抗癌藥物紫杉醇的天然提取與分離技術(shù)

1、1.紫杉醇是什么？有什么作用？ 2.紫杉醇發(fā)現(xiàn)歷程？ 3.紫杉醇怎么獲得？紫杉醇簡(jiǎn)介紫杉醇化學(xué)式：【化學(xué)名稱】 5，20-環(huán)氧-1，2，4，7，10，13-六羥基紫杉 烷-11-烯- 9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13（2R，3S）- N-苯甲酰-3-苯基異絲氨 酸酯 【分 子 式】 C47H51NO14 【分 子 量】 853.92 【物理性質(zhì)】 白色結(jié)晶體粉末。無(wú)臭，無(wú)味。不溶于水，易溶 于氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑。 純品紫杉醇外觀為白色結(jié)晶體粉末用于臨床的藥用紫杉醇一般為注射用制劑紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物, 也是目前所了解的惟一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚

2、合微管的藥物。同位素示蹤表明， 紫杉醇只結(jié)合到聚合的微管上， 不與未聚合的微管蛋白二聚體反應(yīng)。細(xì)胞接觸紫杉醇后會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累大量的微管，這些微管的積累干擾了細(xì)胞的各種功能，特別是使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細(xì)胞的正常分裂。 通過(guò)-臨床研究，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。動(dòng)物細(xì)胞的有絲分裂中心體年 代進(jìn) 展1958 NCI開(kāi)始大規(guī)模植物藥研發(fā)篩選1967 發(fā)現(xiàn)紫杉醇抗癌活性1968 從紅豆杉中分離出紫杉醇1971 完成結(jié)構(gòu)鑒定1977 發(fā)表作用機(jī)制1983 臨床試驗(yàn)1985 臨床II期1991 臨床III期1992 FDA批

3、準(zhǔn)上市紫杉醇的研發(fā)過(guò)程50年代，Hartwell 及其同事著重研究了抗癌制劑鬼臼毒素及其衍生物的應(yīng)用。同時(shí)，一系列尋找天然抗腫瘤成分的研究導(dǎo)致了像長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿及秋水仙堿等一系列具有代表性的抗癌藥物的產(chǎn)生。1971年，美國(guó)科學(xué)家Wanj及其同事從歐洲短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)中分離得到一種具有細(xì)胞毒性的新二萜類化合物，命名為紫杉醇(Taxol)，藥理實(shí)驗(yàn)證明，它具有廣譜抗癌作用，但由于其天然含量極低，故而在當(dāng)時(shí)并未引起人們的注意。19771977年，年，Horwit.ZHorwit.Z博士發(fā)現(xiàn)其抗博士發(fā)現(xiàn)其抗癌機(jī)理在于能夠與動(dòng)物細(xì)胞有絲癌機(jī)理在于能夠與動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂期

4、間產(chǎn)生的微管蛋白結(jié)合，分裂期間產(chǎn)生的微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白聚合裝配成微管二促進(jìn)微管蛋白聚合裝配成微管二聚體，從而抑制細(xì)胞中微管的正聚體，從而抑制細(xì)胞中微管的正常生理解聚，使細(xì)胞有絲分裂停常生理解聚，使細(xì)胞有絲分裂停止在止在G2G2期及期及M M期，使細(xì)胞自然凋期，使細(xì)胞自然凋亡，從而阻止了癌細(xì)胞的快速繁亡，從而阻止了癌細(xì)胞的快速繁殖殖 紫杉醇最早由太平洋紅豆杉的樹(shù)皮中分離。 38 000棵紫杉樹(shù)中方可分離提純得到紫杉醇約 25kg。 對(duì)于成樹(shù)：樹(shù)皮樹(shù)葉樹(shù)根樹(shù)干種子心材。從天然植物的樹(shù)皮、枝葉等組織中粗提取紫杉醇得到是為了接下來(lái)的精制做準(zhǔn)備的。日本學(xué)者對(duì)紫杉醇提取的溶劑種類進(jìn)行了詳細(xì)的研究，

5、結(jié)果表明：在乙酸乙酯、乙醚、丙酮、甲醇、乙烷、異丙醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-二氯甲烷、乙酸乙酯-丙酮、乙酸乙酯-乙醚等溶劑中，以乙酸乙酯-丙酮（體積比1:1）混合溶劑提取效果最好，所得浸膏僅為植物干重的7.7%，紫杉醇的含量高達(dá)浸膏的0.084%，而用甲醇提取所得的浸膏為植物干重的20.98%，紫杉醇的含量為浸膏的0.027%，尚需要多次抽提才能得到紫杉醇含量較高的浸膏現(xiàn)在看來(lái)利用乙酸乙酯-丙酮（1:1）一次便可以使紫杉醇提取量高于以往常用溶劑所能得到的量，這就為后續(xù)分離純化工作帶來(lái)很大的方便，由于乙酸乙酯-丙酮（1:1）的價(jià)格與甲醇的價(jià)格相當(dāng)，且可以回收利用，因此，這一方法是較為經(jīng)濟(jì)合理

6、的。但是浸膏都是在原材料干燥粉碎后直接用有機(jī)溶劑反復(fù)浸提的，故浸膏中除了目標(biāo)物質(zhì)紫杉醇外，還存有大量的色素，蠟質(zhì)及其有著和紫杉醇一樣的碳骨架的類似物，這些雜質(zhì)的存在都為后續(xù)的去雜提純?cè)黾恿讼喈?dāng)?shù)碾y度。沉淀法是沉淀法是利用某種利用某種沉淀劑沉淀劑使使需要需要提取的藥物或雜提取的藥物或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成霧定型固體的過(guò)質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成霧定型固體的過(guò)程。沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低，原材料程。沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低，原材料易得，在產(chǎn)物濃度越高的溶液中沉淀越有利，收易得，在產(chǎn)物濃度越高的溶液中沉淀越有利，收率越高。沉淀一般只能達(dá)到初步純化的目的，技率越高。沉淀一般只能達(dá)

7、到初步純化的目的，技術(shù)較為成熟，在大規(guī)模生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。術(shù)較為成熟，在大規(guī)模生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。紫杉醇在己烷溶液中能產(chǎn)生沉淀，這個(gè)性質(zhì)可以用來(lái)提取紫杉醇?？梢栽诖痔岬慕嘀刑砑蛹和椋兔鸦蜉p汽油等非極性溶劑將紫杉醇沉淀析出，非極性雜質(zhì)則殘留于母液中被除去，從而得到純度較高的紫杉醇。但是，沉淀過(guò)程中生成的沉淀非常細(xì)微，即使使用也很難全部回收，導(dǎo)致了紫杉醇的較大損失。 膜分離法在近些年也開(kāi)始用于分離紫杉醇烷類化合物。膜分離法（membrane separation）是利用具有一定選擇性、透過(guò)特性的過(guò)濾介質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)的分離純化，是人類最早應(yīng)用的分離技術(shù)之一。 1994年，美國(guó)科學(xué)家Carver等人采

8、用平板式、中空纖維式和管式膜組件，對(duì)超濾膜和反滲透膜在紫杉醇烷類物質(zhì)的分離過(guò)程中應(yīng)用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：采用膜分離法可以進(jìn)一步粗濃縮提取過(guò)程所得的浸膏，可以使紫杉醇烷類物質(zhì)的濃度提高5倍左右。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是在提取過(guò)程中使紫杉醇的活性損失減至最小。超濾膜，是一種孔徑規(guī)格一致，超濾膜，是一種孔徑規(guī)格一致，額定孔徑范圍為額定孔徑范圍為0.001-0.02微米的微米的微孔過(guò)濾膜。在膜的一側(cè)施以適微孔過(guò)濾膜。在膜的一側(cè)施以適當(dāng)壓力，就能篩出小于孔徑的溶當(dāng)壓力，就能篩出小于孔徑的溶質(zhì)分子，以分離分子量大于質(zhì)分子，以分離分子量大于500道道爾頓、粒徑大于爾頓、粒徑大于220納米的顆粒。納米的顆粒。超濾膜

9、是最早開(kāi)發(fā)的高分子分離超濾膜是最早開(kāi)發(fā)的高分子分離膜之一，在膜之一，在60年代超濾裝置就實(shí)年代超濾裝置就實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化現(xiàn)了工業(yè)化。超濾膜的工業(yè)應(yīng)用十分廣泛，已成為新型化工單元操作之一。用于分離、濃縮、純化生物制品、醫(yī)藥制品以及食品工業(yè)中；還用于血液處理、廢水處理和超純水制備中的終端處理裝置。反滲透又稱逆滲透，一種以壓力差為推動(dòng)力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作。對(duì)膜一側(cè)的料液施加壓力，當(dāng)壓力超過(guò)它的滲透壓時(shí)，溶劑會(huì)逆著自然滲透的方向作反向滲透。從而在膜的低壓側(cè)得到透過(guò)的溶劑，即滲透液；高壓側(cè)得到濃縮的溶液，即濃縮液。早期的色譜純化紫杉醇工藝是采用多根硅膠層析柱串聯(lián)的一種操作，但是因?yàn)楣枘z對(duì)紫杉醇

10、的不可逆吸附造成了巨大的損失，使得紫杉醇的回收率很低，僅為0.004%左右。近年來(lái)，隨著色譜技術(shù)的進(jìn)步，不斷有新的色譜技術(shù)被引入到紫杉醇的分離提取過(guò)程中來(lái)。除了高速液相色譜法（HPLC，其中包括正相-HPLC、反相-HPLC）外，還有薄層色譜法（TLC）、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法（MECC）和高速逆流色譜法（HSCCC）等。HPLC流程示意圖各種類型的HPLC和TLC的共同缺點(diǎn)是負(fù)載量小，不適于日常大量的樣品處理，僅能達(dá)到半制備的規(guī)模水平。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)

11、各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。HSCCC是最有望成為一種大規(guī)模制備生產(chǎn)紫杉醇的方法。這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)是：具有較高的樣品負(fù)載量，分離周期短，操作簡(jiǎn)便，由于這種色譜法本身無(wú)固體載體，避免了分離樣品與固體表面產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)而變性或不可逆吸附造成的樣品損失。不足之處在于紫杉醇和紫杉醇類似物cephalomannie不能完全分離開(kāi)，大約有一半左右的二者混合物需要經(jīng)過(guò)HPLC或者TLC再次分離才可以得到紫杉醇純品。MECCMECC雖然具有分離效率高、溶劑消雖然具有分離效率高、溶劑消耗小、速度快等優(yōu)點(diǎn)，

12、但是其處理耗小、速度快等優(yōu)點(diǎn)，但是其處理量小，操作復(fù)雜的缺點(diǎn)限制了其應(yīng)量小，操作復(fù)雜的缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用范圍，目前只用于分析檢測(cè)。用范圍，目前只用于分析檢測(cè)。超臨界流體萃取是一種新型萃取分離技術(shù)。它利用超臨界流體作為萃取劑，從液體或者固體中萃取出特定成分，已達(dá)到分離目的。如何進(jìn)行超臨界流體萃取？用哪種超臨界流體？什么是超臨界流體？圖為純流體的典型壓力-溫度圖，圖中線AT表示氣-固平衡的升華曲線，線BT表示液-固平衡的熔融曲線，線CT表示氣-液平衡的飽和液體的蒸汽壓曲線，點(diǎn)T是氣-液-固三相共存的三相點(diǎn)。將純物質(zhì)沿氣-液飽和線升溫，當(dāng)?shù)竭_(dá)圖中的C點(diǎn)時(shí)，氣-液的分界面消失，體系的性質(zhì)變得均一，不再分

13、為氣體和液體，故C點(diǎn)稱為臨界點(diǎn)。改點(diǎn)處對(duì)應(yīng)的溫度和壓力分別稱為臨界溫度和臨界壓力。圖中高于臨界溫度和臨界壓力的陰影區(qū)域?qū)儆诔R界流體狀態(tài)。超臨界流體的特性密度 超臨界流體具有可壓縮性，其密度隨壓力增的而增大，在適當(dāng)?shù)膲毫ο拢喈?dāng)于流體的密度。黏度 超臨界流體的黏度極小，相當(dāng)于氣體的黏度，具有良好的傳遞性和快速移動(dòng)的能力。擴(kuò)散力 超臨界流體具有較大的自擴(kuò)散能力，是液體的100倍，因此比液體傳質(zhì)好，并具有良好滲透能力。溶解性 超臨界流體對(duì)于不同的溶質(zhì)，在不同的溫度壓力下，氣溶解度不同。選擇性 超臨界流體具有提取不同物質(zhì)的特性，對(duì)于不同的組分，超臨界流體可以再不同溫度，壓力，夾帶劑下單獨(dú)提取。導(dǎo)熱性

14、 臨界點(diǎn)附近，物質(zhì)的導(dǎo)熱率對(duì)溫度和壓力的變化十分靈敏，自然對(duì)流容易產(chǎn)生。超臨界流體固體萃取工藝流程 在萃取這一步工藝中，超臨界流體作為溶劑進(jìn)入萃取器，在固體顆粒固定床的入口均勻分布，然后流經(jīng)固體固定床并溶解固體中得待萃取物質(zhì)。超臨界流體經(jīng)過(guò)固定床的流動(dòng)方向可以自上而下，也可以自下而上。萃取物和溶劑分離的工藝步驟實(shí)在分離器中完成的。含有溶質(zhì)的超臨界流體離開(kāi)萃取器后進(jìn)入分離器，與溶質(zhì)分離后的超臨界流體溶劑返回進(jìn)入萃取器，循環(huán)使用。Tips:還包括處理液體的多級(jí)逆流超臨界流體萃取，此處不做展開(kāi)。 溶劑的循環(huán)是很關(guān)鍵的步驟，一般有兩種方式，分別為壓縮機(jī)循環(huán)方式和泵循環(huán)方式。在壓縮機(jī)循環(huán)方式中，超臨界狀態(tài)的溶劑首先通過(guò)改變其狀態(tài)與溶質(zhì)分離，然后調(diào)節(jié)溫度和壓力成為，再由壓縮機(jī)增壓至萃取的壓力條件，經(jīng)調(diào)溫至萃取溫度后，再次進(jìn)入萃取器。在泵循環(huán)方式中，超臨界狀態(tài)的溶劑還是首先改變其狀態(tài)達(dá)到分離溶質(zhì)的目的，然后調(diào)節(jié)溫度和壓力成為，再由泵加壓至萃取壓力，再調(diào)溫至萃取溫度，返回萃取器。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。下面以復(fù)旦大學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備為例，講解下面以復(fù)旦大學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備為例，講解CO2超臨界流體萃取的原理及其設(shè)備。超臨界流體萃取的原理及其設(shè)備。CO2和修飾劑分別由CO2泵和修飾劑泵打入各泵的錐形腔體中