檢驗診斷試劑(免疫)

1、酶免疫測定（EIA） 分類是否對結(jié)合的酶標志物進行分離是否對結(jié)合的酶標志物進行分離酶標志物、抗原、抗體、酶免疫復(fù)合物酶標志物、抗原、抗體、酶免疫復(fù)合物是否使用固相支持物是否使用固相支持物異相酶免疫測定均相酶免疫測定酶免疫測定固相相酶免疫測定液相酶免疫測定酶標志物、抗原、抗體、酶免疫復(fù)合物酶標志物、抗原、抗體、酶免疫復(fù)合物固相酶免疫測定 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)酶標志物、抗原、抗體、酶免疫復(fù)合物酶標志物、抗原、抗體、酶免疫復(fù)合物酶標志物酶標記抗體或抗原 酶免疫技術(shù)的核心組成部分酶免疫技術(shù)的核心組成部分 酶結(jié)合物酶結(jié)合物（conjugateconjugate）酶標記物酶標記物 通過化學反應(yīng)或

2、免通過化學反應(yīng)或免疫學反應(yīng)，讓酶與疫學反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的抗體或抗原形成的結(jié)合物結(jié)合物 酶標記抗體或抗原 制備方法制備方法過碘酸鈉法（直接法）過碘酸鈉法（直接法）常用于常用于HRPHRP標記抗體或抗原標記抗體或抗原 戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法1.1.辣根過氧化物酶（辣根過氧化物酶（HRPHRP） 糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)主酶與酶活性無關(guān) 輔基是酶的活性中心輔基是酶的活性中心( (ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標記中應(yīng)用最為廣泛的標記用酶用酶 )ELISAELISA常用酶常用酶2.2.堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（APAP） 辣根過氧化物酶辣根

3、過氧化物酶HRP上的糖羥基可以被高碘上的糖羥基可以被高碘酸鈉（酸鈉（NaPIO4）激活生成醛基，這些醛基）激活生成醛基，這些醛基能通過能通過Schiff堿與蛋白中的氨基偶聯(lián)，緊接堿與蛋白中的氨基偶聯(lián)，緊接著還原著還原Schiff堿形成穩(wěn)定的偶聯(lián)產(chǎn)物。堿形成穩(wěn)定的偶聯(lián)產(chǎn)物。這種這種HRP偶聯(lián)標記方法已經(jīng)被廣泛認可，但是也偶聯(lián)標記方法已經(jīng)被廣泛認可，但是也存在一定的缺陷，特別是去除過量高碘酸鈉存在一定的缺陷，特別是去除過量高碘酸鈉（NaPIO4）的過程較為繁瑣。需要注意的）的過程較為繁瑣。需要注意的是，被高碘酸鈉（是，被高碘酸鈉（NaPIO4）激活的）激活的HRP很很不穩(wěn)定，其酶活力會在幾天內(nèi)丟失

4、不穩(wěn)定，其酶活力會在幾天內(nèi)丟失 評價均相酶免疫測定 homogenous enzyme immunoassay 用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定 酶標記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，酶標記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理原理均相酶免疫測定 最具代表性的兩種技術(shù)最具代表性的兩種技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù)EMITEMITenzyme-mu

5、tiplied immunoassay technique克隆酶供體免疫分析克隆酶供體免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 利用重組DNA技術(shù)制備-半乳糖苷酶的兩個片段：大片段稱為酶受體（enzyme acceptor,EA），小片段稱為酶供體（enzyme donor,ED），兩個片段本身均不具酶活性，但結(jié)合在一起就具有酶活性，利用這一特性建立的均相酶免疫測定稱為克隆酶供體免疫測定(CEDIA)。 CEDIA的反應(yīng)模式為競爭法?？寺∶腹w免疫測定（cloned enzyme donor immunoassay,CEDIA）一、基本原理：

6、標本中的抗原和ED標記的抗原與特異性抗體競爭結(jié)合，形成兩種抗原抗體復(fù)合物。ED標記的抗原與抗體結(jié)合后由于空間位阻，不能再與EA結(jié)合。反應(yīng)平衡后，剩余的ED標記抗原與EA結(jié)合，形成具有活性的酶，加入底物測定酶活力，酶活力的大小與標本中抗原含量呈正比。：健康人O型血或綿羊靜脈血，應(yīng)2w內(nèi)固化1.概述：以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。（斑點免疫滲濾試驗最初是從斑點ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展起來建立的，應(yīng)用的結(jié)合物是酶標記的，稱為斑點酶免疫滲濾試驗。90年代初發(fā)展了以膠體金為標記物的斑點免疫滲濾試驗（DIGFA），又名滴金免

7、疫測定法（簡稱滴金法）。在滴金法中不需酶對底物的反應(yīng)，更加簡便、快速，在臨床檢驗中應(yīng)用日漸廣泛。 ）斑點免疫滲濾試驗2.原理：以雙抗體夾心法為例。在硝酸纖維素膜的膜片中央滴加純化的抗體，為膜所吸附。當?shù)渭釉谀ど系臉吮疽后w滲濾過膜時，標本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無關(guān)蛋白等沒濾出膜片。其后加入的膠體金標記也在滲濾中與已結(jié)合在膜上的抗原相結(jié)合。因膠體金本身呈紅色，陽性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點。 3.試劑和操作 滲濾裝置滲濾裝置是滴金法測定中的主要試劑成分之一，由塑料小盒、吸水墊料和點加了抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成 塑料小盒可以是多種形狀的，盒蓋的中央有一直徑約0.40.8cm的小圓孔

8、，盒內(nèi)墊放吸水墊料，硝酸纖維素膜片安放在正對盒蓋的中央有一直徑約0.40.8cm的小圓孔，盒的墊放吸水塑料，硝酸纖維素膜片安放在正對盒的圓孔下，緊密關(guān)閉盒蓋，使硝酸纖維素膜片貼緊吸水墊料。如此即制備成一滲濾裝置（圖19-1）。塑料小盒的形狀最多見的是扁平的長方形小板，加之滴金法的整個反應(yīng)過程都是在滲濾裝置上進行的，因此又常稱滲濾裝置為滴金法反應(yīng)板。 圖19-1 DIGFA滲濾裝置及操作示意圖A：操作示意圖B:裝置分解圖斑點免疫滲濾試驗斑點免疫層析試驗 1.原理：斑點免疫層析試驗（DICA）簡稱免疫層析試驗（ICA），也以硝酸纖維素膜為載體，但利用了微孔膜的毛細血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一般 2.試劑和操作 免疫層析試驗以單克隆雙抗體夾心法為例。試驗所用試劑全部為干試劑，多個試劑被組合在一個約6mm70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條（圖19-2），試劑條上端（A）和下端（B）分別粘貼吸水材料，免疫金復(fù)合物干片粘貼在近下端（C）處，緊貼其上為硝酸纖維素膜條