第五章 工業(yè)微生物誘變育種誘變劑

1、LOGO第五章第五章 工業(yè)微生物工業(yè)微生物 誘變育種誘變誘變育種誘變劑劑Company Logo本章內(nèi)容本章內(nèi)容微生物育種誘變劑微生物育種誘變劑微生物的誘變育種微生物的誘變育種Company Logo誘變劑誘變劑是指那些能誘發(fā)基因突變、并使是指那些能誘發(fā)基因突變、并使突變率突變率提高到超過(guò)自發(fā)突變水平的物理或提高到超過(guò)自發(fā)突變水平的物理或化學(xué)因子?；瘜W(xué)因子。 物理誘變劑物理誘變劑 種類(lèi)種類(lèi) 化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑 生物誘變劑生物誘變劑第一節(jié)第一節(jié) 微生物育種誘變劑微生物育種誘變劑Company LogoCompany Logo誘變育種的特點(diǎn)誘變育種的特點(diǎn)（1 1）提高突變率、擴(kuò)大突變譜。）提高突

2、變率、擴(kuò)大突變譜。 （2 2）改良單一性狀比較有效，同時(shí)改良多）改良單一性狀比較有效，同時(shí)改良多 個(gè)性狀較困難個(gè)性狀較困難. . （3 3）性狀穩(wěn)定快，育種年限短。）性狀穩(wěn)定快，育種年限短。（4 4）誘發(fā)突變的方向和性質(zhì)尚難掌握。）誘發(fā)突變的方向和性質(zhì)尚難掌握。Company Logo一、物理誘變劑一、物理誘變劑包括包括紫外光紫外光、x x射線(xiàn)、射線(xiàn)、射線(xiàn)、快中子、射線(xiàn)、快中子、射線(xiàn)、射線(xiàn)、射線(xiàn)和超聲波射線(xiàn)和超聲波等。其中紫外光沿用最廣，誘變等。其中紫外光沿用最廣，誘變抗生素高產(chǎn)突變株有很優(yōu)異的效果?？股馗弋a(chǎn)突變株有很優(yōu)異的效果。 非電離輻射：電子級(jí)能提高，但不產(chǎn)生離子。非電離輻射：電子級(jí)能

3、提高，但不產(chǎn)生離子。 電離輻射電離輻射: :能擊中電子并產(chǎn)生正離子能擊中電子并產(chǎn)生正離子物理誘變主要是由于物理誘變主要是由于高能輻射導(dǎo)高能輻射導(dǎo)致生物系統(tǒng)損傷，致生物系統(tǒng)損傷，繼而發(fā)生遺傳變異的一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)過(guò)程。繼而發(fā)生遺傳變異的一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)過(guò)程。?？梢苑譃槌？梢苑譃槲锢?、物理物理、物理- -化學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)化學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)階段階段(p35)(p35)。Company Logo（一）物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng)（一）物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng)直接作用直接作用間接作用間接作用擊中擊中DNA或其它生物結(jié)構(gòu)引起的能量吸收或其它生物結(jié)構(gòu)引起的能量吸收環(huán)境中其它分子環(huán)境中其它分子激發(fā)和電離分子

4、激發(fā)和電離分子激發(fā)和電離分子激發(fā)和電離分子重排重排重排重排原初損傷原初損傷擴(kuò)散自由基擴(kuò)散自由基分子的變化分子的變化代謝代謝代謝代謝突變突變體突變體生物變化生物變化細(xì)胞死亡細(xì)胞死亡物理物理物理物理- -化學(xué)化學(xué)化學(xué)化學(xué)生物學(xué)生物學(xué)Company Logo1 1、物理階段、物理階段 持續(xù)時(shí)間極短（持續(xù)時(shí)間極短（1010-5-51010-8-8秒）。電離輻射產(chǎn)生能秒）。電離輻射產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，在體內(nèi)形成電離效應(yīng)。量轉(zhuǎn)移，在體內(nèi)形成電離效應(yīng)。2 2、化學(xué)階段、化學(xué)階段 持續(xù)時(shí)間極短（持續(xù)時(shí)間極短（1010-5-51010-8-8秒）秒） 。形成大量的自。形成大量的自由基。由基。3 3、生物化學(xué)階段、生物

5、化學(xué)階段持續(xù)時(shí)間短（持續(xù)時(shí)間短（10101010-2-2秒）秒） 。大量的自由基與生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成大大量的自由基與生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成大量的烷化自由基量的烷化自由基(R.)(R.)，將輻射效應(yīng)轉(zhuǎn)移到生物大分，將輻射效應(yīng)轉(zhuǎn)移到生物大分子中。子中。烷化自由基持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，并可通過(guò)繁殖傳遞。烷化自由基持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，并可通過(guò)繁殖傳遞。Company Logo4 4、生物學(xué)階段、生物學(xué)階段持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)（甚至幾個(gè)世代）持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)（甚至幾個(gè)世代）, ,并可通過(guò)繁殖傳遞。并可通過(guò)繁殖傳遞。烷化自由基烷化自由基(R.)(R.)與生物大分子發(fā)生一系列反應(yīng)，引與生物大分子發(fā)生一系列反應(yīng)，引起生理和遺傳

6、損傷。起生理和遺傳損傷。4.1 4.1 形態(tài)方面的表現(xiàn)形態(tài)方面的表現(xiàn)損傷損傷：造成死亡，死亡率與輻射劑量成正比造成死亡，死亡率與輻射劑量成正比生長(zhǎng)生長(zhǎng)：抑制生長(zhǎng)等，與輻射劑量成正比抑制生長(zhǎng)等，與輻射劑量成正比形態(tài)變異形態(tài)變異：菌落（體）、色澤大小變化。菌落（體）、色澤大小變化。生理變異生理變異：不能遺傳，逐漸消失。不能遺傳，逐漸消失。遺傳變異遺傳變異：能遺傳能遺傳Company Logo4.2 4.2 生理方面的表現(xiàn)生理方面的表現(xiàn)生理方面的表現(xiàn)生理方面的表現(xiàn)酶活性的變化酶活性的變化PODPOD（過(guò)氧化物酶）、（過(guò)氧化物酶）、 SOD SOD 、CAT CAT （過(guò)氧（過(guò)氧化氫酶）、核酸酶化氫酶

7、）、核酸酶相關(guān)物質(zhì)含量的變化相關(guān)物質(zhì)含量的變化蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸生長(zhǎng)素、生長(zhǎng)素、ABAABA（天然脫落酸） Company Logo4.3 4.3 遺傳方面的表現(xiàn)遺傳方面的表現(xiàn)細(xì)胞核方面的表現(xiàn)細(xì)胞核方面的表現(xiàn): :細(xì)胞核擴(kuò)大、松散（膨松細(xì)胞核擴(kuò)大、松散（膨松 puffingpuffing）微核細(xì)胞，微核細(xì)胞率與輻射劑量成正比微核細(xì)胞，微核細(xì)胞率與輻射劑量成正比微核細(xì)胞率微核細(xì)胞率是評(píng)價(jià)遺傳損傷的指標(biāo)是評(píng)價(jià)遺傳損傷的指標(biāo)染色體方面的表現(xiàn)染色體方面的表現(xiàn): :斷裂，形成染色體斷片、環(huán)、橋等。斷裂，形成染色體斷片、環(huán)、橋等。染色體畸變率與輻射劑量成正比染色體畸變率與輻射劑量

8、成正比染色體畸變率染色體畸變率是評(píng)價(jià)遺傳損傷的指標(biāo)是評(píng)價(jià)遺傳損傷的指標(biāo)Company LogoDNADNA方面的表現(xiàn)方面的表現(xiàn): :DNADNA斷裂、分解，形成單鏈結(jié)構(gòu)斷裂、分解，形成單鏈結(jié)構(gòu)DNADNA非按時(shí)合成非按時(shí)合成存在自我損傷修復(fù)機(jī)制，提前進(jìn)行存在自我損傷修復(fù)機(jī)制，提前進(jìn)行DNADNA合成，合成，進(jìn)行進(jìn)行DNADNA損傷修復(fù)損傷修復(fù)生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)促進(jìn)生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)促進(jìn)DNADNA損傷修復(fù)損傷修復(fù)咖啡因、咖啡因、EDTAEDTA等擬制等擬制DNADNA損傷修復(fù)損傷修復(fù)Company Logo菌種的遺傳背景和生理狀態(tài)；菌種的遺傳背景和生理狀態(tài)；可見(jiàn)光；可見(jiàn)光；水分；水分；電離輻射誘變劑在氧氣

9、或空氣中使用時(shí)，其輻電離輻射誘變劑在氧氣或空氣中使用時(shí)，其輻射效應(yīng)一般要比在真空中或在惰性氣體中時(shí)要射效應(yīng)一般要比在真空中或在惰性氣體中時(shí)要高；高；溫度對(duì)電離輻射效應(yīng)也有影響，主要是能改變溫度對(duì)電離輻射效應(yīng)也有影響，主要是能改變氧與自由基，或自由基相互間的作用程度。氧與自由基，或自由基相互間的作用程度。（二）影響輻射效應(yīng)的因子（二）影響輻射效應(yīng)的因子Company Logo1 1、性質(zhì)和來(lái)源、性質(zhì)和來(lái)源波長(zhǎng)在波長(zhǎng)在4040一一390nm390nm之間。之間。由于由于DNADNA分子的紫外分子的紫外光吸收值為光吸收值為260nm260nm，因而波長(zhǎng)在，因而波長(zhǎng)在200-300nm200-300n

10、m的的紫外光才有誘變作用。紫外光源一般要求為發(fā)紫外光才有誘變作用。紫外光源一般要求為發(fā)射光譜集中在射光譜集中在260nm260nm附近的紫外光燈，燈管內(nèi)附近的紫外光燈，燈管內(nèi)裝有氖氣的低壓放電燈是較理想的光源，國(guó)內(nèi)裝有氖氣的低壓放電燈是較理想的光源，國(guó)內(nèi)一般采用一般采用3030瓦的紫外光燈瓦的紫外光燈，光譜分布范圍廣，光譜分布范圍廣，誘變效率差。誘變效率差。特點(diǎn)：特點(diǎn)：能量較低；對(duì)組織穿透力強(qiáng)能量較低；對(duì)組織穿透力強(qiáng). .（三）非電離輻射（三）非電離輻射紫外線(xiàn)紫外線(xiàn)Company Logo2 2、紫外光的劑量、紫外光的劑量單位單位: :爾格能量爾格能量/mm/mm2 2( (燈具發(fā)射強(qiáng)度隨使用

11、時(shí)間延長(zhǎng)而下降燈具發(fā)射強(qiáng)度隨使用時(shí)間延長(zhǎng)而下降。) )實(shí)際應(yīng)用實(shí)際應(yīng)用- -相對(duì)劑量：相對(duì)劑量：照射時(shí)間、殺菌率照射時(shí)間、殺菌率來(lái)表示來(lái)表示O 殺菌率：殺菌率：90.0%-99.9%90.0%-99.9%O 時(shí)間：芽孢菌時(shí)間：芽孢菌10min10min； 小芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型小芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型1-3min1-3min； 一般營(yíng)養(yǎng)體一般營(yíng)養(yǎng)體3-5min3-5min； 無(wú)芽孢菌和革蘭氏陽(yáng)性菌無(wú)芽孢菌和革蘭氏陽(yáng)性菌0.5-2min0.5-2min。Company Logo3 3、誘變機(jī)理、誘變機(jī)理O 嘧啶二聚體嘧啶二聚體O DNA DNA鏈的斷裂鏈的斷裂O 胞嘧啶與尿嘧啶的水和作用胞嘧啶與尿嘧啶

12、的水和作用O DNA DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)與蛋白質(zhì)交聯(lián)Company LogoCompany LogoO 出發(fā)菌株出發(fā)菌株O 前培養(yǎng)前培養(yǎng)；培養(yǎng)基豐富營(yíng)養(yǎng)、細(xì)菌培養(yǎng)到；培養(yǎng)基豐富營(yíng)養(yǎng)、細(xì)菌培養(yǎng)到 對(duì)數(shù)期對(duì)數(shù)期、真菌孢子剛成熟；、真菌孢子剛成熟；O 制備菌懸液：制備菌懸液：處理液均用生理鹽水制處理液均用生理鹽水制 備。細(xì)菌調(diào)節(jié)菌液濃度到備。細(xì)菌調(diào)節(jié)菌液濃度到10108 8個(gè)個(gè)/ml/ml，真，真菌約為菌約為10106 610107 7 /ml/ml，放線(xiàn)菌則為，放線(xiàn)菌則為l0l07 710108 8/ml./ml.4 4、操作方法、操作方法Company LogoO 照射照射v設(shè)備：紫外燈、磁力攪

13、拌器、暗室、培養(yǎng)皿等設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室、培養(yǎng)皿等; ;v紫外燈：波長(zhǎng)為紫外燈：波長(zhǎng)為253.7253.7nm,nm,功率是功率是1515W;W;v處理時(shí)的照射距離：處理時(shí)的照射距離：2020cm 30cm;cm 30cm;v樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過(guò)樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過(guò)3 3mm,mm,照射時(shí)，要用照射時(shí)，要用磁力攪拌器攪拌。磁力攪拌器攪拌。 注意注意：操作和培養(yǎng)時(shí)必需避免可見(jiàn)光直射液面，：操作和培養(yǎng)時(shí)必需避免可見(jiàn)光直射液面，最好在黃色或紅色燈光下操作。最好在黃色或紅色燈光下操作。O 后培養(yǎng)后培養(yǎng)：1.5-21.5-2小時(shí)；小時(shí)；O 稀釋涂皿稀釋涂

14、皿Company Logo（四）、電離輻射（四）、電離輻射Company Logo（五）新型誘變劑（五）新型誘變劑v 微波微波: :電磁波電磁波v 紅外線(xiàn)：紅外線(xiàn)：0.751000m v 激光：光量子流激光：光量子流v 高能電子流：強(qiáng)電離輻射高能電子流：強(qiáng)電離輻射v 航天育種：利用返回式衛(wèi)星進(jìn)行航天育種：利用返回式衛(wèi)星進(jìn)行農(nóng)農(nóng)作物新品種作物新品種的選育的一種方法。的選育的一種方法。Company LogoCompany LogoCompany Logo6、低能離子注入過(guò)程：能量沉積、動(dòng)量傳遞、離子注入和電荷交換時(shí)間：10191013s中間時(shí)發(fā)生。特征：具有Y射線(xiàn)能量沉積引起機(jī)體損傷的；動(dòng)能交換

15、產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)損傷，表現(xiàn)為遺傳物質(zhì)原子轉(zhuǎn)移、重排或基因的缺失；慢化離子、移位原子和本底元素復(fù)合反應(yīng)造成的化學(xué)損傷以及電荷交換引起的生物分子電子轉(zhuǎn)移造成的損傷。 Company Logo常用離子：通常采用N+、H+、Ar。生物學(xué)效應(yīng)：相當(dāng)于物理和化學(xué)誘變兩者相結(jié)合的復(fù)合誘變效應(yīng)Company Logo化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑是一些能和是一些能和DNADNA起作用，改變起作用，改變其結(jié)構(gòu)，并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。其結(jié)構(gòu)，并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。 堿基類(lèi)似物堿基類(lèi)似物 烷化劑烷化劑 移碼突變劑移碼突變劑 其他類(lèi)其他類(lèi)二、化學(xué)誘變劑二、化學(xué)誘變劑種類(lèi)種類(lèi)Company Logo1 1、種類(lèi)、種類(lèi)胸胸腺腺嘧

16、嘧啶啶的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)類(lèi)類(lèi)似似物物（一）堿基類(lèi)似物（一）堿基類(lèi)似物常常用用Company Logo腺嘌呤腺嘌呤的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物常常用用Company Logo鳥(niǎo)嘌呤鳥(niǎo)嘌呤的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物Company Logo2 2、堿基類(lèi)似物作用機(jī)制、堿基類(lèi)似物作用機(jī)制5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU5-BU）是胸腺嘧啶的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物也）是胸腺嘧啶的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物也是一種強(qiáng)誘變劑。它滲入到是一種強(qiáng)誘變劑。它滲入到DNADNA中，會(huì)發(fā)生酮中，會(huì)發(fā)生酮式和烯醇式互變，不僅和原來(lái)的堿基配對(duì)而且和式和烯醇式互變，不僅和原來(lái)的堿基配對(duì)而且和其它堿基配對(duì)。其它堿基配對(duì)。Company Logo例例5-BU5-

17、BU誘發(fā)誘發(fā)A-TA-T變?yōu)樽優(yōu)镚-CG-C過(guò)程過(guò)程摻入到DNA的復(fù)制過(guò)程，堿基類(lèi)似物又成為摻入誘變劑摻入誘變劑Company Logo3 3、各種堿基類(lèi)似物的性質(zhì)和使用方法、各種堿基類(lèi)似物的性質(zhì)和使用方法 O性質(zhì)性質(zhì)5-5-溴溴( (氟氟) )尿嘧啶尿嘧啶(5-Bu(5-Bu，或，或5-Fu)5-Fu)為白色無(wú)味結(jié)晶粉為白色無(wú)味結(jié)晶粉末，末，溶于水或醇中溶于水或醇中，幾乎不溶于氯仿和乙醚，幾乎不溶于氯仿和乙醚。脫氧溴尿核苷脫氧溴尿核苷( (亦即溴脫氧尿核苷，亦即溴脫氧尿核苷，5-BudR)5-BudR)，白色白色結(jié)晶狀粉末，無(wú)臭、無(wú)味，結(jié)晶狀粉末，無(wú)臭、無(wú)味，難溶于水和甲醇難溶于水和甲醇，易

18、，易溶于堿性溶液。溶于堿性溶液。6-6-巰基嘌呤巰基嘌呤(6MP)(6MP)為黃色無(wú)臭結(jié)晶粉末，熔點(diǎn)為黃色無(wú)臭結(jié)晶粉末，熔點(diǎn)313-314(313-314(當(dāng)即分解當(dāng)即分解) )，在空氣中或見(jiàn)光會(huì)發(fā)黑變，在空氣中或見(jiàn)光會(huì)發(fā)黑變質(zhì)，質(zhì)，溶于乙醇，堿性溶液和稀硫酸，幾乎不溶于溶于乙醇，堿性溶液和稀硫酸，幾乎不溶于水、丙酮、氯仿和醚。水、丙酮、氯仿和醚。Company LogoO使用方法使用方法1 1）將待處理的細(xì)菌于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到）將待處理的細(xì)菌于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)對(duì)數(shù) 期期，離心去培養(yǎng)液。，離心去培養(yǎng)液。2 2）饑餓饑餓培養(yǎng)：生理鹽水培養(yǎng)：生理鹽水8-108-10小時(shí)小時(shí)3) 3) 把把

19、 5-Bu5-Bu或或5-Fu5-Fu（一般劑量為（一般劑量為5-300g5-300gmlml，細(xì)，細(xì)菌菌25-40 g25-40 gmlml）加到培養(yǎng)基中，做平板。）加到培養(yǎng)基中，做平板。4 4）涂皿菌體涂布在含一定濃度的堿基類(lèi)似物的培）涂皿菌體涂布在含一定濃度的堿基類(lèi)似物的培 養(yǎng)基平皿上，適溫培養(yǎng)，挑取菌落篩選。養(yǎng)基平皿上，適溫培養(yǎng)，挑取菌落篩選。Company Logo( (二二) ) 烷化劑烷化劑烷化劑是一種常見(jiàn)的誘變劑，這類(lèi)誘變劑烷化劑是一種常見(jiàn)的誘變劑，這類(lèi)誘變劑具有具有一個(gè)或多個(gè)一個(gè)或多個(gè)活性烷基，他們?nèi)菀兹〈钚酝榛?，他們?nèi)菀兹〈鶧NADNA分子中的活潑氫原子，直接和一個(gè)或分子

20、中的活潑氫原子，直接和一個(gè)或多個(gè)堿基起烷化反應(yīng)多個(gè)堿基起烷化反應(yīng)。85Company Logo1）單功能烷化劑：有一個(gè)烷化基團(tuán)，對(duì)生）單功能烷化劑：有一個(gè)烷化基團(tuán)，對(duì)生物毒性小誘變效應(yīng)大。物毒性小誘變效應(yīng)大。2）雙功能或多功能烷化劑：有兩個(gè)或多個(gè)）雙功能或多功能烷化劑：有兩個(gè)或多個(gè)烷化基團(tuán)對(duì)生物毒性大，誘變效應(yīng)小。烷化基團(tuán)對(duì)生物毒性大，誘變效應(yīng)小。1 1、烷化劑種類(lèi)、烷化劑種類(lèi)Company Logo甲基磺酸甲酯甲基磺酸甲酯 MMSSCH3OCH3OOCH3SO2 OCH3SO2 (OC2H5)2:硫酸二乙酯硫酸二乙酯DMSCompany Logo2 2、烷化劑作用機(jī)理、烷化劑作用機(jī)理EMS引

21、起堿基轉(zhuǎn)換引起堿基轉(zhuǎn)換 Company Logo一般認(rèn)為甲基化比乙基化造成能造成更多的斷裂和缺失，所以MMS的毒性大于EMS。甲基黃磺酸乙酯 EMSSCH3OC2H5OO甲基黃磺酸甲酯 MMSSCH3OCH3OO烷化劑Company Logo3 3、常用烷化劑及其使用方法、常用烷化劑及其使用方法亞硝基胍亞硝基胍（NGNG、NTGNTG）黃色結(jié)晶、性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光分解。是一種特別黃色結(jié)晶、性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光分解。是一種特別強(qiáng)的誘變劑，有強(qiáng)的誘變劑，有超誘變劑超誘變劑的稱(chēng)號(hào)。還能誘發(fā)鄰近的稱(chēng)號(hào)。還能誘發(fā)鄰近的基因同時(shí)發(fā)生突變，即的基因同時(shí)發(fā)生突變，即并發(fā)突變并發(fā)突變。且易誘發(fā)復(fù)。且易誘發(fā)復(fù)制叉附近并

22、發(fā)突變。有微弱移碼作用制叉附近并發(fā)突變。有微弱移碼作用, ,適于誘變營(yíng)適于誘變營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株養(yǎng)缺陷型突變株(10%(10%營(yíng)養(yǎng)缺陷型營(yíng)養(yǎng)缺陷型) )。CH3NNOCNHNHNO2Company LogoNTG在水溶液中隨著不同pH將產(chǎn)生不同的分解物，從而影響誘變效用.當(dāng)溶液pH低于5.5時(shí)，NTG分解成亞硝酸；當(dāng)溶液pH在8.0以上時(shí)，NTG會(huì)分解產(chǎn)生重氮甲烷，對(duì)核酸其烷化作用；當(dāng)溶液pH6.0時(shí)，NTG本身DNA其烷化反應(yīng)而導(dǎo)致突變。Company Logoa、根據(jù)處理菌體特性，選用一定范圍根據(jù)處理菌體特性，選用一定范圍pHpH值的緩沖值的緩沖液制備菌體或孢子懸液。再離心洗滌，除去培液制備

23、菌體或孢子懸液。再離心洗滌，除去培養(yǎng)液，然后用緩沖液制備孢子液。養(yǎng)液，然后用緩沖液制備孢子液。b b、NGNG試劑要保存在冰箱內(nèi)，使用時(shí)要試劑要保存在冰箱內(nèi)，使用時(shí)要特別注意特別注意安全安全 操作要在通風(fēng)柜內(nèi)，帶上橡皮手操作要在通風(fēng)柜內(nèi)，帶上橡皮手套，穿上工作服，也不得將套，穿上工作服，也不得將NGNG直接放在紙上暴直接放在紙上暴露稱(chēng)量。最好先準(zhǔn)備一只滅菌小瓶，在通風(fēng)柜露稱(chēng)量。最好先準(zhǔn)備一只滅菌小瓶，在通風(fēng)柜中用小勺取中用小勺取15-30mg15-30mg放入小瓶中稱(chēng)重放入小瓶中稱(chēng)重( (現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配) )。NGNG難溶于水，可按難溶于水，可按10mg/1ml10mg/1ml的比例加入丙酮

24、溶的比例加入丙酮溶解，再用緩沖液稀釋。解，再用緩沖液稀釋。!NGNG使用注意事項(xiàng)使用注意事項(xiàng)Company Logoc、取取0.2mlNG0.2mlNG處理液與處理液與2ml2ml孢子液混合，在一定孢子液混合，在一定溫度下處理溫度下處理n n分鐘分鐘; ;d d、用緩沖液或生理食鹽水大量稀釋或多次離心洗、用緩沖液或生理食鹽水大量稀釋或多次離心洗 滌處理后的混合液并稀釋到合適濃度，涂布平滌處理后的混合液并稀釋到合適濃度，涂布平皿，分離培養(yǎng)。皿，分離培養(yǎng)。 f f、所有接觸過(guò)、所有接觸過(guò)NGNG的器皿均須用的器皿均須用l-2Nl-2N的的NaOHNaOH液液解解毒毒處理。要浸泡過(guò)夜并在陽(yáng)光下曬。最

25、好將接觸處理。要浸泡過(guò)夜并在陽(yáng)光下曬。最好將接觸 稀濃不同的稀濃不同的NGNG液的器皿分別作解毒處理。液的器皿分別作解毒處理。Company Logo能和能和DNADNA分子結(jié)合，并造成其堿基對(duì)增多或缺分子結(jié)合，并造成其堿基對(duì)增多或缺失，從而誘發(fā)突變的化合物。包括壓吖啶類(lèi)雜失，從而誘發(fā)突變的化合物。包括壓吖啶類(lèi)雜環(huán)染料以及一些烷化劑和吖啶類(lèi)相結(jié)合的化合物，環(huán)染料以及一些烷化劑和吖啶類(lèi)相結(jié)合的化合物，總稱(chēng)為總稱(chēng)為ICRICR類(lèi)化合物類(lèi)化合物。使用方法使用方法：用：用pH7.0pH7.0磷酸緩沖液將吖啶黃配制成磷酸緩沖液將吖啶黃配制成濃度為濃度為0.2%0.2%溶液，在溶液，在2828振蕩振蕩34

26、34小時(shí)使其完小時(shí)使其完全溶解。直接加入孢子液接觸處理或加入培養(yǎng)基全溶解。直接加入孢子液接觸處理或加入培養(yǎng)基內(nèi)。如為生長(zhǎng)過(guò)程處理，平皿內(nèi)濃度一般為內(nèi)。如為生長(zhǎng)過(guò)程處理，平皿內(nèi)濃度一般為10-10-50g50gmlml的吖啶黃，處理時(shí)的吖啶黃，處理時(shí)避光操作。避光操作。( (三三) ) 移碼誘變劑移碼誘變劑Company LogoDNADNA鏈上的兩個(gè)堿基插鏈上的兩個(gè)堿基插入移碼突變劑后，兩個(gè)入移碼突變劑后，兩個(gè)堿基之間的距離變大，堿基之間的距離變大，引起堿基缺失和插入引起堿基缺失和插入Company Logo 羥胺：專(zhuān)一作用于胞嘧啶，改變了羥胺：專(zhuān)一作用于胞嘧啶，改變了DNADNA上該堿上該堿

27、基的結(jié)構(gòu)，以致在基的結(jié)構(gòu)，以致在DNADNA復(fù)制過(guò)程中，結(jié)構(gòu)改變復(fù)制過(guò)程中，結(jié)構(gòu)改變的胞嘧啶同腺嘌呤而不與鳥(niǎo)嘌呤配對(duì)，從而引起的胞嘧啶同腺嘌呤而不與鳥(niǎo)嘌呤配對(duì)，從而引起了堿基轉(zhuǎn)換了堿基轉(zhuǎn)換G G：CACA：T T。 羥胺（羥胺（NHNH2 2OHOH）（白色晶體，具有腐蝕性）和）（白色晶體，具有腐蝕性）和其它誘變劑相比，只引起其它誘變劑相比，只引起G:CG:C轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)變?yōu)锳:TA:T, ,而不引而不引起起A:TA:T轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)變?yōu)镚:CG:C。 （四） 羥胺劑Company LogoCGCGHAC*GC*ACGC*ATA羥胺和細(xì)胞內(nèi)其它物質(zhì)也能發(fā)生作用，生成羥胺和細(xì)胞內(nèi)其它物質(zhì)也能發(fā)生作用，生成

28、過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫是非專(zhuān)一性誘變劑。過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫是非專(zhuān)一性誘變劑。對(duì)于噬菌體或離體DNA，羥胺是專(zhuān)一性很強(qiáng)的誘變劑，但對(duì)細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌等微生物，誘變效果不理想Company LogoCompany Logo（五）脫氨劑（五）脫氨劑-亞硝類(lèi)誘變劑作用原理亞硝類(lèi)誘變劑作用原理作用：通過(guò)氧化脫氨基造成的。胞嘧啶作用：通過(guò)氧化脫氨基造成的。胞嘧啶(C)(C)經(jīng)氧化脫氨后成為尿嘧啶經(jīng)氧化脫氨后成為尿嘧啶(U)(U)、腺嘌、腺嘌呤呤(A)(A)經(jīng)脫氨后成為次黃嘌呤經(jīng)脫氨后成為次黃嘌呤(H)(H)，鳥(niǎo)嘌，鳥(niǎo)嘌呤呤(G)(G)脫氨成為黃嘌呤脫氨成為黃嘌呤(X)(X)。Company LogoComp

29、any LogoO使用方法使用方法 不穩(wěn)定，常用鹽類(lèi)不穩(wěn)定，常用鹽類(lèi)亞硝酸鈉亞硝酸鈉1 1、 0.1M0.1M亞硝酸鈉溶液：稱(chēng)用亞硝酸鈉溶液：稱(chēng)用0.1M0.1M醋酸緩沖液配制醋酸緩沖液配制 濃度為濃度為0.05M0.05M亞硝酸鈉溶液。亞硝酸鈉溶液。2 2、挑大腸桿菌一環(huán)于、挑大腸桿菌一環(huán)于5ml LB 5ml LB 肉湯中，肉湯中，3737培養(yǎng)培養(yǎng)14-14-1616小時(shí)。小時(shí)。3500r/min3500r/min，離心，離心5min5min。棄上清液，。棄上清液， 打勻沉淀加打勻沉淀加5ml pH4.65ml pH4.6的醋酸緩沖液，二次離心。的醋酸緩沖液，二次離心。棄上清液，加現(xiàn)配的棄

30、上清液，加現(xiàn)配的HNOHNO2 21ml1ml混勻，混勻，37 37 保溫保溫5 min5 min。3 3、5 min5 min后，涂皿（稀釋到后，涂皿（稀釋到1010-5-5）。）。 Company Logo（六）其它化學(xué)誘變劑（六）其它化學(xué)誘變劑 秋水仙堿秋水仙堿誘法細(xì)胞染色體加倍。抑制紡錘絲紡誘法細(xì)胞染色體加倍。抑制紡錘絲紡錘體的形成，在染色體復(fù)制完成后無(wú)法移向兩極。錘體的形成，在染色體復(fù)制完成后無(wú)法移向兩極。Company Logo抗生素作為誘變劑的主要抗生素有放線(xiàn)菌素、爭(zhēng)光霉素、作為誘變劑的主要抗生素有放線(xiàn)菌素、爭(zhēng)光霉素、鏈黑霉素。這些抗生素一般都是抗癌藥物。它們的鏈黑霉素。這些抗生素一般都是抗癌藥物。它們的誘變作用一般沒(méi)有烷花劑顯著，常和其它誘變劑搭誘變作用一般沒(méi)有烷花劑顯著，常和其它誘變劑搭配使用。配使用。金屬鹽類(lèi)用于誘變的金屬鹽類(lèi)有用于誘變的金屬鹽類(lèi)有LiClLiCl、硫酸錳等。其中、硫酸錳等。其中LiClLiCl比比較常用，同其它誘變劑搭配使用效果顯著。較常用，同其它誘變劑搭配使用效果顯著。