核酸的分離與純化實(shí)用教案

1、背景(bijng)核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸提取也成為了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的最重要、最基本的操作。核酸提取亦是臨床分子診斷最關(guān)鍵的操作，直接(zhji)關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗與否，是臨床分子診斷容易發(fā)生問題步驟。 第1頁/共28頁第一頁，共29頁。核酸(h sun)的存在形式DNA：細(xì)胞核DNP 線粒體 環(huán)狀DNARNA：細(xì)胞質(zhì)中，mRNA，rRNA，tRNA 通常與蛋白質(zhì)結(jié)合( jih)，形成RNP第2頁/共28頁第二頁，共29頁。核酸的理化(lhu)性質(zhì) DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們

2、的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液(rngy)。在酸性溶液(rngy)中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液(rngy)中較穩(wěn)定。 DNP在低濃度鹽溶液(rngy)中，幾乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。 RNP在鹽溶液(rngy)中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在氯化鈉中溶解度較大。第3頁/共28頁第三頁，共29頁。核酸(h sun)提取方法核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物

3、質(zhì)分開。核酸提取(tq)時(shí)應(yīng)遵循以下原則: 1、保證核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性; 2、排除其他分子污染。 第4頁/共28頁第四頁，共29頁。核酸(h sun)提取方法大多數(shù)核酸分離與純化的方法一般(ybn)都包括： 細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化 每一步驟又可由多種不同的方法單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。 第5頁/共28頁第五頁，共29頁。核酸(h sun)提取方法細(xì)胞裂解細(xì)胞(xbo)裂解可通過以下幾種方法實(shí)現(xiàn)： 物理作用 化學(xué)作用 酶作用 （生物作用）第6頁/共28頁第六頁，共29頁。核酸(h sun)提取方法細(xì)胞裂解物理作用：包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎

4、等方法(fngf)。這些方法(fngf)用機(jī)械力使細(xì)胞破碎,但機(jī)械力也可引起核酸鏈的斷裂,因而不適用于高分子量長(zhǎng)鏈核酸的分離。 超聲裂解法提取的核酸片段長(zhǎng)度從 20kb 之間,而顆粒勻漿法提取的核酸一般 10kb。 第7頁/共28頁第七頁，共29頁。核酸(h sun)提取方法細(xì)胞裂解化學(xué)作用：變性： 加熱、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100 、Tween- 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或強(qiáng)離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍) 堿性pH環(huán)境：強(qiáng)堿(NaOH) 或堿性緩沖液 ( TE、STE 等) 在一定的p H 環(huán)境下,表面活性

5、劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,核酸釋放到水相；某些緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對(duì)核酸酶活性所必須(bx)的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護(hù)核酸不被降解。 第8頁/共28頁第八頁，共29頁。核酸提取(tq)方法細(xì)胞裂解酶作用（生物作用）：主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細(xì)胞破裂(pli),核酸釋放。 蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),促進(jìn)核酸的分離。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 及有ED

6、TA、尿素(14mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時(shí)仍保留酶活性,這有利于提高對(duì)高分子量核酸的提取效率。 第9頁/共28頁第九頁，共29頁。核酸提取(tq)方法酶處理在核酸提取過程中,可通過加入適當(dāng)?shù)拿甘共恍枰奈镔|(zhì)降解,以利于核酸的分離與純化(chn hu)。 如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì),滅活核酸酶(DNase 和RNase)； 或者加入DNase 或RNase 去除不需要的DNA或RNA。 第10頁/共28頁第十頁，共29頁。核酸提取(tq)方法分離與純化 酚氯仿法酚氯仿法 簡(jiǎn)介：簡(jiǎn)介：1976，S

7、tafford及其同事創(chuàng)立。現(xiàn)已經(jīng)不斷改進(jìn)。及其同事創(chuàng)立?，F(xiàn)已經(jīng)不斷改進(jìn)。 關(guān)鍵技術(shù)：關(guān)鍵技術(shù)： 酚的使用酚的使用 用酚來分離核酸首先是用酚來分離核酸首先是Kirty，1956年首次報(bào)道。當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)酚可以年首次報(bào)道。當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)酚可以(ky)從水相中抽提蛋白質(zhì)，使用陰離子鹽時(shí)，可以從水相中抽提蛋白質(zhì)，使用陰離子鹽時(shí)，可以(ky)實(shí)現(xiàn)核酸分配在水相，實(shí)現(xiàn)核酸分配在水相，而蛋白質(zhì)在有機(jī)相。而蛋白質(zhì)在有機(jī)相。第11頁/共28頁第十一頁，共29頁。核酸提取(tq)方法分離與純化酚氯仿酚氯仿(l fn)法法第12頁/共28頁第十二頁，共29頁。核酸提取方法(fngf)分離與純化 酚氯仿法酚氯仿法 酚的準(zhǔn)備酚的

8、準(zhǔn)備(zhnbi) 重蒸酚重蒸酚(去除可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致去除可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和和DNA的交聯(lián)的交聯(lián)的醌類氧化物）；的醌類氧化物）； 加入加入8一羥基喹嚀，以防止酚氧化，（酚氧化發(fā)黃，而氧化的酚一羥基喹嚀，以防止酚氧化，（酚氧化發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)）；可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)）； 水飽和酚、平衡水飽和酚、平衡PH（大于）（不飽和的酚能與（大于）（不飽和的酚能與15%其提及的水其提及的水互溶，從而降低水相中核酸產(chǎn)量）互溶，從而降低水相中核酸產(chǎn)量） 發(fā)展和改進(jìn)：發(fā)展和改進(jìn)： SDS取代陰離子鹽取代陰離子鹽 酚：氯仿混

9、合液（增加了對(duì)糖、脂的溶解）酚：氯仿混合液（增加了對(duì)糖、脂的溶解） 異戊醇的使用（減少泡沫、使異戊醇的使用（減少泡沫、使RNase失活）失活）第13頁/共28頁第十三頁，共29頁。核酸提取(tq)方法分離與純化酚氯仿法酚氯仿法裂解緩沖液（異硫氰酸胍）處理裂解緩沖液（異硫氰酸胍）處理蛋白酶蛋白酶K消化，（根據(jù)需要亦可加入消化，（根據(jù)需要亦可加入Dnase或或RNAase）50:48:2苯酚苯酚:氯仿氯仿:異戊醇混合液，與等量的裂解處理液混合，依據(jù)應(yīng)用目的異戊醇混合液，與等量的裂解處理液混合，依據(jù)應(yīng)用目的,兩相兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸適用于分離小分子量核酸) 或簡(jiǎn)單

10、顛倒混勻或簡(jiǎn)單顛倒混勻(適用于分離高適用于分離高分子量核酸分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相,核酸則被留于上核酸則被留于上層水相。層水相。轉(zhuǎn)移水相，重復(fù)步驟轉(zhuǎn)移水相，重復(fù)步驟3，直至滿意為止。，直至滿意為止。核酸沉淀，在含核酸的水相中加入核酸沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 05. 5 ,終濃度為終濃度為0. 3M 的的NaAc 或或KAc 后后,鈉離子會(huì)中和核酸磷酸骨架上的負(fù)電荷鈉離子會(huì)中和核酸磷酸骨架上的負(fù)電荷,在酸性在酸性(sun xn)環(huán)境中環(huán)境中促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性。然后加入促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性。然后加入23倍體積的預(yù)冷的無

11、水乙醇倍體積的預(yù)冷的無水乙醇,經(jīng)一定時(shí)間經(jīng)一定時(shí)間的孵育的孵育,可使核酸有效地沉淀?？墒购怂嵊行У爻恋?。14000g離心離心30分鐘分鐘室溫，或者如果產(chǎn)量較大可直接用玻璃鉤子取出。室溫，或者如果產(chǎn)量較大可直接用玻璃鉤子取出。70%乙醇洗滌乙醇洗滌2-3次，即可將沉淀溶于次，即可將沉淀溶于TE保存。保存。第14頁/共28頁第十四頁，共29頁。核酸(h sun)提取方法分離與純化酚氯仿法酚氯仿法純度高，純度高，RNA回收效率極高，尤其是回收效率極高，尤其是200bp的的RNA，比如：，比如：siRNA，miRNA，mRNA和和tRNA等等除核酸外，可提取蛋白質(zhì)除核酸外，可提取蛋白質(zhì)耗時(shí)，繁瑣，不利

12、于自動(dòng)化。耗時(shí)，繁瑣，不利于自動(dòng)化。正式正式(zhngsh)名稱：異硫氰酸胍名稱：異硫氰酸胍-酚酚-氯仿核酸提取法氯仿核酸提取法 By Piotr Chomczynski and Nicoletta Sacchi 1987第15頁/共28頁第十五頁，共29頁。核酸提取方法(fngf)分離與純化鹽析法鹽析法-miller1、細(xì)胞裂解同前述；、細(xì)胞裂解同前述；2、加入、加入2體積的體積的6mol/L的的NaCl，與，與3體積的細(xì)胞裂解液混合，震蕩混勻，體積的細(xì)胞裂解液混合，震蕩混勻，2500rmp離心離心1520min，此時(shí)，此時(shí)DNP溶解溶解(rngji)于上清中，蛋白質(zhì)、于上清中，蛋白質(zhì)、RN

13、A等位于離等位于離心管底部；心管底部；3、小心轉(zhuǎn)移上清，同前步驟用乙醇沉淀法進(jìn)一步純化。、小心轉(zhuǎn)移上清，同前步驟用乙醇沉淀法進(jìn)一步純化。第16頁/共28頁第十六頁，共29頁。核酸提取(tq)方法分離與純化鹽析法鹽析法-NaAC1、細(xì)胞裂解同前述；并加入蛋白酶、細(xì)胞裂解同前述；并加入蛋白酶K消化消化2、加入、加入1/10體積的體積的3mol/L的的NaAC，與，與1體積的細(xì)胞裂解液混合，震蕩混勻，體積的細(xì)胞裂解液混合，震蕩混勻，-20孵育孵育 15 min；臺(tái)式離心機(jī)最大速度離心；臺(tái)式離心機(jī)最大速度離心1520min；3、小心轉(zhuǎn)移上清，同前步驟、小心轉(zhuǎn)移上清，同前步驟(bzhu)用乙醇沉淀法進(jìn)一

14、步純化。用乙醇沉淀法進(jìn)一步純化。第17頁/共28頁第十七頁，共29頁。核酸提取(tq)方法分離與純化鹽析法鹽析法產(chǎn)量較低，但方法簡(jiǎn)單產(chǎn)量較低，但方法簡(jiǎn)單(jindn)，比較酚氯仿方法無化學(xué)危害；，比較酚氯仿方法無化學(xué)危害；同樣不適合大規(guī)模自動(dòng)化提取。同樣不適合大規(guī)模自動(dòng)化提取。提取好的提取好的DNA用蛋白酶處理純度會(huì)提高。用蛋白酶處理純度會(huì)提高。第18頁/共28頁第十八頁，共29頁。核酸提取方法(fngf)分離與純化硅膠吸附法硅膠吸附法1、細(xì)胞裂解、細(xì)胞裂解(li ji)和酶處理同前述；和酶處理同前述；2、處理好的裂解、處理好的裂解(li ji)液轉(zhuǎn)入硅膠離心柱，高速離心，利用硅膠可以吸附核酸

15、而不能與液轉(zhuǎn)入硅膠離心柱，高速離心，利用硅膠可以吸附核酸而不能與其它物質(zhì)如蛋白質(zhì)，脂類等結(jié)合的特點(diǎn)，洗脫這類雜質(zhì)；其它物質(zhì)如蛋白質(zhì)，脂類等結(jié)合的特點(diǎn)，洗脫這類雜質(zhì)；3、重復(fù)洗滌，提高純度，最后用核酸洗脫液獲得核酸。、重復(fù)洗滌，提高純度，最后用核酸洗脫液獲得核酸。裂解(li ji)液；洗滌液；洗脫液裝入位置硅膠層液體流出管道第19頁/共28頁第十九頁，共29頁。核酸提取方法(fngf)分離與純化硅膠硅膠(u jio)吸附法吸附法產(chǎn)量較低，純度很好；產(chǎn)量較低，純度很好；也能造成大片段核酸的損傷；也能造成大片段核酸的損傷；對(duì)極小片段核酸提取不夠好；對(duì)極小片段核酸提取不夠好；簡(jiǎn)單方便，可進(jìn)行自動(dòng)化處理

16、。簡(jiǎn)單方便，可進(jìn)行自動(dòng)化處理。第20頁/共28頁第二十頁，共29頁。核酸提取(tq)方法分離與純化磁性硅膠磁性硅膠(u jio)吸附法吸附法1、細(xì)胞裂解和酶處理同前述；、細(xì)胞裂解和酶處理同前述；2、處理好的裂解液與磁性硅膠、處理好的裂解液與磁性硅膠(u jio)顆?；靹?，孵育約顆?；靹颍跤s30分鐘，使裂解液中分鐘，使裂解液中的核酸物質(zhì)與硅膠的核酸物質(zhì)與硅膠(u jio)粘附；粘附；3、利用磁力架固定吸附了核酸的硅膠、利用磁力架固定吸附了核酸的硅膠(u jio)顆粒；吸盡管中的液體，加入洗顆粒；吸盡管中的液體，加入洗滌液重復(fù)本次步驟滌液重復(fù)本次步驟2次。次。4、洗脫液收獲核酸。、洗脫液收獲核

17、酸。第21頁/共28頁第二十一頁，共29頁。核酸提取方法(fngf)分離與純化磁性硅膠吸附法磁性硅膠吸附法產(chǎn)量較好，純度很好；產(chǎn)量較好，純度很好；成本成本(chngbn)較低，無特殊耗材；較低，無特殊耗材；可通過設(shè)計(jì)特異探針附著于硅膠顆粒，從而可捕獲特異物種的核酸成分；可通過設(shè)計(jì)特異探針附著于硅膠顆粒，從而可捕獲特異物種的核酸成分；可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化作業(yè)。可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化作業(yè)。第22頁/共28頁第二十二頁，共29頁。核酸提取方法分離(fnl)與純化加熱煮沸法加熱煮沸法1、高速離心富集含核酸物質(zhì)；、高速離心富集含核酸物質(zhì)；2、加入促細(xì)胞、加入促細(xì)胞(xbo)裂解的化學(xué)物質(zhì)（裂解的化學(xué)物質(zhì)（SDS、Trit

18、on X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 ）等；加入蛋白酶）等；加入蛋白酶K消化一段時(shí)間，也可不加，直接消化一段時(shí)間，也可不加，直接95以上加熱以上加熱10分鐘左右；分鐘左右；3、高速離心，上清中的、高速離心，上清中的DNA即可用于即可用于PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。第23頁/共28頁第二十三頁，共29頁。核酸提取方法(fngf)分離與純化加熱煮沸法加熱煮沸法只能只能(zh nn)用于用于DNA提取；一般僅用于血清或體液中病原體提?。灰话銉H用于血清或體液中病原體DNA的提?。坏奶崛?；成本最低，臨床應(yīng)用最廣；成本最低，臨床應(yīng)用最廣；純度低，

19、產(chǎn)量低；除了純度低，產(chǎn)量低；除了PCR外不能直接用于其它分子生物學(xué)操作；外不能直接用于其它分子生物學(xué)操作；純手工操作，臨床純手工操作，臨床PCR工作中最易出問題的環(huán)節(jié)。工作中最易出問題的環(huán)節(jié)。第24頁/共28頁第二十四頁，共29頁。核酸提取方法分離(fnl)與純化RNA提取應(yīng)該注意提取應(yīng)該注意(zh y)的問題：的問題：無處不在的無處不在的RNase，比較耐高溫，不易失活；，比較耐高溫，不易失活；解決的辦法：解決的辦法：1、用于分離、用于分離RNA的耗材，如有可能必須采用高壓滅菌；的耗材，如有可能必須采用高壓滅菌；2、用于分離、用于分離RNA的試劑盡量采用的試劑盡量采用DEPC水配制，（水配制，（DEPC是是RNase的強(qiáng)烈抑制劑）的強(qiáng)烈抑制劑）3、操作人員務(wù)必佩戴一次性乳膠手套操作、操作人員務(wù)必佩戴一次性乳膠手套操作RNA的提