聚體，其中最容易形成的是的是T-TT-T二聚體。二聚體導致復制不能進行。二聚體。二聚體導致復制不能進行。 1617 O O

8、UV O O H CH3 H CH3 H CH3 CH3 H N N N N O N H O N H O N H H N O Thymine Thymine Thymine dimer O O 4 5 4 5 3 6 6 2 1 Fig. 21- Production of thymine dimer by ultraviolet light irradiation. 18 皮膚因受紫外線照射而形成二聚體的頻率皮膚因受紫外線照射而形成二聚體的頻率可達每小時可達每小時5 510104 4細胞，紫外線不能穿透皮細胞，紫外線不能穿透皮膚，因此損傷只局限在皮膚中。此外，紫外線膚，因此損傷只局限在皮膚中

9、。此外，紫外線照射還能引起照射還能引起DNADNA鏈斷裂等損傷。鏈斷裂等損傷。19u 電離輻射損傷電離輻射損傷DNADNA有直接和間接的效應，有直接和間接的效應，u 直接效應是直接效應是DNADNA直接吸收射線能量而遭損傷；直接吸收射線能量而遭損傷；u 間接效應是指間接效應是指DNADNA周圍其他分子周圍其他分子( (主要是水主要是水分子分子) )吸收射線能量而產(chǎn)生具有很高反應活性吸收射線能量而產(chǎn)生具有很高反應活性的自由基，進而損傷的自由基，進而損傷DNADNA。( (二二) ) 電離輻射引起的電離輻射引起的DNADNA損傷損傷20電離輻射引起電離輻射引起DNADNA損傷的機理損傷的機理21電

10、離輻射引起電離輻射引起DNADNA損傷的機制損傷的機制u自由基損害自由基損害u損傷損傷DNADNA修復系統(tǒng)修復系統(tǒng)u MCIMCI假說假說(mobile charge interaction) (mobile charge interaction) 直接與直接與DNADNA分子鏈發(fā)生作用，作用的靶分子鏈發(fā)生作用，作用的靶 點是點是DNADNA分子中移動的電子。分子中移動的電子。 22電離輻射引起電離輻射引起DNADNA損傷的類型損傷的類型u產(chǎn)生產(chǎn)生OHOH自由基，導致堿基變化自由基，導致堿基變化u 脫氧核糖分解脫氧核糖分解u DNA鏈斷裂鏈斷裂u 交聯(lián)交聯(lián) 包括包括DNA鏈交聯(lián)和鏈交聯(lián)和DNA

11、-蛋白質交聯(lián)蛋白質交聯(lián) 23DNADNA鏈的斷裂鏈的斷裂24三、化學因素引起的三、化學因素引起的DNADNA損傷損傷( (一一) )烷化劑對烷化劑對DNADNA的損傷的損傷烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物大分子的親核位點起反應，使物大分子的親核位點起反應，使DNADNA發(fā)生各種類型發(fā)生各種類型的損傷。的損傷。1 1堿基烷基化堿基烷基化烷化劑很容易將烷基加到烷化劑很容易將烷基加到DNADNA鏈中嘌呤或嘧啶鏈中嘌呤或嘧啶的的N N或或O O上上, , 烷基化的嘌呤堿基配對會發(fā)生變化。烷基化的嘌呤堿基配對會發(fā)生變化。25鳥嘌呤鳥嘌呤胞嘧啶胞嘧啶O6-乙基

12、鳥嘌呤乙基鳥嘌呤 胸腺嘧啶胸腺嘧啶堿基烷基化堿基烷基化26( (一一) )烷化劑對烷化劑對DNADNA的損傷的損傷 2. 2.堿基脫落堿基脫落 烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成落形成D DNANA上的無堿基位點，復制時可以上的無堿基位點，復制時可以插插入入任何核苷酸，造成序列的改變。任何核苷酸，造成序列的改變。27( (一一) )烷化劑對烷化劑對DNADNA的損傷的損傷 3 3斷鏈斷鏈 DNA DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷基化，結果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，烷基化，結果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發(fā)生水解，使易在

13、糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNADNA鏈斷裂。鏈斷裂。28( (一一) )烷化劑對烷化劑對DNADNA的損傷的損傷4. 4. 交聯(lián)交聯(lián)烷化劑有兩類，烷化劑有兩類，u一類是單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能一類是單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個位點烷基化；使一個位點烷基化；u另一類是雙功能基烷化劑，如化學武器氮芥、硫另一類是雙功能基烷化劑，如化學武器氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個功能基可同時使兩個位點烷基化。兩個功能基可同時

14、使兩個位點烷基化。29( (二二) )堿基類似物、修飾劑對堿基類似物、修飾劑對DNADNA的損傷的損傷 人工合成的堿基類似物如人工合成的堿基類似物如5-5-溴尿嘧啶、溴尿嘧啶、5-5-氟尿嘧氟尿嘧啶、啶、2-2-氨基腺嘌呤等，其結構與正常堿基相似，進入氨基腺嘌呤等，其結構與正常堿基相似，進入細胞能替代正常堿基摻入到細胞能替代正常堿基摻入到DNADNA鏈中而干擾鏈中而干擾DNADNA復制。復制。例如例如5-溴尿嘧啶的結構與胸腺嘧啶十分相近。溴尿嘧啶的結構與胸腺嘧啶十分相近。30u 5-BrdU 5-BrdU （ 5-BrdU-A-A； 5-BrdU-G-G） 酮式酮式 烯醇式烯醇式 堿基類似物、

15、修飾劑對堿基類似物、修飾劑對DNADNA的改變的改變u 亞硝酸鹽能使亞硝酸鹽能使C脫氨基變成脫氨基變成U （CUCU）u 羥胺能使羥胺能使T脫甲基脫甲基變成變成C （TCTC）u 黃曲霉素黃曲霉素B B （攻擊堿基）（攻擊堿基）31DNA DNA 損傷類型損傷類型u 堿基脫落堿基脫落u堿基修飾堿基修飾 & & 去氨基化去氨基化u鏈內交聯(lián)鏈內交聯(lián)uDNA-DNA-蛋白質蛋白質 交聯(lián)交聯(lián)uDNADNA鏈斷裂鏈斷裂u DNA DNA 重組重組32四、四、DNADNA損傷的后果損傷的后果 DNADNA損傷后分子最終改變，有以下幾種類型：損傷后分子最終改變，有以下幾種類型：1. 1. 點突變點突變(po

16、int mutation) DNA(point mutation) DNA鏈上單一堿基的鏈上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤變異。嘌呤替代嘌呤(A(A與與G G之間的相互替代之間的相互替代) )、嘧啶、嘧啶替代嘧啶替代嘧啶(C(C與與T T之間的替代之間的替代) )稱為轉換稱為轉換(transition)(transition)；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換( (transvertiontransvertion) )。2. 2. 缺失缺失(deletion) DNA(deletion) DNA鏈上一個或一段核苷酸消失。鏈上一個或一段核苷酸消失。333. 3.

17、插入插入(insertion)(insertion)指一個或一段核苷酸插入指一個或一段核苷酸插入DNADNA鏈鏈。 4. 4. 倒位或轉位倒位或轉位(transposition) (transposition) 指指DNADNA鏈重組使其中鏈重組使其中 一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。5. DNA5. DNA斷裂斷裂3435突變或誘變對生物可能產(chǎn)生突變或誘變對生物可能產(chǎn)生4 4種后果：種后果：致死性;喪失某些功能;改變基因型(genotype)而不改變表現(xiàn)型(phenotype);發(fā)生有利于物種生存的結果,使生物進化。 36第二節(jié)第二節(jié)

18、DNADNA修復修復DNADNA的修復主要類型的修復主要類型: : 錯配修復錯配修復 直接修復直接修復 切除修復切除修復 重組修復重組修復 跨損傷修復跨損傷修復 (SOS(SOS修復修復) )37一、錯配修復一、錯配修復 在在DNA復制過程中復制過程中, DNA聚合酶能夠利用聚合酶能夠利用其其3一一5外切核酸酶活性去除錯配核苷酸，但是外切核酸酶活性去除錯配核苷酸，但是這種校正作用并不十分可靠這種校正作用并不十分可靠, 某些錯配核苷酸可某些錯配核苷酸可能逃避檢測能逃避檢測, 出現(xiàn)于新合成的出現(xiàn)于新合成的DNA鏈中。鏈中。 錯配錯配修復系統(tǒng)能夠發(fā)現(xiàn)和修復這些錯配核苷酸。修復系統(tǒng)能夠發(fā)現(xiàn)和修復這些錯

19、配核苷酸。38 1. 1. E.coliE.coli錯配修復機制錯配修復機制DNADNA腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶(m(m6 6A A甲基化酶甲基化酶) )解旋酶解旋酶 HelicaseHelicase 、SSBSSB、外切核酸酶、外切核酸酶 (、X X和和RecJRecJ) )、DNA polymerase DNA polymerase 、連接酶、連接酶MCE (mismatch correct enzyme)mut L 激活內切核酸酶激活內切核酸酶mutHmutH mut S 掃描新生鏈中錯配堿基掃描新生鏈中錯配堿基mut H 識別非甲基化識別非甲基化DNADNA鏈鏈; ; 酶切含錯配堿

20、酶切含錯配堿基的基的DNADNA區(qū)段區(qū)段錯配修復系統(tǒng)組成（錯配修復系統(tǒng)組成（Mismatch repair systemMismatch repair system）39錯配修復錯配修復 40錯配修復錯配修復(大腸桿菌)Mis-paired bases41錯配修復(大腸桿菌)422. 2. 真核細胞錯配修復機制真核細胞錯配修復機制434445錯配修復錯配修復 ( (人人) )46二、直接修復二、直接修復1. DNA1. DNA斷裂口直接修復斷裂口直接修復在在 DNA 5 -P 端和端和 3 -OH端未受損傷的情端未受損傷的情況下，連接酶能夠直接修復況下，連接酶能夠直接修復DNA的斷裂口。的斷裂

21、口。472. 2. 光復合酶直接修復二聚體光復合酶直接修復二聚體483.3. 直接修復烷基化堿基直接修復烷基化堿基 O O6 6- -甲基鳥嘌呤甲基轉移酶。甲基鳥嘌呤甲基轉移酶。 甲基從甲基從DNADNA轉移至烷基轉移酶上轉移至烷基轉移酶上, ,已經(jīng)甲基化已經(jīng)甲基化的酶不能再轉變?yōu)榉羌谆傅拿覆荒茉俎D變?yōu)榉羌谆? ,因此因此, ,此種修復又此種修復又稱為該酶的自殺性修復。稱為該酶的自殺性修復。49DNADNA鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點，能被鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點，能被DNADNA嘌呤插入酶嘌呤插入酶( (insertaseinsertase) )識別結合，并在識別結合，并在K K

22、 存在下催化游離的嘌呤堿基或脫氧核苷與存在下催化游離的嘌呤堿基或脫氧核苷與DNADNA無嘌呤部位形成糖苷鍵。且催化插入的堿基有無嘌呤部位形成糖苷鍵。且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴格配對，高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴格配對，使使DNADNA完全恢復。完全恢復。4 4直接插入嘌呤直接插入嘌呤50三、堿基切除修復堿基切除修復（Base Excision RepairBase Excision Repair，BERBER）u指切除和替換由內源性化學物作用產(chǎn)生的指切除和替換由內源性化學物作用產(chǎn)生的 DNA DNA堿基損傷堿基損傷, , 是切除修復的一種。是切除修復的一種。u受損堿

23、基移除是由多個酶來完成的。受損堿基移除是由多個酶來完成的。u主要針對主要針對DNADNA單鏈斷裂和小的堿基改變單鏈斷裂和小的堿基改變 及氧化性損傷。及氧化性損傷。515253堿基切除修復（人）堿基切除修復（人）54 四、核苷酸切除修復四、核苷酸切除修復（nucleotide excision repair） u 體內識別體內識別 DNA DNA 損傷最多的修復通路。損傷最多的修復通路。u 不識別任何特殊的堿基損失，而是識不識別任何特殊的堿基損失，而是識別雙螺旋形狀的改變；修復時切除含有損別雙螺旋形狀的改變；修復時切除含有損傷堿基的那一段傷堿基的那一段 DNADNA。555657核苷酸切除修復核

24、苷酸切除修復 ( (大腸桿菌大腸桿菌) )UvrA:識別損傷識別損傷部位部位UvrB:解旋雙鏈解旋雙鏈紫外線誘導紫外線誘導uvrAuvrA、uvrBuvrB、uvrCuvrC和和uvrDuvrD四種基因表達四種基因表達58UvrCUvrC: : 5 5末端內切末端內切UvrBUvrB: : 3 3末端內切末端內切59UvrD:解解旋酶旋酶6061核苷酸切除修復核苷酸切除修復 ( (基因組修復基因組修復人人) )62核苷酸切除修復核苷酸切除修復 ( (轉錄偶聯(lián)修復轉錄偶聯(lián)修復 - -人類人類) )63GGR 和和TCR的共同修復通路的共同修復通路6465五、重組修復五、重組修復大腸桿菌重組修復大

25、腸桿菌重組修復66五、重組修復五、重組修復根據(jù)根據(jù) DNA 末端連接需要的同源性分為末端連接需要的同源性分為:u同源重組：需要多種蛋白參與同源重組：需要多種蛋白參與, ,在減數(shù)分裂、細胞在減數(shù)分裂、細胞有絲分裂后期有絲分裂后期S/G2S/G2期起主要作用。期起主要作用。u非同源末端連接：非同源末端連接：DNADNA分子之間不需要廣泛的同源分子之間不需要廣泛的同源性，主要是在免疫球蛋白重組時對性，主要是在免疫球蛋白重組時對DNADNA雙鏈進行連接，雙鏈進行連接，在細胞有絲分裂在細胞有絲分裂G1/G0G1/G0期起主要作用。期起主要作用。67同源重組修復DNA雙鏈斷裂（人）68非同源末端連接修復DSB69六、六、 SOS修復修復 u正在復制的正在復制的DNADNA聚合酶可能遇到尚未修復的聚合酶可能遇到尚未修復的DNADNA損傷，例如胸腺嘧啶二聚體或無嘌呤位損傷，例如胸腺嘧啶二聚體或無嘌呤位點，復制體必須設法跨越損傷進行復制，點，復制體必須設法跨越損傷進行復制，或者被迫暫停復制。即使細胞不能修復這或者被迫暫停復制。即使細胞不能修復這些損傷，自動防故障系統(tǒng)能夠使復制體繞些損傷，自動防故障系統(tǒng)能