免疫組織化學(xué)技術(shù)

1、 免疫組織免疫組織/細(xì)胞化學(xué)細(xì)胞化學(xué) IHC/ICC主要內(nèi)容免疫組織化學(xué)概況免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟和試劑常見問(wèn)題及處理方法多色標(biāo)記免疫組織/細(xì)胞學(xué)簡(jiǎn)介免疫組織學(xué)免疫組織學(xué) 是一種把分子水平的物質(zhì)在組織原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)進(jìn)行定性、定位測(cè)定，準(zhǔn)確具體表達(dá)出來(lái)的一種方法。這些分子水平的物質(zhì)可能與癌細(xì)胞、蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等等有關(guān)技術(shù)平臺(tái)技術(shù)平臺(tái)組織切片或細(xì)胞爬片純化的一抗（單克隆或多克?。?biāo)記的二抗(酶、金顆?；蛘邿晒猓╋@色系統(tǒng)（DAB、AEC、BCIP/NBT、FAST RED等） 檢測(cè)系統(tǒng)（普通或熒光顯微鏡）免疫組織學(xué)方法分類免疫組織學(xué)方法分類酶免疫組織化學(xué)染

2、色（IHC） IHC-Fr：冰凍切片 IHC-P：石蠟切片熒光免疫組織染色（IF） 多用于冰凍組織切片或者細(xì)胞爬片膠體金免疫組織染色（GIHC）根據(jù)標(biāo)本類型分類石蠟切片：用酶免疫組織染色冰凍切片：多用熒光免疫染色細(xì)胞爬片：多用熒光免疫染色免疫組化相關(guān)名稱簡(jiǎn)寫簡(jiǎn)寫中文名稱中文名稱ICC 免疫細(xì)胞化學(xué)免疫細(xì)胞化學(xué)ICC/IF 免疫熒光（細(xì)胞標(biāo)本）免疫熒光（細(xì)胞標(biāo)本） IHC-P 免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué) (石蠟切片石蠟切片) IHC-Fr 免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué) (冰凍切片冰凍切片) IF免疫熒光免疫熒光IHC 免疫組織化學(xué)IHC (Methanol fixed) 免疫組織化學(xué) (甲醇固定) I

3、HC (PFA fixed) 免疫組織化學(xué) (PFA 固定標(biāo)本) IHC-FoFr 免疫組織化學(xué) (灌注固定冰凍切片) IHC-FrFl 免疫組織化學(xué) - Free Floating IHC-G 免疫組織化學(xué) (Glycolmethacrylate sections) IHC-Glut 免疫組織化學(xué) (PFA-glutharaldehyde fixed) IHC-M 免疫組織化學(xué) (Methylmethacrylate sections) 酶免疫組織化學(xué)（酶免疫組織化學(xué)（IHC）常用方法）常用方法v PAP/APAAP：二抗-HRP/AP + HRP-抗HRP/AP；v LAB/LSAB：二抗

4、 生物素(Biotin) + HRP-親和素；v S-P/SAP： 二抗 生物素 + 鏈酶親和素-HRP/AP；v ABC/SABC：親和素/鏈酶親和素-生物素化HRP/AP復(fù)合物；v非Biotin/Avidin方法/Envision兩步法：二抗直接偶聯(lián)酶S-P/LAB方法復(fù)合物:鏈酶親和素-HRP/AP基本原理S-P/LAB方法:一個(gè)親和素和多個(gè)標(biāo)記酶（HRP）結(jié)合，多個(gè)生物素與抗體（一抗或二抗）結(jié)合，細(xì)胞的抗原（或一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，既而將酶標(biāo)記的親和素結(jié)合在生物素上，最后進(jìn)行顯色反應(yīng)定位。ABC方法ABC復(fù)合物:親和素-生物素化HRP/APA親和素，B生物素，C復(fù)合物基本原理A

5、BC法：先按一定比例將親和素與酶標(biāo)生物素結(jié)合，形成ABC復(fù)合物，抗原先后與特異性一抗、生物素化二抗、ABC復(fù)合物結(jié)合，形成巨大復(fù)合物（網(wǎng)絡(luò)大量酶分子），最后顯色。二抗直接偶聯(lián)酶的Polymer俗稱兩步法基本原理Envision兩步法：抗原與抗體反應(yīng)結(jié)合后，第二抗體上標(biāo)記有多聚化合物酶復(fù)合物（EnVision復(fù)合物），與第一抗體結(jié)合，進(jìn)而由酶作用底物進(jìn)行顯色定位。熒光免疫組織染色方法使用熒光標(biāo)記抗體，直接定位、定性檢測(cè)組織或細(xì)胞蛋白表達(dá)情況。較免疫組化具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是染色組織片不能長(zhǎng)期保存IF常用熒光素FITC：綠色，激發(fā)波長(zhǎng)488nm；發(fā)射波長(zhǎng)515nmRhodamine：

6、橙色，激發(fā)波長(zhǎng)570nm；發(fā)射波長(zhǎng)570-590nmTexas Red：紅色，激發(fā)波長(zhǎng)589nm；發(fā)射波長(zhǎng)570-615nmCy3：橙色，激發(fā)波長(zhǎng)512/550nm；發(fā)射波長(zhǎng)570nmCy5：紅色，激發(fā)波長(zhǎng)625/650nm；發(fā)射波長(zhǎng)670nm免疫組化實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)正確選配抗體 一抗必須是說(shuō)明書上經(jīng)過(guò)驗(yàn)證(tested application)可以用于IHC(IHC-P;IHC-Fr)檢測(cè)的 二抗必須是和一抗來(lái)源及亞型相配套的 正確設(shè)置合適的對(duì)照正確選配固定方法和修復(fù)方法正確選配顯色系統(tǒng)免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照：判斷染色全過(guò)程和所有試劑的正確性：A、內(nèi)部對(duì)照：對(duì)照組織本身明確存在的抗原（二抗

7、系統(tǒng)的正確性）B、外部對(duì)照：明確表達(dá)待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞（一抗的工作性）陰性對(duì)照：明確不表達(dá)待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞二抗對(duì)照：不加一抗，余操作相同免疫組化基本操作步驟及需要的試劑免疫組化基本操作步驟Envision二步法操作步驟1、組織切片60預(yù)熱2、常規(guī)脫蠟入水（二甲苯、各級(jí)酒精、水）3、抗原修復(fù)4、PBS/T洗3次，5min/次5、3%H2O2 RT 10min（封閉內(nèi)源HRP）6、PBS/T洗3次，5min/次7、10%正常山羊血清RT 30min（阻斷組織內(nèi)源IgG、Fc-R）8、一抗4 孵育過(guò)夜9、PBS/T洗3次，5min/次10、二抗RT 30min11、PBS/T洗3次，5min/

8、次12、DAB顯色，顯微鏡下觀察，控制顯色程度13、充分水洗14、蘇木素復(fù)染核15、1%鹽酸酒精分化16、充分水洗返藍(lán)17、脫水、透明，中性樹膠封片1、載玻片處理重酪酸鉀濃硫酸浸泡24hddH2O漂洗95%乙醇浸泡12h防脫粘片劑處理： Poly-L-Lysine; AEPS; Special Reagent可直接購(gòu)買處理好的載玻片2、組織固定石蠟切片冰凍切片細(xì)胞涂片組織固定液10%中性福爾馬林4%多聚甲醛冷丙酮，4%多聚甲醛甲醇、乙醇特點(diǎn)需要修復(fù)不需修復(fù)，冷丙酮固定不需破膜不需修復(fù)如果待測(cè)蛋白位于細(xì)胞漿或者細(xì)胞核內(nèi)，同時(shí)還需要進(jìn)行破膜處理標(biāo)本類型及常用固定液標(biāo)本類型及常用固定液3、抗原修復(fù)加

9、熱修復(fù)技術(shù)修復(fù)方法修復(fù)方法：微波加熱修復(fù)、高壓熱修復(fù)、煮沸熱修復(fù)：常用常用buffer：檸檬酸Buffer:0.01M, pH6.0 EDTA buffer: pH9.0非加熱修復(fù)技術(shù)胃蛋白酶(細(xì)胞內(nèi)抗原): 0.4%,37,30mins 胰酶(細(xì)胞間抗原): 0.05-0.25%,37,10-15mins Proteinase K : 20ug/ml正常血清正常血清(5-10%)：阻斷組織內(nèi)源IgG、Fc-RBSA (5%) ：阻斷組織內(nèi)源IgG、Fc-R特殊封閉試劑特殊封閉試劑：當(dāng)使用小鼠源性抗體檢測(cè)小鼠組織抗原時(shí)內(nèi)源性生物素內(nèi)源性生物素/親和素親和素：有些組織如腎臟、肝臟、脾臟含有很高的

10、內(nèi)源性生物素，如使用SP或者ABC試劑盒需要進(jìn)行封閉封閉條件：室溫 30-120mins如是HRP系統(tǒng)，則同時(shí)需要使用3% H2O2室溫10-30mins淬滅內(nèi)源性HRP的活性4、封閉、封閉5、一抗孵育選擇驗(yàn)證過(guò)待測(cè)種屬和實(shí)驗(yàn)方法的一抗根據(jù)說(shuō)明書上推薦的固定和修復(fù)方法處理標(biāo)本說(shuō)明書推薦的稀釋比例僅作參考，需要根據(jù)標(biāo)本類型來(lái)摸索最佳稀釋比例一般是在含1%封閉試劑的緩沖液（比如PBS(T) /TBS(T)中4過(guò)夜6、二抗及酶標(biāo)記物孵育根據(jù)一抗的來(lái)源和Ig亞型選擇合適的二抗根據(jù)說(shuō)明書推薦的稀釋比例和標(biāo)本類型摸索最佳稀釋比例一般是在含1%封閉試劑的緩沖液（比如PBS(T) /TBS(T)中室溫(RT)

11、 30-60mins也可以選擇商業(yè)化的試劑盒：SP,ABC或者兩步法7、顯色 HRP AP AEC（red) Fast Red(pink) DAB(brown/gray)BCIP/NBT(blue/violet) 根據(jù)所用酶類型選擇合適的顯色底物8、復(fù)染、復(fù)染蘇木素(染核,藍(lán)色)甲基綠(染核,綠色)核固紅(染核,紅色)DAPI(染核,蘭色)AEC,DAB,AP Red/Fast Red, 免疫金-銀染色DAB, BCIP/NBTBCIP/NBT熒光9、脫水/透明/封片AEC,AP Red/ Fast Red, 和其它有機(jī)染料DAB,New Fuchsin, Vega Red,BCIT/NBT和

12、其它水溶性染料熒光染料不需脫水、透明脫水、透明脫水、透明水溶性封片劑如AEC封片劑 有機(jī)封片劑如中性樹膠水溶性封片劑，最好是含熒光抗淬滅成分的(PE不能用含甘油的封片劑)10、結(jié)果觀察普通光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡IHC/ICC常見問(wèn)題分析常見問(wèn)題及處理方法常見問(wèn)題及處理方法 組織脫片 非特異性背景染色 染色弱 無(wú)陽(yáng)性染色載玻片處理不充分組織固定、脫水、透明不充分組織切片太厚（5um)組織切片有折疊過(guò)度的熱抗原修復(fù)（高壓、微波、水煮）抗原修復(fù)液的pH值偏高操作過(guò)程中沖洗方法不正確組織脫片常見原因組織脫片常見原因封閉不充分封閉不充分：增加封閉試劑濃度、延長(zhǎng)封閉時(shí)間沖洗不充分沖洗不充分：短時(shí)間多次數(shù)的洗

13、滌更有效實(shí)驗(yàn)過(guò)程中切片干燥實(shí)驗(yàn)過(guò)程中切片干燥：試劑量充足，注意觀察，避免干片組織切片折疊組織切片折疊組織抗原彌散組織抗原彌散：組織標(biāo)本及時(shí)固定，選擇合適的固定液抗原修復(fù)不充分抗原修復(fù)不充分：更改修復(fù)方法，優(yōu)化時(shí)間內(nèi)源性生物素內(nèi)源性生物素/親和素親和素：使用封閉試劑或者不用SP/ABC系統(tǒng)二抗原因二抗原因：選擇Fab段的抗體或者吸附過(guò)的抗體，設(shè)置二抗對(duì)照一抗原因一抗原因：抗體濃度過(guò)高：降低抗體濃度、建議4過(guò)夜選擇純化的抗體設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照試劑污染試劑污染：重新配置新的緩沖液和試劑非特異性背景染色非特異性背景染色組織固定、包埋時(shí)抗原被破壞抗原位于細(xì)胞內(nèi)，未使用破膜劑(尤其是定位于細(xì)胞核)抗體濃度過(guò)低，孵育時(shí)間過(guò)短操作中滴加試劑時(shí)緩沖液未漓干，致使試劑稀釋室內(nèi)溫度15 過(guò)度封閉試劑超過(guò)有效期抗體保存不當(dāng)導(dǎo)致活性降低染色過(guò)程中未避光（熒光染色）染色弱常見原因染色弱常見原因操作錯(cuò)誤（漏加試劑）組織中無(wú)抗原固定、包埋、修復(fù)時(shí)抗原被破壞修復(fù)方法不當(dāng)一抗與二抗不匹配底物和酶不匹配封閉過(guò)度封片劑選擇不當(dāng)一種或多種試劑活性降低或失活抗原位于細(xì)胞內(nèi)，未使用破膜劑無(wú)陽(yáng)性染色常見原因無(wú)陽(yáng)性染色常見原因多標(biāo)記檢測(cè)多標(biāo)記染色法多標(biāo)記染色法適用于同一組織