分子標記技術(shù)簡介

1、分子標記技術(shù)簡介分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記形態(tài)學(xué)標記、生物化學(xué)標記、細胞學(xué)標記相比，DNA分子標記具有的優(yōu)越性有：大多數(shù)分子標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數(shù)量幾乎是無限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆

2、等方面。分子標記的概念有廣義和狹義之分。廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。理想的分子標記必須達以下幾個要求：(1) 具有高的多態(tài)性；(2) 共顯性遺傳，即利用分子標記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；(3) 能明確辨別等位基因；(4) 遍布整個基因組；(5) 除特殊位點的標記外，要求分子標記均勻分布于整個基因組；(6) 選擇中性(即無基因多效性)；(7) 檢測手段簡單、快速(如實驗程序易自動化)；(8) 開發(fā)成本和使用成本盡量低廉；(9) 在實驗室內(nèi)和實驗室間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)。但是，目前發(fā)現(xiàn)的

3、任何一種分子標記均不能滿足以所有要求?！痉肿訕擞浀姆N類】一、基于分子雜交技術(shù)的分子標記技術(shù)此類標記技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶解及凝膠電泳分離不同的生物 DNA 分子，然后用經(jīng)標記的特異 DNA 探針與之進行雜交，通過放射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示 DNA 的多態(tài)性。限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)1974年Grodzicker等創(chuàng)立了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)，它是一種以DNADNA雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標記。RFLP基本原理：利用特定的限制性內(nèi)切酶識別并切割不同生物個體的基因組DNA，得到大小不等的D

4、NA片段，所產(chǎn)生的DNA數(shù)目和各個片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布情況。通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然后與克隆DNA探針進行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生片段在長度上差異。由于不同個體的等位基因之間堿基的替換、重排、缺失等變化導(dǎo)致限制內(nèi)切酶識別和酶切發(fā)生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。RFLP的等位基因其有共顯性特點。RFLP標記位點數(shù)量不受限制，通?？蓹z測到的基因座位數(shù)為14個。RFLP技術(shù)也存在一些缺陷，主要是克隆可表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難；另外，實驗操作較

5、繁鎖，檢測周期長，成本費用也很高。自RFLP問世以來，已經(jīng)在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、疾病的基因診斷等研究中仍得到了廣泛的應(yīng)用。數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR )數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列又稱小衛(wèi)星DNA (Minisatellite DNA)，是一種重復(fù)DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)10一10001不等。VNTR基本原理與RFLP大致相同，只是對限制性內(nèi)切酶和DNA探針有特殊要求：(1)限制性內(nèi)切酶的酶切位點必須不在重復(fù)序列中，以保證小衛(wèi)星或微衛(wèi)星序列的完整性。(2)內(nèi)切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點，則

6、可使衛(wèi)星序列所在片段含有較少無關(guān)序列，通過電泳可充分顯示不同長度重復(fù)序列片段的多態(tài)性。(3)分子雜交所用DNA探針核昔酸序列必須是小衛(wèi)星序列或微衛(wèi)星序列，通過分子雜交和放射自顯影后，就可一次性檢測到眾多小衛(wèi)星或微衛(wèi)星位點，得到個體特異性的DNA指紋圖譜。小衛(wèi)星標記的多態(tài)信息含量較高，在17一19之間。缺點是數(shù)量有限，而且在基因組上分布不均勻，這就極大限制其在基因定位中的應(yīng)用。VNTR也存在實驗操作繁瑣、檢測時間長、成本高的缺點。二、基于PCR技術(shù)的分子標記技術(shù)（一）、隨機引物的PCR標記所用引物的核苷酸序列是隨機的，其擴增的 DNA 區(qū)域事先未知。隨機引物PCR擴增的 DNA 區(qū)段產(chǎn)生多態(tài)性的

7、分子基礎(chǔ)是模板 DNA 擴增區(qū)段上引物結(jié)合位點的堿基序列的突變，不同來源的基因組在該區(qū)段上表現(xiàn)為擴增產(chǎn)物有無差異或擴增片段大小的差異。隨機引物PCR標記表現(xiàn)為顯性或共顯性。隨機擴增多態(tài)性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )RAPD技術(shù)是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技術(shù)發(fā)展的檢測DNA多態(tài)性的方法。基本原理：它是利用隨機引物（一般為810bp）通過PCR反應(yīng)非定點擴增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。擴增片段多態(tài)性便反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所使用的引物各不相同，但對任一特定引物

8、，它在基因組DNA序列上有其特定的結(jié)合位點，一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DAN片段插人、缺失或堿基突變，就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點的分布發(fā)生變化，從而導(dǎo)致擴增產(chǎn)物數(shù)量和大小發(fā)生改變，表現(xiàn)出多態(tài)性。就單一引物而言，其只能檢測基因組特定區(qū)域DNA多態(tài)性，但利用一系列引物則可使檢測區(qū)域擴大到整個基因組，因此，RAPD可用于對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測，也可用于構(gòu)建基因組指紋圖譜。與RFLP相比，RAPD具有以下優(yōu)點：(1)技術(shù)簡單，檢測速度快；(2) RAPD分析只需少量DNA樣品；(3)不依賴于種屬特異性和基因組結(jié)構(gòu)，一套引物可用于不同生物基因組分析；(4)成本較低。但RAPD也存在一些缺點：(1

9、) RAPD標記是一個顯性標記，不能鑒別雜合子和純合子；(2)存在共遷移問題，凝膠電泳只能分開不同長度DNA片段，而不能分開那些分子量相同但堿基序列組成不同的DNA片段；(3) RAPD技術(shù)中影響因素很多，所以實驗的穩(wěn)定性和重復(fù)性差。任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， APPCR)在APPCR分析中，所使用的引物較長(1050 bp) ， PCR反應(yīng)分為兩個階段，首先寡核昔酸引物在低嚴謹條件下與模板DNA退火，此時發(fā)生了一些合成，以便穩(wěn)定模板與引物之間相互作用。然后進行高嚴謹退火條件的循環(huán)，兩個位點間那些序列在低嚴謹度退

10、火條件下發(fā)生的引物延伸可繼續(xù)在高嚴謹條件下擴增。采用變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，最終反應(yīng)結(jié)果與RAPD類似。只要設(shè)計的引物在低嚴謹退火條件下能減少引物產(chǎn)生人為產(chǎn)物，應(yīng)用成對組合的引物可以產(chǎn)生新的APPC R譜帶，但引物配對組合使用時，得到的圖譜與單引物單獨使用時產(chǎn)生的圖譜之和很不相同，這樣，50個引物能產(chǎn)生1250種不同指紋圖譜。APPCR方法不需預(yù)知序列資料，而且檢測的基因組樣本是任意的，還能夠用于檢測近等基因系(或同類系)中的多態(tài)性。APPCR的缺點是每個新的多態(tài)性都必須經(jīng)純化才能進一步使用。另外，此方法在雜合體中僅可辨別長度多態(tài)性。DNA擴增指紋印跡(DNA Amplifica

11、tion Fingerprinting，DAF)DAF是一種改進的RAPD分析技術(shù)，與RAPD技術(shù)不同的是，DAF分析中所使用的引物濃度更高，長度更短(一般為5一8 bp)，因此它所提供的譜帶信息比RAPD大得多，如當使用5個核昔酸的引物時，引物和模板的組合大約可擴增出10一100個DNA片段。PCR擴增產(chǎn)物是在凝膠上進行分離，通過銀染即可產(chǎn)生非常復(fù)雜帶型。（二）、特異引物的PCR標記特異引物的PCR標記所用引物是針對已知序列的 DNA 區(qū)段而設(shè)計的，具有特定核苷酸序列（通常為 1824 bp），可在常規(guī)PCR復(fù)性溫度下進行擴增，對基因組 DNA 的特定區(qū)域進行多態(tài)性分析。序列標志位點(Seq

12、uence Tagged Sites，STS)STS是對以特定對引物序進行PCR特異擴增的一類分子標記的統(tǒng)稱。通過設(shè)計特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定結(jié)合位點結(jié)合，從而可用來擴增基因組中特定區(qū)域，分析其多態(tài)性。利用特異PCR技術(shù)的最大優(yōu)點是它產(chǎn)生信息非?？煽?，而不像RFLP和RAPD那樣存在某種模糊性。簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)簡單重復(fù)序(SSR)也稱微衛(wèi)星DNA，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1一6 bp，其中最常見是雙核昔酸重復(fù)，即(CA) n和(TG) n每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10一60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目

13、的不同。SSR標記的基本原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率。SSR具有以下一些優(yōu)點：(l)一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點；(2)微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子；(3)所需DNA量少。顯然，在采用SSR技術(shù)分析微衛(wèi)星DNA多態(tài)性時必須知道重復(fù)序列兩端的DNA序列的信息。如不能直接從DNA數(shù)據(jù)庫查尋則首先必須對其進行測序。序列特異性擴增區(qū)(Sequencecharacterized Ampli

14、fied Region，SCAR)SCAR標記是在RAPD技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。SCAR標記是將目標 RAPD 片段進行克隆并對其末端測序，根據(jù) RAPD 片段兩端序列設(shè)計特異引物，對基因 DNA 片段再進行PCR特異擴增，把與原RAPD片段相對應(yīng)的單一位點鑒別出來。SCAR標記是共顯性遺傳，待檢 DNA 間的差異可直接通過有無擴增產(chǎn)物來顯示。SCAR標記方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。單引物擴增反應(yīng)(Single Primer Amplificatipn Reawtion，SPAR)SPAR技術(shù)是與RAPD技術(shù)相似的一種標記技術(shù)，SPAR也只用一個引物，但所用

15、的引物是在SSR的基礎(chǔ)上設(shè)計的。這些引物能與SSR之間的間隔序列進行特異性結(jié)合，然后通過P(：R技術(shù)擴增SSR之間的DNA序列，凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，分析其多態(tài)性。另外，還有一種與SPAR技術(shù)非常相似的標記技術(shù)，即ISTR ( Inverse Sequencetagged Repeat)技術(shù)，ISTR所用的引物是在反向重復(fù)序列基礎(chǔ)上設(shè)計的，PCR擴增的是反向重復(fù)序列之間的DIVA序列。DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)SSCP是指等長的單鏈DNA因核昔酸序列的差異而產(chǎn)生構(gòu)象變異，在非變性聚丙烯酞胺中的表現(xiàn)為電泳遷移率

16、的差別。單鏈DNA構(gòu)象分析對DNA序列的改變非常敏感，常常一個堿基差別都能顯示出來。在SSCP分析中，利用PCR技術(shù)定點擴增基因組DNA中某一目的片段，將擴增產(chǎn)物進行變性處理，雙鏈DNA分開成單鏈，再用非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分離，根據(jù)條帶位置變化來判斷目的片段中是否存在突變。SSCP結(jié)果判定是通過多個樣品之間對比，觀察條帶之間位置改變，從而顯示出不同生物個體的DNA特異性，達到指紋分析目的。為了進一步提高SSCP的檢出率，可將SSCP分析與其它突變檢測方法相結(jié)合。其中與雜交雙鏈分析(Heterocluplex analysis，Het)法結(jié)合可以大大提高檢出率。Het法是用探針與要檢測的單鏈

17、DNA或RNA進行雜交，含有一對堿基對錯配的雜交鏈可以和完全互補的雜交鏈在非變性PAG凝膠上通過電泳被分離開。對同一靶序列分別進行SSCP和Het分析可以使點突變的檢出率接近100%，而且實驗簡便。雙脫氧化指紋法(Dideoxy Fingerprints，ddF )ddF是將雙脫氧末端終止測序法與SSCP結(jié)合起來的分析技術(shù)，對由雙脫氧末端終止的長短不一的單鏈DNA進行SSCP分析。如果目的片段存在一個突變，則所有大于某一大小對應(yīng)于突主變位置的雙脫氧終止片段無野生型系統(tǒng)，對于每一個突有多次機會檢測其遷移率改變，提高了檢測突變的效率。ddF方法克服了SSCP分析時因DNA長度影響SSCP顯示的困難

18、，通過一種雙脫氧核昔酸生產(chǎn)特異性的單鏈DNA，使其中長度合適的DNA片段顯示SSCP改變。三、基于限制性酶切和PCR技術(shù)的DNA標記擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP )AFLP是1993年荷蘭科學(xué)家Zbaeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測DN A多態(tài)性的新方法。AFLP 是 RFLP 與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其基本原理是先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組 DNA 產(chǎn)生不同大小的 DNA 片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴增反應(yīng)的模板 DNA，然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預(yù)擴增，最后在接頭互補鏈的基礎(chǔ)上添加 13個選

19、擇性核苷酸作引物對模板 DNA 基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測獲得的DNA擴增片段，根據(jù)擴增片段長度的不同檢測出多態(tài)性。引物由三部分組成：與人工接頭互補的核心堿基序列、限制性內(nèi)切酶識別序列、引物3端的選擇堿基序列（110 bp）。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個堿基序列為結(jié)合位點。該技術(shù)的獨特之處在于所用的專用引物可在知道 DNA 信息的前提下就可對酶切片段進行PCR 擴增。為使酶切濃度大小分布均勻，一般采用兩個限制性內(nèi)切酶，一個酶為多切點，另一個酶切點數(shù)較少，因而 AFLP 分析產(chǎn)生的主要是由兩個酶共同酶切的片段。AFLP 結(jié)合了 RFLP 和 RAPD兩種技術(shù)的優(yōu)點，具

20、有分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高的優(yōu)點。但它的技術(shù)費用昂貴，對 DNA 的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高。盡管 AFLP 技術(shù)誕生時間較短，但可稱之為分子標記技術(shù)的又一次重大突破，被認為是目前一種十分理想、有效的分子標記。酶切擴增多態(tài)性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS )CAPS技術(shù)又稱為PCRRFLP，它實質(zhì)上是PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)結(jié)合的一種方法。CAPS的基本原理是利用己知位點的DNA序列資源設(shè)計出一套特異性的PCR引物(1927bp），然后用這些引物擴增該位點上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得擴增產(chǎn)物，凝

21、膠電泳分離酶切片段，染色并進行RFLP分析。GAPS標記揭示的是特異PGR片段的限制性長度變異的信息。CAPS是一類共顯性分子標記，其優(yōu)點是避免了RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度。另外，由于很多限制性內(nèi)切酶均可與擴增DNA酶切，所以檢測到多態(tài)性機會較大。四、基于DNA芯片技術(shù)的分子標記技術(shù)核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)SNP標記是美國學(xué)者Lander E于1996年提出的第三代DNA遺傳標記。SNP是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，SN

22、P 標記可幫助區(qū)分兩個個體遺傳物質(zhì)的差異。人類基因組大約每 1000 bp SNP 出現(xiàn)一次，已有2000多個標記定位于人類染色體，對人類基因組學(xué)研究具有重要意義。檢測 SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技術(shù)。SNP 被稱為第三代 DNA 分子標記技術(shù)，隨著 DNA 芯片技術(shù)的發(fā)展，其有望成為最重要最有效的分子標記技?！痉肿訕擞浀膽?yīng)用領(lǐng)域】（一）、基因組作圖和基因定位研究長期以來，各種生物的遺傳圖譜幾乎都是根據(jù)諸如形態(tài)、生理和生化等常規(guī)標記來構(gòu)建的，所建成的遺傳圖譜僅限少數(shù)種類的生物，而且圖譜分辨率大多很低，圖距大，飽和度低，因而應(yīng)用價值有限。分子標記用于遺傳圖譜構(gòu)建是遺傳學(xué)領(lǐng)域的重大進展之一。隨著新的標記技術(shù)的發(fā)展，生物遺傳圖譜名單上的新成員將不斷增加，圖譜上標記的密度也將越來越高。建立起完整的高密度的分子圖譜，就可以定位感興趣的基因。（二）、基于圖譜克隆基因圖位克隆(Mapbascd cloning)是近幾年隨著分子標記遺傳圖譜的相繼建立和基因分子定位而發(fā)展起來的一種新的基因克隆技術(shù)。利用分子標記輔助的圖位克隆無需事先知道基因的序列，也不必了解基因的表達產(chǎn)物，就可以直接克隆基因。圖位克隆是最為通用的基因識別途徑，至少在理論上適