(第五章)第六章植物離體莖尖培養(yǎng)與培育

1、第六章第六章 植物離體莖尖培養(yǎng)與培育植物離體莖尖培養(yǎng)與培育無病毒苗無病毒苗第一節(jié) 培育植物無病毒苗的意義 第二節(jié) 防治病毒的方法第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒第四節(jié) 脫毒實(shí)例第一節(jié) 培育植物無病毒苗的意義o我們知道，多數(shù)栽培植物，尤其是無性繁殖的植物，都易受到一種或幾種病毒的侵染。例如，已知草莓能感染62種病毒和類菌質(zhì)體；侵染馬鈴薯的病毒也多達(dá)30多種左右。o隨著栽培時(shí)間的推移，各種植物中侵染病毒的種類越來越多，如核果類1930年報(bào)道只有5種病毒，1950年已達(dá)到了48種，而1976年則達(dá)到95種。第一節(jié) 培育植物無病毒苗的意義o近年來病毒的侵染范圍有日益擴(kuò)大的趨勢(shì)，故危害日趨嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，植物病毒已超

2、過500種，嚴(yán)重危害著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。o受病毒侵染的農(nóng)作物生長遲緩、畸形，產(chǎn)量大幅度下降、品質(zhì)變劣，甚至完全喪失商品價(jià)值。第一節(jié) 培育植物無病毒苗的意義o19751976年，僅廣東汕頭地區(qū)，就因黃龍病而死掉的柑桔樹達(dá)60萬株。 o柑桔的衰退病曾經(jīng)毀滅了巴西的大部分柑桔，圣保羅州600萬株甜橙死亡（占總數(shù)75%），至今仍威脅著世界柑桔產(chǎn)業(yè)。o葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)10%50%。o棗瘋病毀滅掉我國北京密云的金絲小棗。o蘋果繡果病也是我國果樹生產(chǎn)上亟待解決的病毒病。第一節(jié) 培育植物無病毒苗的意義o1960年以來，日本草莓因病毒病的危害，產(chǎn)量嚴(yán)重降低，品質(zhì)大大退化，使草莓生產(chǎn)受到滅頂之災(zāi)。o馬鈴薯病毒?。ㄖ?/p>

3、要有十幾種病毒）的危害更是全球普遍性的問題，已引起人們的高度重視。第一節(jié) 培育植物無病毒苗的意義o目前，對(duì)細(xì)菌和真菌侵染植物后所引起的病害，可以通過藥物處理達(dá)到治愈的目的，但是現(xiàn)在還沒有什么藥物處理可以治愈被病毒侵染的植物。因此，培育植物無病毒苗，在生產(chǎn)上具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。o培育植物無病毒苗，關(guān)鍵是防治病毒的侵染。第二節(jié) 防治病毒的方法o防治病毒主要有物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法，其中以生物學(xué)方法更為有效。簡介如下：o1、物理方法：o即通過X射線、紫外線、超短波和高溫處理等，以鈍化植物病毒。其中以熱處理最為常用。o熱處理又稱溫?zé)岑煼ǎ╰hermotherapy）。其基本原理是植物

4、處在較高于正常溫度的環(huán)境中，組織內(nèi)許多病毒能部分地或全部地被鈍化，而對(duì)寄主組織很少或不會(huì)傷害。第一節(jié) 培育植物無病毒菌的意義ABC低 溫生長區(qū)域溫?zé)岑煼▍^(qū)域無傷害病原體被清除寄主植株被殺死圖示：植物生長的溫度區(qū)域與溫?zé)岑煼▍^(qū)域相對(duì)關(guān)系圖解 B-C是熱處理的臨界區(qū)域；寄主（C）和寄主病原體的熱死點(diǎn)之間的寬廣范圍，為溫?zé)岑煼ㄌ峁┹^寬的溫度。 高 溫 第二節(jié) 防治病毒的方法o熱處理可由熱水或熱空氣提供。熱水處理適用于休眠器官（如種子、塊莖、休眠枝條和芽等）；熱空氣處理對(duì)活躍生長的器官有較好效果，而且使用較方便。方法：將活躍生長的植株移置溫?zé)嶂委熓遥ɑ蛳洌﹥?nèi)，曝于3540中一般適宜時(shí)間便可。第二節(jié) 防

5、治病毒的方法o處理溫度和時(shí)間因植物種類和器官生理?xiàng)l件等不同而異。短則幾十分鐘，長則達(dá)數(shù)月。在熱處理初期，空氣溫度必須逐步升高，直至達(dá)到所要求的溫度為止。被處理的植株必須含有充足的有機(jī)養(yǎng)分。同時(shí)，處理室內(nèi)要維持合適的相對(duì)濕度和光照。o考慮到連續(xù)長期在為病毒鈍化所需要的高溫中，對(duì)寄主組織會(huì)帶來危害，因此，也有采用高、低溫交替處理方法。第二節(jié) 防治病毒的方法o溫?zé)嶂委煹闹饕毕菔遣⒎撬胁《緦?duì)溫度都是敏感的。例如，在馬鈴薯中，只有卷葉病毒能用此法根治。Quak (1977)認(rèn)為，熱處理對(duì)防治等徑的病毒Cisometric Viruse和類似線狀的病毒（thread-like viruse）以及為支原

6、體所導(dǎo)致的疾病才有效，對(duì)桿狀和線狀的病毒作用不大。而且對(duì)寄主植物所作的長時(shí)間熱處理會(huì)鈍化植物組織內(nèi)的阻抗因子，從而增加無效植株的發(fā)生率。經(jīng)熱處理后，往往只有少數(shù)植株能存活下來。第二節(jié) 防治病毒的方法o2、化學(xué)方法：o即用能抑制病毒復(fù)制的一些化學(xué)物質(zhì)如孔雀綠、硫尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤等和某些病毒抑制劑，如蛋白質(zhì)與核酸合成抑制劑，以抑制植物病毒。但因這些化學(xué)物質(zhì)或抑制劑同時(shí)對(duì)寄主組織也有害。故在生產(chǎn)上不常用。第二節(jié) 防治病毒的方法o3、生物學(xué)方法：o即通過種子繁殖、愈傷組織和莖尖分生組織培養(yǎng)等方法脫除植物病毒。種子繁殖對(duì)有性繁殖植物合用，但對(duì)植物無性繁殖沒用。愈傷組織培養(yǎng)雖可脫除病毒，但易引起變異，

7、故不常用。莖尖分生組織培養(yǎng)是目前最有效的治療病毒病的方法，幾乎對(duì)所有病原體，包括所有病毒均有效，而且該法周期短、效率高，又能與快速繁殖相結(jié)合。o該法與溫?zé)岑煼ㄅ浜鲜褂茫Ч选５谌?jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o(一)莖尖培養(yǎng)脫毒原理o(二)莖尖培養(yǎng)脫毒方法的建立、發(fā)展和應(yīng)用o(三)莖尖培養(yǎng)脫毒一般過程o(四)莖尖培養(yǎng)脫毒基本技術(shù)第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o（一）莖尖培養(yǎng)脫毒原理o眾所周知，病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的。在受侵染的植株中，頂端分生組織（莖尖）一般來說是無病毒的，或者只帶有濃度很低的病毒，可能的原因是：（4點(diǎn)）第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o1、在植物體中，病毒的移動(dòng)主要有兩條途徑，其一是維管系統(tǒng)，而在頂

8、端分生組織不存在維管系統(tǒng)；其二是胞間連絲，但這條途徑的移動(dòng)速度很慢，難以追趕上活躍的莖尖。因此，在頂端分生組織（莖尖）中，病毒的移動(dòng)受阻。o2、在旺盛的頂端分生組織（莖尖）中，代謝活性很高，使病毒無法進(jìn)行復(fù)印。o3、在莖尖中存在高水平內(nèi)源激素（生長素），可以抑制病毒的增殖。o4、在植物體中可能存在一種“病毒鈍化系統(tǒng)”（virus inactivating system），它在頂端分生組織（莖尖）中的活動(dòng)應(yīng)最高，因而莖尖組織不受侵染。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o（二）莖尖培養(yǎng)脫毒方法的建立、發(fā)展和應(yīng)用o最早，由Holmes(1948)通過莖尖扦插的方法，由受侵染的大麗花中獲得了無病毒植株。Morel和

9、Martin（1952）根據(jù)這一原理，建立了消除病毒的莖尖培養(yǎng)方法。此后，莖尖培養(yǎng)方法得到迅速發(fā)展，現(xiàn)已成為最有效的獲得無毒植株的方法，已成功用于多種栽培作物。利用莖尖培養(yǎng)不僅可以消除病毒，還可以消除植物體中多種其它病原菌。目前該技術(shù)已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到廣泛的應(yīng)用。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，用莖尖培養(yǎng)方法已成功對(duì)60多種植物的100多種病毒進(jìn)行“脫毒”。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o馬鈴薯莖尖培養(yǎng)培育脫毒植株是最成功的例子。我國種植馬鈴薯面積達(dá)330萬公頃，占世界第二位，由于病毒感染導(dǎo)致品種退化，嚴(yán)重減產(chǎn)?！氨狈N南調(diào)”。 o中科院與內(nèi)蒙古、黑龍江、甘肅等20多個(gè)省、市、自治區(qū)60余個(gè)單位協(xié)作，用莖尖培養(yǎng)快速育苗和病

10、毒鑒定，以解決馬鈴薯的病毒感染問題。 o至1985年，我國培育的馬鈴薯無病毒品種已超過100個(gè)，許多已在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用。”第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o（三）莖尖培養(yǎng)脫毒一般過程o這一過程大體可分為以下四個(gè)階段：o1、診斷：首先了解供試材料感染病毒的種類。o2、脫毒：根據(jù)所攜帶的病毒種類選擇合適的處理方法。o3、鑒定：對(duì)再生植株進(jìn)行鑒定，從中選出無病毒苗。 o4、繁殖：選擇合理的繁殖方法和防止病毒再侵染的措施 ，對(duì)繁殖的植株進(jìn)行檢測(cè)。 第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o（四）莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)o不同植物在技術(shù)細(xì)節(jié)上是不同的，但原則上有共同點(diǎn)：o1、材料的選擇。因?yàn)橹参锩摱镜哪康氖菫榱颂岣咿r(nóng)作物、果樹、蔬菜的產(chǎn)量和

11、質(zhì)量，恢復(fù)其高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的種性，因此在材料選擇時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：第一一，品種要可靠；第二二，對(duì)農(nóng)作物、果蔬要選擇經(jīng)當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種來作為脫毒材料；第三三，名貴稀有的植物良種。只有這樣，脫毒材料才能收到較大的經(jīng)濟(jì)效益。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o2、將經(jīng)消毒處理過的芽、茹類的嫩莖在雙筒解剖鏡下，仔細(xì)地剝?nèi)ドL錐外圍的幼葉和葉原基，直至露出圓滑的生長錐。由于不同植物其生長錐的形狀、大小、外圍幼葉與葉原基的著生方式均有不同，因而剝?nèi)》椒ㄒ灿兴煌?。剝?nèi)∏o尖時(shí)最重要的是迅速準(zhǔn)確，因?yàn)閯內(nèi)∏o尖是在解剖鏡下進(jìn)行，如速度太慢就很容易污染；方法不準(zhǔn)確則容易損傷生長錐，這樣就達(dá)不到培養(yǎng)目的。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫

12、毒o3、接種。莖尖剝?nèi)⊥戤吅?，用鋒利的解剖刀，小心切取所需大小的生長錐，一般為0.20.5mm，帶有12個(gè)葉原基，并隨即接種于適宜的培養(yǎng)基上（參書P8-12，表8-2）進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接種1個(gè)莖尖。o4、培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件基本與離體莖培養(yǎng)相似。但由于莖尖比較小，故培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽濃度可以適當(dāng)降低；但適當(dāng)提高K+的濃度有利于芽的分化。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o在正常情況下，接種一周莖尖的顏色逐漸變?yōu)榫G色，基部逐漸增大，有時(shí)形成少量愈傷組織，莖尖開始伸長。大約1個(gè)月左右，即可看到明顯伸長的小莖，形成可見的小葉，這時(shí)可轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基（有時(shí)繼代培養(yǎng)基與初代培養(yǎng)基相同）中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得大量叢生芽，將2

13、cm以上長度的幼嫩無根苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)生根，形成完整植株。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o在材料接種前可結(jié)合進(jìn)行“溫?zé)崽幚怼保簅對(duì)母株，在3538中熱處理510周；o對(duì)馬鈴薯，將塊莖在3738中處理1個(gè)月。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o(五)脫病毒植株的檢定o常用的檢測(cè)方法有5種：o1、植株直觀測(cè)定法：o2、指示植物測(cè)定法o3、電子顯微鏡觀測(cè)法o4、血清學(xué)方法o5、分子生物學(xué)檢測(cè)法第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o1、植株直觀測(cè)定法：o即直接檢查植株葉子和莖有無可見的病毒癥狀特征。這是一種最簡單的方法。缺點(diǎn)是寄主植物出現(xiàn)癥狀，需時(shí)較長，不能很快取得檢定結(jié)果；有的病毒病并不使寄主表現(xiàn)可見癥狀，無法用此法檢測(cè)。第三節(jié)

14、莖尖培養(yǎng)脫毒o2、指示植物測(cè)定法：o即從待測(cè)植株上取下葉子，置研缽中加等量（W/V）0.1molL-1磷酸鹽緩沖液研磨成勻漿。然后，在指示植物的葉上輕抹上一種磨料粉末與待測(cè)植株的葉片漿液，如果接種的汁液含有病毒，約經(jīng)數(shù)天或幾周后，指示植物便會(huì)呈現(xiàn)特有的癥狀。以此來測(cè)定（待測(cè)）培養(yǎng)所得的植株有無病毒。o比較重要的指示植株有：藜屬的Chenopodium amaranticolor(莧色藜), Chenopodium quinoa(昆落阿藜)， 千日紅（Gomphrena globosa）和各種煙草等。o本法的缺點(diǎn)是對(duì)于不能在較短時(shí)間內(nèi)使指示植物呈現(xiàn)癥狀的潛伏性病毒難以檢定。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o

15、3、電子顯微鏡觀測(cè)法：o即直接用電子顯微鏡觀察待測(cè)植株的葉片中有無病毒顆粒。具體操作方法可參閱有關(guān)專著。o本法是一種既準(zhǔn)確又科學(xué)的方法。缺點(diǎn)是實(shí)踐中不易應(yīng)用，因耗價(jià)高，只有很少數(shù)實(shí)驗(yàn)室具有電鏡設(shè)備，并需要訓(xùn)練有素的專門技術(shù)人員操作。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o4、血清學(xué)方法o該法靈敏度高，獲得檢測(cè)結(jié)果迅速，是目前快速檢測(cè)任何病毒的一種最好的方法。o抗原引起形成抗體的物質(zhì)（病毒或異體蛋白）。o抗原和抗體結(jié)合，表現(xiàn)為很強(qiáng)的特異性。即由一種病毒產(chǎn)生的抗體，只能結(jié)合該種病毒?？贵w在特殊細(xì)胞內(nèi)形成，進(jìn)入血液存在于血清和體液內(nèi)。這種含有特異性“抗體”的血清稱為“抗血清”?？乖涂贵w相結(jié)合的反應(yīng)稱為“血清反應(yīng)”。

16、o為了診斷準(zhǔn)確，往往需要多種檢測(cè)法配合進(jìn)行。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒病毒感染人工注射異體蛋白動(dòng)物動(dòng)物蛋白血清反應(yīng)帶該種病毒免疫球蛋白 (抗體) (抗原)(抗原)圖 血清鑒定法示意圖第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o5、分子生物學(xué)檢測(cè)法o（1）核酸分析o 核酸分析包括直接對(duì)病毒及類病毒基因組核酸電泳分析和根據(jù)已知的基因組核酸系列設(shè)計(jì)引物對(duì)病毒及類病毒基因組的特異性片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過觀察特異性條帶而對(duì)這些病原進(jìn)行鑒定。o 電泳分析o PCR技術(shù) 第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o（2）核酸雜交技術(shù)o 其基本原理是兩條互補(bǔ)核酸鏈的堿基可以相互配對(duì)而形成雙鏈。兩種不同來源的核酸鏈通過堿基配對(duì)形成雙鏈的過程稱為核酸雜交（nucleotide hybridization）。第三節(jié) 莖尖培養(yǎng)脫毒o采用特定的方法對(duì)一已知核酸片段進(jìn)行標(biāo)記，就可利用已知的核酸片段檢測(cè)待檢樣品中是否有與該片段互補(bǔ)的核酸，這種帶有特定標(biāo)記的核酸片段稱為核酸探針（probe）。o核酸雜交技術(shù)在病毒尤其是基因