李建華老師課件

1、液相色譜儀日常維護(hù)及維修上海市藥檢所化學(xué)室李建華液相色譜儀結(jié)構(gòu)組成 流動(dòng)相 脫氣機(jī) 泵 進(jìn)樣器 柱溫箱 柱后衍生化裝置 檢測器流動(dòng)相試劑 有機(jī)相：光學(xué)純或有機(jī)相：光學(xué)純或HPLC級級 水：必須是新鮮的去離子水水：必須是新鮮的去離子水 其它試劑：分析純或更高其它試劑：分析純或更高注意：使用前均用相應(yīng)的濾膜濾過（注意：使用前均用相應(yīng)的濾膜濾過（0.45m）溶劑使用注意點(diǎn)濾膜 聚四氟乙烯膜聚四氟乙烯膜-雙相雙相 尼龍尼龍66膜可過水和大多數(shù)有機(jī)溶劑膜可過水和大多數(shù)有機(jī)溶劑 醋酸纖維素濾膜適用于水性溶液（尤其是蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)醋酸纖維素濾膜適用于水性溶液（尤其是蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相關(guān)樣品）相關(guān)樣品） 再生纖

2、維素濾膜適用于水溶性生物樣品和有機(jī)溶劑。再生纖維素濾膜適用于水溶性生物樣品和有機(jī)溶劑。注意：注意：1.水膜和有機(jī)濾膜千萬不可混用！水膜和有機(jī)濾膜千萬不可混用！2.分別濾過的水相與有機(jī)相的混合。分別濾過的水相與有機(jī)相的混合。溶劑過濾器檢查溶劑過濾器清洗 垂熔玻璃濾器： 不銹鋼燒結(jié)濾器：可用超聲清洗流動(dòng)相脫氣 脫氣作用脫氣作用 脫氣方式原理：脫氣方式原理：1. 低壓脫氣低壓脫氣2.氦氣脫氣氦氣脫氣3. 超聲波脫氣超聲波脫氣流動(dòng)相脫氣作用流動(dòng)相脫氣方式1低壓脫氣法 電磁攪拌水泵抽空，可同時(shí)加溫或向溶劑吹氮。由于抽空和加溫都會(huì)導(dǎo)致溶劑蒸發(fā)，對二元或多元洗脫液的組成會(huì)有影響，故此法適用于單一組成的洗脫液

3、。2氦氣脫氣法 將氦氣通過一圓筒過濾器通入沖洗劑中，在o5kscm2壓力下保持10一15min，用氦氣的小氣泡將溶于溶劑中的空氣帶出。此法簡單方便，適用于所有洗脫液，只是氦氣較貴。3超聲波脫氣法 將洗脫液瓶置于超聲波清洗槽中，以水為介質(zhì)超聲脫氣。一般500m1溶液約需20一30min。此法方便，適于采用。三種脫氣方式比較脫氣方式脫氣效果能否在線對基線漂移影響氦氣脫氣好能噪音較低，易基線漂移超聲脫氣一般（需加真空）不適合/真空脫氣較好能噪音、基線漂移均較小在線脫氣應(yīng)用細(xì)節(jié) 氦氣脫氣：氦氣起始流速一般設(shè)置30ml/min左右，維持時(shí)間根據(jù)流動(dòng)相體積來確定，分析時(shí)維持流速一般設(shè)置5ml/min左右。

4、 真空在線脫氣：脫氣機(jī)每個(gè)通道的流動(dòng)相相對固定，這樣可避免相互干擾。更換溶劑排液要充分，并且要注意脫氣機(jī)最大流速。真空脫氣機(jī)聯(lián)接真空脫氣機(jī)工作原理脫氣機(jī)維護(hù) 溶劑過濾器清洗 溶劑更換 不用通道溶劑更換或封堵 排液時(shí)要根據(jù)脫氣機(jī)類型選擇流速、時(shí)間。注意：由于大部分連接頭和注意：由于大部分連接頭和 芯子都是塑料的，擰緊時(shí)千萬不芯子都是塑料的，擰緊時(shí)千萬不可太用力?？商昧ΑＣ摎鈾C(jī)故障脫氣機(jī)故障原因判斷 真空泵故障：短接真空泵進(jìn)、出口管路 真空腔漏 連接密封性 溶劑 半透膜破裂泵 分類：1.作用原理2.輸液方式 應(yīng)用：單元泵多元泵：1.低壓混合：比例閥2.高壓混合：混合器液相色譜的溶劑輸送系統(tǒng)恒壓泵

5、恒流泵氣動(dòng)放大泵注射泵單柱塞泵雙柱塞泵隔膜泵并并聯(lián)聯(lián)泵泵串串聯(lián)聯(lián)泵泵色色譜譜泵泵溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A 高壓泵B混合室低壓、高壓混合比較低壓混合四元泵工作原理低壓混合四元泵結(jié)構(gòu)Agilent 1100泵結(jié)構(gòu)密封墊沖洗裝置密封墊沖洗應(yīng)用泵應(yīng)用細(xì)節(jié) 使用的流動(dòng)相要與泵的壓縮因子配對。特別是用使用的流動(dòng)相要與泵的壓縮因子配對。特別是用梯度混合時(shí)。梯度混合時(shí)。 對四元泵比例閥來說對四元泵比例閥來說,密度大的流動(dòng)相放下方密度大的流動(dòng)相放下方（常規(guī)是水相溶劑應(yīng)放在下方（常規(guī)是水相溶劑應(yīng)放在下方,有機(jī)溶劑放在上有機(jī)溶劑放在上方）。方）。 二元或四元泵的沖程調(diào)小可獲得較好的混

6、合效果，二元或四元泵的沖程調(diào)小可獲得較好的混合效果，但會(huì)影響密封墊壽命。但會(huì)影響密封墊壽命。 梯度或比例閥的準(zhǔn)確性可測定。梯度或比例閥的準(zhǔn)確性可測定。泵維護(hù)泵維護(hù)不同用途時(shí)溶劑選擇目的溶劑注釋安裝后異丙醇排除系統(tǒng)中空氣效果最好正相與反相間轉(zhuǎn)換異丙醇與兩相溶劑互溶性均較好安裝后甲醇或乙醇如沒有異丙醇，可代替（第二種選擇）使用緩沖液后沖洗系統(tǒng)重蒸水再溶解緩沖液結(jié)晶效果最好更換溶劑后（反相）重蒸水防止緩沖液結(jié)晶析出正相密封墊安裝后異丙醇-己烷（5：95）潤濕效果好液相泵后常用在線過濾器帶可更換濾芯的在線過濾器圖例帶可更換濾芯的在線過濾器圖例Sample FilterSolvent FilterFil

7、ter Element樣品過濾器溶劑過濾器過濾器元件泵維護(hù) 多通道梯度閥 進(jìn)、出口單向閥清洗 出口過濾閥清洗或更換 Seal Wash的清洗及密封墊更換 泵密封墊更換 石英柱塞桿清潔、更換維護(hù)信息密封圈拆洗泵密封圈更換泵密封圈更換泵密封圈更換注意點(diǎn)：泵密封圈更換注意點(diǎn)：1.柱塞用牙膏棉球擦洗一下。柱塞用牙膏棉球擦洗一下。2.密封圈在甲醇中浸泡密封圈在甲醇中浸泡5分鐘用專用工具安裝。分鐘用專用工具安裝。3.泵座用水清洗一下。泵座用水清洗一下。4.密封圈（注意不同類型）密封圈（注意不同類型）密封墊磨合常見泵故障和診斷 多通道梯度閥漏 泵前出現(xiàn)氣泡 壓力不穩(wěn) 泵不出流動(dòng)相（松開purge閥） 進(jìn)、出

8、口單向閥漏或堵塞 壓力高泵壓力不正常原因 氣泡 進(jìn)、出口單向閥故障 密封墊或柱塞桿磨損 管路滲漏或堵塞 比例閥故障 壓力傳感器故障 比例閥混合鹽濃度太高進(jìn)樣器 手動(dòng)進(jìn)樣器：1.墊塞進(jìn)樣 2.閥進(jìn)樣 自動(dòng)進(jìn)樣器：Manual Injector Valves - Six Port Fixed LoopToWasteSample Loop(Fixed Volume)FromPumpToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnCommon ProblemsnImproper syringe size or typenValve BlockagenInjection-p

9、ort leakagenSample carryovernCross-port leaksFront ViewInjectRear ViewLoad - InjectSample Loop手動(dòng)進(jìn)樣器操作原理手動(dòng)進(jìn)樣器操作原理手動(dòng)進(jìn)樣器 手動(dòng)進(jìn)樣器：六通閥 進(jìn)樣順序：INJ時(shí)插針，LOAD時(shí)注射，再加INJ時(shí)運(yùn)行 排空管翹起高度要與針口平行 六通閥接口最好用Rheodyne專用接頭，減少死體積 若用定量管來定量，則多進(jìn)樣（定量管體積1.5倍以上） 轉(zhuǎn)子密封圈若漏，可先將三個(gè)定位螺絲擰緊5-10度（如無效再更換轉(zhuǎn)子） 在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊

10、貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，不能停留在中途，否則過高的壓力在柱頭上引起損壞。 六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。使用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的75，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同；使用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20l的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100l的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。 六通閥的使用手動(dòng)進(jìn)樣器維護(hù) 防止微粒阻塞進(jìn)樣閥和減少對進(jìn)樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進(jìn)樣系統(tǒng)中，每次結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣器，通

11、常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動(dòng)相沖洗，在進(jìn)樣閥的Load和Inject位置反復(fù)沖洗，。手動(dòng)進(jìn)樣器維護(hù)手動(dòng)進(jìn)樣器維護(hù)手動(dòng)進(jìn)樣器維護(hù)轉(zhuǎn)子密封墊選擇Agilent 1100自動(dòng)進(jìn)樣器工作原理Agilent 1100自動(dòng)進(jìn)樣器工作原理自動(dòng)進(jìn)樣條件優(yōu)化進(jìn)樣污染處理進(jìn)樣污染處理自動(dòng)進(jìn)樣器維護(hù) 進(jìn)樣座與針外壁要在診斷中的進(jìn)樣座與針外壁要在診斷中的change needle狀態(tài)下，狀態(tài)下，用水棉球及異丙醇棉球擦洗。用水棉球及異丙醇棉球擦洗。 若常用緩沖溶液，計(jì)量泵內(nèi)的柱塞與密封圈，六通閥上若常用緩沖溶液，計(jì)量泵內(nèi)的柱塞與密封圈，六通閥上的定子與轉(zhuǎn)子密封圈要定期清洗。的定子與轉(zhuǎn)子密封圈要定期清洗。 若六通

12、閥的轉(zhuǎn)子密封圈有劃痕，可將三個(gè)固定螺絲各擰若六通閥的轉(zhuǎn)子密封圈有劃痕，可將三個(gè)固定螺絲各擰緊緊5到到10度。度。 機(jī)械部分要保持清潔，若有灰塵需取出機(jī)械臂，除塵并機(jī)械部分要保持清潔，若有灰塵需取出機(jī)械臂，除塵并加稀牛油。加稀牛油。 定量環(huán)要在定量環(huán)要在Configure中定義，如中定義，如100ul、500ul、900ul、1500ul。自動(dòng)進(jìn)樣器維護(hù) 更換針及針座 更換轉(zhuǎn)子密封圈轉(zhuǎn)子密封圈磨損判斷：自動(dòng)進(jìn)樣器常見故障柱溫箱 連接頭、管線 預(yù)熱器 柱溫箱 色譜柱HPLC連接用的接頭連接用的接頭零死體積接頭零死體積接頭不能使用的接頭不能使用的接頭HPLC常用的色譜柱接頭常用的色譜柱接頭0.090

13、 in.0.130 in.0.090 in.0.170 in.SwagelokWatersParkerRheodyneValcoUptight0.090 in.0.080 in.Troubleshooting LC Fittings, Part II.J. W. Dolan and P. Upchurch.LC/GC Magazine 6:788 (1988)連接管線 柱溫箱維護(hù)柱溫箱維護(hù) 進(jìn)出柱溫箱的管路一定要嵌入槽口內(nèi)，以免折斷管路。進(jìn)出柱溫箱的管路一定要嵌入槽口內(nèi)，以免折斷管路。 予熱器要定期清洗，以防污染及堵塞。予熱器要定期清洗，以防污染及堵塞。 拆卸柱子要用兩個(gè)板手，以免毛細(xì)管折斷。

14、拆卸柱子要用兩個(gè)板手，以免毛細(xì)管折斷。 使用使用peek管，要注意壓力不要超過管，要注意壓力不要超過200bar，否則管子會(huì)彈出。，否則管子會(huì)彈出。 溫度設(shè)置比室溫低時(shí)，要注意有水冷凝析出。溫度設(shè)置比室溫低時(shí)，要注意有水冷凝析出。色譜柱分類 預(yù)柱： 分析柱預(yù)柱液相色譜的預(yù)柱按其安裝位置可分為兩種。 一種是安裝在泵和注射器之間，目的是使校免受腐蝕性的或受污染了的流動(dòng)相的損害。腐蝕性的流動(dòng)相逐漸溶解預(yù)柱卞的硅膠填料，使其在到達(dá)分析柱之前就已變得飽和因此不損害分析拄。另一方面，預(yù)柱可用來收集流動(dòng)相中的痕量雜質(zhì)。在注射口前收集雜質(zhì)比在注射口后往前)收集雜質(zhì)好，因?yàn)樵诤笠环N情況下，有可能改變柱的選擇性或

15、產(chǎn)生鬼峰-在有梯度系統(tǒng)的情況下，這種預(yù)柱可放在泵的出口，混合槽的前面，達(dá)一類預(yù)拄的填料部宜有一定的容量并易于填充。 另一種預(yù)柱安裝在注射口和分析柱之間，這種預(yù)柱主要用來防止臟的樣品和已損壞的墊或其它材料進(jìn)入分析柱。這種預(yù)柱是要通過樣品的，所以與第一種不同，要求較高，它必須填充得很好，柱效較高，并且在功能上能和分析往匹配。另外，不管是和注射口的聯(lián)接還是和分析柱的聯(lián)接，都要注意盡量減少死體積，因?yàn)樗欠治鲋囊粋€(gè)延伸。預(yù)柱和保護(hù)柱預(yù)柱和保護(hù)柱由泵輸送的流動(dòng)相預(yù)柱進(jìn)樣器保護(hù)柱分析柱至檢測器截留或濃縮柱 色譜柱的安裝Whats needed:The right connectors to avoid

16、any future leak. Guard column to protect the main column The right tools 標(biāo)準(zhǔn)不銹鋼分析柱CapillaryS.S. Filter Frit 2 um Pore SizeColumn PackingAuthoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) 卡套柱：帶可重復(fù)使用的末端卡套柱：帶可重復(fù)使用的末端接頭和一體化的保護(hù)柱柱芯接頭和一體化的保護(hù)柱柱芯無保護(hù)卡套柱芯無保護(hù)卡套柱芯有保護(hù)卡套柱芯有保護(hù)卡套柱芯帶帶Techtron 卡套柱芯的卡套柱芯的Zor

17、bax 保護(hù)柱保護(hù)柱Techtron 柱芯柱芯含一體化的濾芯含一體化的濾芯min5101520253035mAU140142.5145147.5150152.5155157.5160min5101520253035mAU140142.5145147.5150152.5155157.5160BDS ODS Hypersil 250 - 2 mm with integrated Guard ColumnBDS ODS Hypersil 250 - 2 mm without Guard Column2 mm 內(nèi)徑卡套柱有和無保護(hù)柱的比較內(nèi)徑卡套柱有和無保護(hù)柱的比較高效液相色譜柱發(fā)展史高效液相色譜柱發(fā)

18、展史19世紀(jì)70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：10 m 的無定型硅膠顆粒。70年代后期，發(fā)展了反相液相色譜。80年代，HPLC 被廣泛應(yīng)用于化合物的分離，主要填料：粒徑為5 10 m 球形硅膠。90年代早期，粒徑為 5 m 的高純硅膠，即所謂的 B 型硅膠被發(fā)展，并成為這個(gè)行業(yè)填料的標(biāo)準(zhǔn)，這種 B 型硅膠含有微量的金屬。90年代后期，為了滿足快速分離的需求，發(fā)展了 3 m 或 3.5 m 的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認(rèn)同和接受。21世紀(jì)早期，為適應(yīng)超快速的分離要求，粒徑小于 2 m 的填料被開發(fā)出來，發(fā)展出了整體柱、無機(jī)和有機(jī)雜化硅膠。目前，市場上流行的分析用的 HPL

19、C 硅膠基質(zhì)填料主要為 B 型硅膠。硅 膠基質(zhì)材料目前應(yīng)用最為廣泛的基質(zhì)材料。高機(jī)械強(qiáng)度和高的比表面積?？衫弥苯拥膹V泛的表面鍵合反應(yīng)來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。高效。重現(xiàn)性好。pH 適用范圍為pH 28。具有容易導(dǎo)致強(qiáng)堿性物質(zhì)拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基。聚合物基質(zhì)材料交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 穩(wěn)定性好：pH 1 13?？梢栽诤軐挼姆秶鷥?nèi)進(jìn)行表面化學(xué)處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求。在中等 pH 條件下對強(qiáng)堿性物質(zhì)具有更好的峰形。填料的體積隨著流動(dòng)相的不同而改變，如膨脹或收縮。分離效率相對硅膠而言比較

20、低重現(xiàn)性不好硅 膠 外 形球形硅膠: 現(xiàn)代 HPLC 填料粒徑小 (5 m, 3 m, 5 m柱床穩(wěn)定性差比表面積較小價(jià)格便宜硅 膠 純 度 硅膠純度對強(qiáng)極性化合物的分離最重要。 以前的純度較低的硅膠（稱為 A 型硅膠）, A 型硅膠是以金屬硅酸鹽制備而來，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的分離。 純度高、酸性較弱的硅膠 (稱為 B 型硅膠)，這種硅膠是以無金屬的工藝制備而來，只含有微量的金屬，建議用于分離離子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化合物。 金屬雜質(zhì)引起對螯合劑和堿性化合物的分離產(chǎn)生不對稱峰或拖尾峰。硅膠純度M+表面金屬能與螯合化合物絡(luò)合 M Si OH 內(nèi)部的

21、金屬對表面硅羥基具有活化作用強(qiáng)酸性A 型硅膠 C18B 型硅膠C18硅膠孔徑孔徑作用和效能 60 nm對 HPLC 分析沒有用，會(huì)引起峰形拖尾和較低的分離效率60 150 nm對小分子的分離效果理想 (MW 1,000 nm對聚合物的分離效果理想，如DNA和生物大分子硅 膠 粒 徑粒 徑作 用 和 效 能5 m目前應(yīng)用最廣泛，可以滿足從分析到半制備的分離3 3.5 m常用于分析柱上的快速分離，色譜柱短，節(jié)省溶劑 2 m常應(yīng)用于超快速分離， high throughput, 分離度高7 10 m常用于半制備色譜柱10 20 m常用于制備色譜柱HPLC 色譜柱結(jié)構(gòu)類 型內(nèi)徑D (cm)柱長(cm)

22、粒徑 (m)分析柱0.3 0.463 - 253 - 10微孔柱0.1, 0.2115, 253 - 8半制備柱0.8 1.010 - 255 - 20制備柱2.0 5.010 - 255 - 20鍵 合 相 鍵合相: 反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; Cyano, 5%, 苯基柱 1.2NormalTailingNormalTailing可能的原因:有些峰拖尾二次保留效應(yīng)，殘留的硅羥基影響二次保留效應(yīng)，殘留的硅羥基影響在大峰的尾部有小峰流出在大峰的尾部有小峰流出柱頭處有交叉污染柱頭處有交叉污染金屬影響金屬影響所有的峰都拖尾柱外效應(yīng)柱外效應(yīng)柱已損壞柱已損壞樣品量或溶劑不合

23、適樣品量或溶劑不合適柱過載，偶爾發(fā)生吸附曲線是反langmuir型色譜柱故障診斷色譜柱故障診斷- 峰形問題可能的原因柱過載，偶爾發(fā)生柱過載，偶爾發(fā)生小峰在大峰前流出小峰在大峰前流出NormalFronting伸舌峰對稱系數(shù) 硼酸鹽硼酸鹽 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑溶解速度增加隨溶解速度增加隨:柱壓升高 A 檢查有無色譜柱時(shí)的壓力：應(yīng)分段檢查；大多數(shù)情檢查有無色譜柱時(shí)的壓力：應(yīng)分段檢查；大多數(shù)情況下問題出在系統(tǒng)和保護(hù)柱上。況下問題出在系統(tǒng)和保護(hù)柱上。 A 如果確定是色譜柱的壓力高：如果確定是色譜柱的壓力高：B 沖洗柱沖洗柱 -除去柱污染物；大分子化合物；從樣品和除去柱污染物；大分子化合物；從樣品和緩沖溶液

24、帶來的污染物緩沖溶液帶來的污染物 B 反沖柱壓力高反沖柱壓力高-清洗柱入口濾片清洗柱入口濾片 （20%硝酸水溶液硝酸水溶液-水）水） 色譜柱的清洗 以下溶劑每種至少25 mL（25cmx4.6mm)反相色譜柱的沖洗用比流動(dòng)相強(qiáng)度大的溶劑反相色譜柱的沖洗用比流動(dòng)相強(qiáng)度大的溶劑 不含鹽的流動(dòng)相不含鹽的流動(dòng)相 100% 甲醇甲醇 100% 乙腈乙腈 75% 乙腈乙腈:25%異丙醇異丙醇 100%異丙醇異丙醇 100%二氯甲烷二氯甲烷* 100% 正己烷正己烷* When using either Hexane or Methylene Chloride the column must be flus

25、hed with Isopropanol before returning to your reversed-phase mobile phase.色譜柱的清洗 每種溶劑至少用每種溶劑至少用 50 mL ； 50% 甲醇甲醇 : 50% 氯仿氯仿 100% 乙酸乙酯；乙酸乙酯；100%所用流動(dòng)相（正己烷等所用流動(dòng)相（正己烷等）正相流動(dòng)相的選擇正相流動(dòng)相的選擇增強(qiáng)溶劑的強(qiáng)度增強(qiáng)溶劑的強(qiáng)度l在色譜柱安裝前、后測試壓力差l如果柱兩端的反壓很高，反接色譜柱，再用10-20倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱體后，再測試壓力差l如果出現(xiàn)沉淀， (如：蛋白質(zhì)凝聚，細(xì)胞物，聚合物)設(shè)法用相應(yīng)的可溶性溶劑，如0.1% TF

26、A / 80% 乙腈, 6M 鹽酸胍, THF, HFIP等清洗以除去堵塞物l若仍無效，應(yīng)考慮更換過濾片色譜柱的修復(fù)和再生色譜柱的修復(fù)和再生-物理性阻塞柱進(jìn)樣口柱進(jìn)樣口濾片濾片密封墊圈密封墊圈柱體柱體Female End FittingMale End Fitting操作注意事項(xiàng)：操作注意事項(xiàng)：l帶手套帶手套l填料不能變干填料不能變干l不要接觸色譜柱體不要接觸色譜柱體 l加熱填料會(huì)被擠出加熱填料會(huì)被擠出l不要擰得過緊不要擰得過緊色譜柱故障診斷色譜柱故障診斷更換進(jìn)樣口濾芯更換進(jìn)樣口濾芯由于鍵合相水解或硅膠溶解而造成的色譜柱填料變化是不可逆的l 由于污染而產(chǎn)生的色譜柱變化可以通過適當(dāng)?shù)南辞迨怪迯?fù)

27、l 梯度洗脫的方式 (水 - 強(qiáng)有機(jī)溶劑) 通常最有效l 低 pH 流動(dòng)相, 如 0.1% TFA 或 0.01M H3PO4, 也是有效的l 適當(dāng)升高溫度也有幫助 (60-80C)色譜柱的修復(fù)和再生色譜柱的修復(fù)和再生-化學(xué)變化-Il某些溶液，如6M鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素可用于清除蛋白質(zhì)的沉積l某些填料 (XDB, 有機(jī)聚合物)，可使用高pH 水/有機(jī)溶液，如：0.01M NaOH溶于50%異丙醇/水溶液。 硅膠基質(zhì)應(yīng)盡量減少接觸時(shí)間 (15-30 min)。色譜柱的修復(fù)和再生色譜柱的修復(fù)和再生-化學(xué)變化-II例子：4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18流速:

28、1 mL / min; 溫度: 80CA: 0.1% TFA 水溶液 B: 0.1% TFA 乙腈溶液100% A for 30 min.; 0-100% B over 30 min.; Hold 100% B for 30 min., Return to 100% A in 5 min.重復(fù)3次色譜柱日常維護(hù)(1)每日開機(jī)時(shí)，流速和柱壓要逐漸增加，突然迅速增加，會(huì)使柱床受到?jīng)_擊，引起紊亂，產(chǎn)生空隙。(2)在注射樣品前要使色譜系統(tǒng)平衡，是否平衡可由基線加以判斷。(3)在注射樣品前，用手摸一下色譜系統(tǒng)的各個(gè)接頭，通常由此能發(fā)現(xiàn)柱是否有漏；漏得不嚴(yán)重時(shí)，可以用皮膚是否有冷感加以判斷?？諝鈺?huì)從漏縫進(jìn)

29、入系統(tǒng)引起基線漂移，影響峰高和峰面積的重復(fù)性。 (4)不要把柱接頭擰得太緊。上得過緊容易損壞接頭螺紋，引起滲漏。擰螺絲時(shí)使用的扳手應(yīng)短一些，不宜太長。色譜柱日常維護(hù)(5)不要把柱子放在有氣流的地方或直接放在強(qiáng)光下，氣流和陽光都會(huì)使柱子產(chǎn)生溫度梯度，造成基線漂移，如果懷疑基線漂移是由溫度梯度引起的，可以設(shè)法使柱子絕熱或恒溫，也可用布(或毛巾)把柱和接頭包起來。 (6)如果儀器用來做常規(guī)分拆，樣品種類有限，但分析次數(shù)很多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長柱子的壽命。 (7)如果所注射的樣品會(huì)污染柱子，可以用合適的溶劑(幾百毫升)慢慢沖洗柱子過夜，第二天早晨再用流動(dòng)相重新平衡校子

30、(約30分鐘)。(8)在因裝卸、更換、貯存等而挪動(dòng)柱子時(shí)，動(dòng)作要輕，不要使其受到碰撞，以免柱床因震動(dòng)產(chǎn)生空隙或通道。(9)柱要加標(biāo)簽，新舊分開，不要放在溫度變化很大的地方。 當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈； 要注意流動(dòng)相的脫氣； 避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相； 進(jìn)樣樣品要提純； 嚴(yán)格控制進(jìn)樣量； 每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品； 每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；色譜柱維護(hù)色譜柱的良好使用規(guī)范溶劑使用前必須過濾溶劑使用前必須過濾避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相運(yùn)輸中變干了的

31、色譜柱，使用時(shí)要完全浸濕運(yùn)輸中變干了的色譜柱，使用時(shí)要完全浸濕了解樣品溶劑對溶解度及分離的影響了解樣品溶劑對溶解度及分離的影響進(jìn)樣樣品要提純，如果樣品中含有無需考慮而保留強(qiáng)的進(jìn)樣樣品要提純，如果樣品中含有無需考慮而保留強(qiáng)的組分時(shí)組分時(shí), ,必須進(jìn)行前處理必須進(jìn)行前處理嚴(yán)格控制進(jìn)樣量嚴(yán)格控制進(jìn)樣量清楚了解色譜柱填料適用的清楚了解色譜柱填料適用的: pH: pH范圍，溫度，化學(xué)適應(yīng)范圍，溫度，化學(xué)適應(yīng)性性色譜柱的良好使用規(guī)范當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈避免操作不當(dāng)損壞色譜柱避免操作不當(dāng)損壞色譜柱, ,如如: :猛敲猛敲, ,跌落或過緊

32、擰接頭跌落或過緊擰接頭定期用強(qiáng)極性溶劑沖洗色譜柱定期用強(qiáng)極性溶劑沖洗色譜柱使用新鮮的水溶液使用新鮮的水溶液, ,要注意使用生物穩(wěn)定劑要注意使用生物穩(wěn)定劑, ,如疊氮化鈉如疊氮化鈉每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗刻旆治鰷y定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗舴治鲋L期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉柱子維護(hù)卸下柱子和入口接頭，可看到接頭孔隙。如果柱頭孔隙深度小于1厘米，可以來用下述局部重裝的辦法，否則，柱應(yīng)當(dāng)完全重裝或更換。 柱入口局部重裝時(shí)采用的填

33、料可以和柱內(nèi)原有填料一樣，也可以用玻璃珠。 粒子大于20微米的可以用敲打充填法干裝。如果小于20微米則要用合適的溶劑配成淤漿，淤漿逐次加入，每次加入前都要使上一次加入的全部沉降。把孔隙填滿后，用一把刮刀將續(xù)料刮乎更換柱入口接頭，把柱重新接到液相色譜系統(tǒng)中，慢慢地增加流速和系統(tǒng)壓力，直到操作上限為止。讓相當(dāng)于l0一20倍柱體積的流動(dòng)相通過柱子，然后逐漸降低柱流速，并使壓力降為零，再把柱子卸下來，并卸下入口接頭，觀察柱的入口，此時(shí)孔隙應(yīng)當(dāng)減小，但是由于新加入的填料在系統(tǒng)的操作壓力下壓縮柱頭，孔隙不可能一次就被全部充滿。重復(fù)上述局部至裝過程，直到柱上加不進(jìn)更多的粒子為止。一旦柱子填充完畢，可加進(jìn)混合

34、樣品，測定柱子的性能是否已經(jīng)改善。柱維護(hù) 對于嚴(yán)重污染的反相住，也可采用這樣的辦法：用泵依次打入水甲醇-二氯甲烷-己烷，然后把此順序倒過來再打一遍，最后到水，不接檢測器。 如果分析類脂化合物，也可使用易溶解油脂的溶劑如50ml二氯甲烷然后是50毫升甲醇。 其它有機(jī)物，如乙醚、四氫呋喃和二甲基亞砜也能用來清洗反相柱。另外也可使用絡(luò)合溶劑如EDTA二鈉等。 在任何洗滌中，升高溫度都能加速雜質(zhì)的溶解。檢測器 紫外檢測器紫外檢測器 示差檢測器 熒光檢測器 電化學(xué)檢測器 電導(dǎo)檢測器 蒸發(fā)光散射檢測器 質(zhì)譜液相色譜的檢測模式液相色譜的檢測模式示示差差折折光光電電導(dǎo)導(dǎo)紫紫外外熒熒光光電電化化學(xué)學(xué)響響應(yīng)應(yīng)通用選擇性選擇性選擇性選擇性靈靈敏敏度度毫克納克納克PicogramPicogram線線性性范范圍圍流流速速敏敏感感是是否否是溫溫度度敏敏感感是是否否是梯梯度度淋淋洗洗不可有限制可以可以脈沖的可以104106105