第5章表達(dá)載體2014

1、1第五章第五章 表達(dá)載體表達(dá)載體第一節(jié)第一節(jié) 大腸桿菌表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體 第二節(jié)第二節(jié) 穿梭載體穿梭載體第三節(jié)第三節(jié) 整合載體整合載體2表達(dá)載體構(gòu)建的一般原則表達(dá)載體構(gòu)建的一般原則1 1、閱讀框架、閱讀框架要使目的基因得以表達(dá)，最重要的因素是外源目的要使目的基因得以表達(dá)，最重要的因素是外源目的基因本身必須置于正確的基因本身必須置于正確的閱讀框架閱讀框架之中。之中。用人工接頭可以調(diào)節(jié)閱讀框架，選擇適當(dāng)?shù)娜斯そ佑萌斯そ宇^可以調(diào)節(jié)閱讀框架，選擇適當(dāng)?shù)娜斯そ宇^，就可使外源基因處于正確的閱讀框架中。頭，就可使外源基因處于正確的閱讀框架中。32 2、啟動(dòng)子（關(guān)鍵因素）、啟動(dòng)子（關(guān)鍵因素） 有效的轉(zhuǎn)錄

2、起始是外源基因能否在宿主細(xì)胞有效的轉(zhuǎn)錄起始是外源基因能否在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)的關(guān)鍵步驟之一。中高效表達(dá)的關(guān)鍵步驟之一。 因此，選擇因此，選擇強(qiáng)的啟動(dòng)子及其相關(guān)的調(diào)控序列強(qiáng)的啟動(dòng)子及其相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)高效表達(dá)載體首先要考慮的問(wèn)題。，是構(gòu)建一個(gè)高效表達(dá)載體首先要考慮的問(wèn)題。4 3 3、轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止、轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止 外源基因的轉(zhuǎn)錄一旦被起始，接下來(lái)的問(wèn)題是如何外源基因的轉(zhuǎn)錄一旦被起始，接下來(lái)的問(wèn)題是如何保證保證mRNAmRNA有效地有效地延伸、終止延伸、終止。轉(zhuǎn)錄衰減轉(zhuǎn)錄衰減和和非特異性終止非特異性終止可誘發(fā)轉(zhuǎn)錄提前終止?？烧T發(fā)轉(zhuǎn)錄提前終止。措施：措施： （1 1）除去衰減子

3、）除去衰減子 （2 2）插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列）插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列 （3 3）強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列）強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列54 4、有效的翻譯起始（關(guān)鍵因素）、有效的翻譯起始（關(guān)鍵因素） 原核原核：SD序列，能幫助從起始序列，能幫助從起始AUG處開(kāi)始翻譯。處開(kāi)始翻譯。 真核：真核：kozak（科扎克科扎克）序列，核糖體能夠識(shí)別）序列，核糖體能夠識(shí)別mRNA上的這段序列，并把它作為翻譯起始位點(diǎn)。上的這段序列，并把它作為翻譯起始位點(diǎn)。5 5、翻譯終止密碼選擇、翻譯終止密碼選擇 在原核生物中，翻譯的終止由兩個(gè)釋放因子所控在原核生物中，翻譯的終止由兩個(gè)釋放因子所控制，制，RF1識(shí)別識(shí)別UAA和和UAG，RF2識(shí)別識(shí)別U

4、AA和和UGA。由于由于UAA為兩個(gè)釋放因子所識(shí)別，因此在基因工程為兩個(gè)釋放因子所識(shí)別，因此在基因工程中，一般采用中，一般采用UAA作為終止碼。作為終止碼。66 6、外源蛋白的穩(wěn)定性、外源蛋白的穩(wěn)定性可采取以下措施避免克隆的蛋白被選擇性降解：可采取以下措施避免克隆的蛋白被選擇性降解：（1 1）構(gòu)建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白，使外源蛋白不被）構(gòu)建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白，使外源蛋白不被選擇性降解選擇性降解（2 2）構(gòu)建成可分泌的蛋白：）構(gòu)建成可分泌的蛋白：不是所有的外源蛋白都可不是所有的外源蛋白都可以通過(guò)基因操作成為可分泌蛋白以通過(guò)基因操作成為可分泌蛋白。（3 3）使外源蛋白在宿主細(xì)胞中以包涵體的形式

5、表達(dá)）使外源蛋白在宿主細(xì)胞中以包涵體的形式表達(dá)7總之，構(gòu)建表達(dá)載體應(yīng)根據(jù)表達(dá)體系的特性，選總之，構(gòu)建表達(dá)載體應(yīng)根據(jù)表達(dá)體系的特性，選擇性地應(yīng)用上述原則，刪除降低外源基因表達(dá)的擇性地應(yīng)用上述原則，刪除降低外源基因表達(dá)的一些元件，插入提高外源基因表達(dá)的一些必需元一些元件，插入提高外源基因表達(dá)的一些必需元件。件。8大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì) 全基因組測(cè)序，共有全基因組測(cè)序，共有44054405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架個(gè)開(kāi)放型閱讀框架 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國(guó)被美國(guó)FDA(F

6、DA(美國(guó)食品藥物管理局美國(guó)食品藥物管理局) )批準(zhǔn)為安全的基因工程批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物受體生物第一節(jié)第一節(jié) 大腸桿菌表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體9大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì) 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素10一、大腸桿菌表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)一、大腸桿菌表達(dá)載體的結(jié)構(gòu) 原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體：適用于在原核細(xì)胞中表達(dá)：適用于在原核

7、細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。外源基因的載體。 均是均是質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體，首先必然滿足克隆載體的，首先必然滿足克隆載體的基本要求，然后增加表達(dá)元件?；疽?，然后增加表達(dá)元件。111、表達(dá)元件、表達(dá)元件(expression elements)1）啟動(dòng)子）啟動(dòng)子(promoter)：三類(lèi)，即：三類(lèi)，即lac啟動(dòng)子、啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子和它們的雜合啟動(dòng)子啟動(dòng)子和它們的雜合啟動(dòng)子tac或或trc，都受都受IPTG誘導(dǎo)。誘導(dǎo)。T7噬菌體啟動(dòng)子噬菌體啟動(dòng)子噬菌體的噬菌體的PL啟動(dòng)子。啟動(dòng)子。2）終止子）終止子：依賴(lài)于：依賴(lài)于因子或不依賴(lài)于因子或不依賴(lài)于因子（遇莖環(huán)因子（遇莖環(huán)結(jié)構(gòu)而終止）。結(jié)構(gòu)而終止）。3

8、 3）核糖體結(jié)合位點(diǎn)）核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding side, RBS)(ribosome binding side, RBS)：是是mRNAmRNA上的特異性序列，核糖體可以識(shí)別并結(jié)合這上的特異性序列，核糖體可以識(shí)別并結(jié)合這一序列來(lái)一序列來(lái)啟動(dòng)翻譯過(guò)程啟動(dòng)翻譯過(guò)程。2、表達(dá)形式、表達(dá)形式完整單一蛋白完整單一蛋白：?jiǎn)我换虻木幋a區(qū)表達(dá)。：?jiǎn)我换虻木幋a區(qū)表達(dá)。融合蛋白融合蛋白(fusion protein)：多個(gè)基因的編：多個(gè)基因的編碼區(qū)的串聯(lián)體，但構(gòu)成一個(gè)整體的單一碼區(qū)的串聯(lián)體，但構(gòu)成一個(gè)整體的單一ORF，如果融合如果融合標(biāo)簽蛋白標(biāo)簽蛋白有利于蛋白的定向、純化，如有利于蛋

9、白的定向、純化，如果融合果融合多個(gè)目標(biāo)蛋白多個(gè)目標(biāo)蛋白，則類(lèi)似于直接表達(dá)了一個(gè)，則類(lèi)似于直接表達(dá)了一個(gè)多酶復(fù)合體一樣，可減少載體構(gòu)建難度，而且可多酶復(fù)合體一樣，可減少載體構(gòu)建難度，而且可以偶連兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)。以偶連兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)。12133、表達(dá)的控制、表達(dá)的控制誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：IPTG防滲漏表達(dá)系統(tǒng)：防滲漏表達(dá)系統(tǒng)：lacIq，一種一種能產(chǎn)生能產(chǎn)生過(guò)量的過(guò)量的 LacI 阻阻遏蛋白遏蛋白（阻遏轉(zhuǎn)錄過(guò)程）（阻遏轉(zhuǎn)錄過(guò)程）的的 lacI 基因的突變體?；虻耐蛔凅w。PL啟動(dòng)子啟動(dòng)子受受c基因（阻遏溶菌周期基因表達(dá)）產(chǎn)物基因（阻遏溶菌周期基因表達(dá)）產(chǎn)物的抑制，在的抑

10、制，在噬菌體溶原的大腸桿菌中表達(dá)。噬菌體溶原的大腸桿菌中表達(dá)。c基因的溫度敏感突變體基因的溫度敏感突變體cI857（ts）：低溫）：低溫(30)下下阻抑轉(zhuǎn)錄，高溫阻抑轉(zhuǎn)錄，高溫(40-45)下解除抑制。下解除抑制。T7噬菌體啟動(dòng)子噬菌體啟動(dòng)子：較復(fù)雜：較復(fù)雜二、利用二、利用T7噬菌體啟動(dòng)子的表達(dá)載體噬菌體啟動(dòng)子的表達(dá)載體大腸桿菌大腸桿菌 T7 噬菌體具有一套噬菌體具有一套專(zhuān)一性非常強(qiáng)專(zhuān)一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱(chēng)為的表達(dá)系統(tǒng)稱(chēng)為 T7 表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)。14 T7 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng) T7噬菌體基因噬菌體基因1編碼的

11、編碼的T7 RNA聚合酶聚合酶選擇性選擇性的激活的激活T7噬菌體啟動(dòng)子噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。的轉(zhuǎn)錄。 T7 RNA聚合酶活性高，其合成聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸的速度比大腸桿菌桿菌RNA聚合酶快聚合酶快5倍倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。 15T7 表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄完全依賴(lài)于噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄完全依賴(lài)于 T7 RNA 聚合酶，因此聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控

12、方式。 化學(xué)誘導(dǎo)型化學(xué)誘導(dǎo)型 溫度誘導(dǎo)型溫度誘導(dǎo)型 雙質(zhì)粒系統(tǒng)雙質(zhì)粒系統(tǒng)T7 RNA 聚合酶T7 啟動(dòng)子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因？啟動(dòng)子16化學(xué)誘導(dǎo)型化學(xué)誘導(dǎo)型 噬菌體噬菌體 DE3 DE3 是是噬菌體噬菌體的衍生株，一段含有的衍生株，一段含有 lacIlacI啟啟動(dòng)子和動(dòng)子和T7 RNA T7 RNA 聚合酶基因聚合酶基因的的DNA DNA 片段被插入其中。片段被插入其中。 用噬菌體用噬菌體DE3DE3的溶源菌作的溶源菌作為表達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方為表達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為式為化學(xué)誘導(dǎo)型化學(xué)誘導(dǎo)型，類(lèi)似于，類(lèi)似于 Lac Lac 表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)。 T7 RNA 聚合酶基因

13、 lac 啟動(dòng)子E.Coli （DE3）T7 啟動(dòng)子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)型溫度誘導(dǎo)型 P PL L 啟動(dòng)子控制啟動(dòng)子控制T7 RNA T7 RNA 聚聚合酶基因，通過(guò)熱誘導(dǎo)方式激合酶基因，通過(guò)熱誘導(dǎo)方式激發(fā)發(fā)T7 T7 噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到很低的水平，尤其適用于降到很低的水平，尤其適用于表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒性的表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì)。重組蛋白質(zhì)。 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動(dòng)子E.Coli （CE6）T7 啟動(dòng)子 目的基因T7 RNA 聚合酶熱誘導(dǎo)cI857雙質(zhì)粒系統(tǒng)雙質(zhì)

14、粒系統(tǒng) 一個(gè)質(zhì)粒帶有一個(gè)質(zhì)粒帶有 T7 RNA T7 RNA 聚合酶基因，另一個(gè)質(zhì)粒帶聚合酶基因，另一個(gè)質(zhì)粒帶有有 T7 T7 啟動(dòng)子和目的基因啟動(dòng)子和目的基因 兩個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制子和抗兩個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記不能相同，調(diào)控方式性標(biāo)記不能相同，調(diào)控方式為控制為控制 T7 RNA T7 RNA 聚合酶的啟聚合酶的啟動(dòng)子調(diào)控類(lèi)型動(dòng)子調(diào)控類(lèi)型T7 RNA 聚合酶熱誘導(dǎo)T7 啟動(dòng)子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動(dòng)子 cI857 p15A ori KanRColE1 ori AmpR19T7 表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題 T7 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目

15、的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的，但也不可避免出現(xiàn)在相對(duì)較高的系統(tǒng)中最高的，但也不可避免出現(xiàn)在相對(duì)較高的本底本底轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄，如果目的基因產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌宿主有毒性，會(huì)，如果目的基因產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌宿主有毒性，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。 解決辦法解決辦法 在表達(dá)系統(tǒng)中在表達(dá)系統(tǒng)中低水平表達(dá)低水平表達(dá) T7 溶菌酶基因，溶菌酶基因，能與能與T7 RNA 聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。通過(guò)共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。通過(guò)共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉(zhuǎn)錄。導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉(zhuǎn)錄。 20表達(dá)融合蛋白有下列優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)融合蛋白有下列優(yōu)點(diǎn)： (1)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始從轉(zhuǎn)錄和

16、翻譯起始從正常的正常的E. coli序列序列開(kāi)始，故開(kāi)始，故通?？梢援a(chǎn)生通?？梢援a(chǎn)生高水平高水平的融合蛋白。的融合蛋白。 (2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加穩(wěn)定穩(wěn)定。 (3)產(chǎn)生的融合蛋白較產(chǎn)生的融合蛋白較大大，因此很容易從蛋白質(zhì)凝，因此很容易從蛋白質(zhì)凝膠電泳中區(qū)別出來(lái)。融合蛋白帶可以從凝膠上切膠電泳中區(qū)別出來(lái)。融合蛋白帶可以從凝膠上切下，經(jīng)冷凍干燥，磨成粉末后即可作為抗原。下，經(jīng)冷凍干燥，磨成粉末后即可作為抗原。 (4)有些融合蛋白帶有有些融合蛋白帶有信號(hào)肽信號(hào)肽，可以分泌到細(xì)胞外，可以分泌到細(xì)胞外，這有助于蛋白質(zhì)的分離和純化。這有助于蛋白質(zhì)的分離和純化。

17、三、表達(dá)融合蛋白的表達(dá)載體三、表達(dá)融合蛋白的表達(dá)載體2122 融合型表達(dá)載體融合型表達(dá)載體PSDForeign DNA融合型表達(dá)載體融合型表達(dá)載體融合基因融合基因23技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因可插入標(biāo)簽肽序列的：克隆基因可插入標(biāo)簽肽序列的3 3或或5 5端，端，但必須維持但必須維持正確的正確的ORFORF。選擇合適酶切位點(diǎn)選擇合適酶切位點(diǎn)加人工合成的加人工合成的DNA接頭接頭構(gòu)建位相載體構(gòu)建位相載體24位相載體位相載體-含有含有3種讀碼框的系列載體種讀碼框的系列載體25常用的融合表達(dá)載體常用的融合表達(dá)載體1 1、GST (glutahione S-transferase, GST (gluta

18、hione S-transferase, 谷胱苷肽谷胱苷肽S-S-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶) )表達(dá)載體表達(dá)載體：如：如AmershamAmersham公司公司( (阿莫仙醫(yī)藥公司阿莫仙醫(yī)藥公司) )的的pGEXpGEX系列，系列，其其GSTGST來(lái)自于來(lái)自于血吸蟲(chóng)血吸蟲(chóng)，融合蛋白下，融合蛋白下保持酶學(xué)活性保持酶學(xué)活性，對(duì)谷胱，對(duì)谷胱苷肽有苷肽有很強(qiáng)的結(jié)合能力很強(qiáng)的結(jié)合能力，融合蛋白純化出來(lái)后用凝血蛋白，融合蛋白純化出來(lái)后用凝血蛋白酶切割可得到純的目的蛋白。酶切割可得到純的目的蛋白。谷胱甘肽谷胱甘肽固定在瓊脂糖樹(shù)脂上固定在瓊脂糖樹(shù)脂上形成親和層析柱形成親和層析柱表達(dá)融合蛋白的全細(xì)胞提取物通過(guò)層析柱表達(dá)融合

19、蛋白的全細(xì)胞提取物通過(guò)層析柱融合蛋白吸附在樹(shù)脂上融合蛋白吸附在樹(shù)脂上其他細(xì)胞蛋白被洗脫出來(lái)其他細(xì)胞蛋白被洗脫出來(lái)用含游離的還原型谷胱甘肽的緩沖液洗脫用含游離的還原型谷胱甘肽的緩沖液洗脫融合蛋白被釋放出來(lái)融合蛋白被釋放出來(lái)用凝血蛋白酶切割融合蛋白用凝血蛋白酶切割融合蛋白獲得純化的目的蛋白獲得純化的目的蛋白26位相載體位相載體Ptac：IPTG誘導(dǎo)誘導(dǎo)GST融合蛋白融合蛋白直接純化直接純化產(chǎn)物，切割方便：產(chǎn)物，切割方便： pGEX-1T凝血酶凝血酶 pGEX-2T-凝血酶凝血酶 pGEX-3T-X因子因子融合型載體融合型載體-pGEX系列系列2 2、組氨酸標(biāo)簽表達(dá)載體：、組氨酸標(biāo)簽表達(dá)載體：如如N

20、ovagenNovagen公司的公司的pETpET系系列，可在目標(biāo)蛋白的列，可在目標(biāo)蛋白的N-N-端或端或C-C-端加上端加上6 6個(gè)組氨酸的個(gè)組氨酸的標(biāo)簽和標(biāo)簽和XaXa因子酶切位點(diǎn)，多聚組氨酸能與鎳等二因子酶切位點(diǎn)，多聚組氨酸能與鎳等二價(jià)金屬離子結(jié)合，純化目的蛋白，用價(jià)金屬離子結(jié)合，純化目的蛋白，用XaXa因子處理因子處理可得到純的目的蛋白?？傻玫郊兊哪康牡鞍?。 將將2 2價(jià)重金屬陽(yáng)離子固定在樹(shù)脂上，便可價(jià)重金屬陽(yáng)離子固定在樹(shù)脂上，便可對(duì)帶對(duì)帶HisHis標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行親和層析分離。純化標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行親和層析分離。純化的融合蛋白再用的融合蛋白再用XaXa因子處理可去除標(biāo)簽多肽，從因

21、子處理可去除標(biāo)簽多肽，從而獲得純化的目的蛋白。而獲得純化的目的蛋白。27283 3、內(nèi)含肽表達(dá)載體、內(nèi)含肽表達(dá)載體( (即蛋白質(zhì)內(nèi)含子即蛋白質(zhì)內(nèi)含子, ,是存在于前是存在于前體蛋白質(zhì)中的一段氨基酸序列體蛋白質(zhì)中的一段氨基酸序列) )：如：如NEBNEB公司的公司的Impact-TwinImpact-Twin系統(tǒng)，將目的蛋白放在系統(tǒng)，將目的蛋白放在兩個(gè)可自裂兩個(gè)可自裂解的內(nèi)含肽解的內(nèi)含肽(intein)(intein)中間中間，在得到融合蛋白以后，在得到融合蛋白以后不通過(guò)蛋白酶消解、只需要調(diào)節(jié)不通過(guò)蛋白酶消解、只需要調(diào)節(jié)pHpH值等條件就將值等條件就將標(biāo)簽蛋白切除。標(biāo)簽蛋白切除。4 4、分泌表達(dá)

22、載體：、分泌表達(dá)載體：產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙，產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙，可避免受細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的降解，或使其正確折疊，可避免受細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的降解，或使其正確折疊，或去除或去除N-N-端甲硫氨酸，以維護(hù)活性。端甲硫氨酸，以維護(hù)活性。信號(hào)肽信號(hào)肽(signal peptide)(signal peptide)有堿性磷酸酶信號(hào)肽、蛋有堿性磷酸酶信號(hào)肽、蛋白質(zhì)白質(zhì)A A信號(hào)肽（如信號(hào)肽（如AmershamAmersham公司的公司的pEZZ18pEZZ18系統(tǒng)）。系統(tǒng)）。29分泌型融合表達(dá)載體分泌型融合表達(dá)載體-pEZZ18Plac：Lac啟動(dòng)子啟動(dòng)子Pspa：金黃色葡萄球菌蛋白：金黃色葡萄球菌蛋白A

23、啟動(dòng)啟動(dòng)子子S：蛋白：蛋白A的信號(hào)肽序列的信號(hào)肽序列兩個(gè)合成的兩個(gè)合成的Z功能域（結(jié)合功能域（結(jié)合免疫球免疫球蛋白蛋白G，瓊脂糖層析柱），瓊脂糖層析柱）四、四、 表達(dá)產(chǎn)物的純化表達(dá)產(chǎn)物的純化1 1、包涵體蛋白的純化、包涵體蛋白的純化通過(guò)機(jī)械法、超聲波處理等方法破碎外源蛋白的細(xì)胞通過(guò)機(jī)械法、超聲波處理等方法破碎外源蛋白的細(xì)胞 離心離心 獲得包涵體獲得包涵體 洗滌洗滌 去除包涵體結(jié)去除包涵體結(jié)合的細(xì)胞蛋白合的細(xì)胞蛋白 利用鹽酸胍、尿素和利用鹽酸胍、尿素和SDSSDS等溶解包涵等溶解包涵體體 蛋白質(zhì)重新折疊蛋白質(zhì)重新折疊302 2、可溶性蛋白的純化、可溶性蛋白的純化融合蛋白的表達(dá)標(biāo)簽可用于分離純化目

24、的蛋白融合蛋白的表達(dá)標(biāo)簽可用于分離純化目的蛋白分泌表達(dá)載體也有助于分離純化可溶性的表達(dá)產(chǎn)分泌表達(dá)載體也有助于分離純化可溶性的表達(dá)產(chǎn)物。物?？扇苄缘谋磉_(dá)產(chǎn)物一般可展現(xiàn)應(yīng)有的可溶性的表達(dá)產(chǎn)物一般可展現(xiàn)應(yīng)有的蛋白質(zhì)活性蛋白質(zhì)活性。31不同微生物種類(lèi)所產(chǎn)生的不同微生物種類(lèi)所產(chǎn)生的活性物質(zhì)類(lèi)型活性物質(zhì)類(lèi)型有明顯差有明顯差異，異，不同的研究目標(biāo)應(yīng)選擇不同的宿主菌株。不同的研究目標(biāo)應(yīng)選擇不同的宿主菌株。如如70%70%的抗生素來(lái)源于放線菌，如以尋找抗菌抗腫的抗生素來(lái)源于放線菌，如以尋找抗菌抗腫瘤活性物質(zhì)為目標(biāo)，選擇鏈霉菌為宿主較理想，瘤活性物質(zhì)為目標(biāo)，選擇鏈霉菌為宿主較理想，而篩選新的酶則采用大腸桿菌為宜。

25、而篩選新的酶則采用大腸桿菌為宜。3233 穿梭載體穿梭載體(shuttle vector)(shuttle vector)：能夠在兩類(lèi)不同能夠在兩類(lèi)不同的宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體，的宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體，主要是質(zhì)粒主要是質(zhì)粒，它們至少有它們至少有兩套復(fù)制單元和兩套選擇標(biāo)記兩套復(fù)制單元和兩套選擇標(biāo)記，相當(dāng)于，相當(dāng)于兩個(gè)載體的聯(lián)合。兩個(gè)載體的聯(lián)合。 通常穿梭載體在通常穿梭載體在細(xì)菌細(xì)菌中用于中用于克隆、擴(kuò)增克隆、擴(kuò)增克隆的克隆的基因，在基因，在酵母菌酵母菌中用于中用于基因表達(dá)分析基因表達(dá)分析。 第二節(jié)第二節(jié) 穿梭載體穿梭載體34一、一、大腸桿菌大腸桿菌/ /革蘭氏陽(yáng)性菌穿梭載體革蘭氏陽(yáng)

26、性菌穿梭載體：如向枯草芽：如向枯草芽孢桿菌的穿梭。孢桿菌的穿梭。二、二、大腸桿菌大腸桿菌/ /酵母菌穿梭載體酵母菌穿梭載體：主要用于遺傳學(xué)和：主要用于遺傳學(xué)和真核表達(dá)研究，尤其是當(dāng)?shù)鞍仔枰M(jìn)行真核修飾真核表達(dá)研究，尤其是當(dāng)?shù)鞍仔枰M(jìn)行真核修飾時(shí)，如磷酸化、糖基化等。時(shí)，如磷酸化、糖基化等。三、三、其它穿梭載體其它穿梭載體：如動(dòng)物病毒載體、植物轉(zhuǎn)化的：如動(dòng)物病毒載體、植物轉(zhuǎn)化的TiTi質(zhì)粒、昆蟲(chóng)桿狀病毒等，更為復(fù)雜一些。質(zhì)粒、昆蟲(chóng)桿狀病毒等，更為復(fù)雜一些。第三節(jié)第三節(jié) 整合載體整合載體 當(dāng)外源基因整合到宿主細(xì)胞的染色體后，可以穩(wěn)定當(dāng)外源基因整合到宿主細(xì)胞的染色體后，可以穩(wěn)定地遺傳，進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)定表

27、達(dá)的目的。地遺傳，進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)的目的。整合載體：整合載體：將某個(gè)基因或某些基因?qū)⒛硞€(gè)基因或某些基因插入到染色體中插入到染色體中去的載體。去的載體。根據(jù)整合方式的不同根據(jù)整合方式的不同可分為可分為定點(diǎn)整合定點(diǎn)整合和和隨機(jī)整合隨機(jī)整合。根據(jù)其作用根據(jù)其作用可分為可分為目的基因的插入或敲除目的基因的插入或敲除以及以及隨機(jī)隨機(jī)突變體庫(kù)的構(gòu)建突變體庫(kù)的構(gòu)建。353.1 基因插入基因插入/基因敲除基因敲除 同源重組整合載體同源重組整合載體是最常用的整合載體，該是最常用的整合載體，該載體不僅含有大腸桿菌克隆載體的骨架，更主要載體不僅含有大腸桿菌克隆載體的骨架，更主要的是含有一段的是含有一段便于同源重組的

28、重組便于同源重組的重組DNA片段片段。 363.2 隨機(jī)插入突變載體隨機(jī)插入突變載體 隨機(jī)突變體庫(kù)隨機(jī)突變體庫(kù)指標(biāo)記基因在載體的指標(biāo)記基因在載體的攜帶下通過(guò)攜帶下通過(guò)DNA重組事件重組事件隨機(jī)插入基因組隨機(jī)插入基因組中而形成的突變體的集合。中而形成的突變體的集合。37 （1 1）、微生物插入突變載體）、微生物插入突變載體轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子是一類(lèi)在細(xì)菌的染色體、質(zhì)?；蚴删w之間是一類(lèi)在細(xì)菌的染色體、質(zhì)?；蚴删w之間自行自行移動(dòng)移動(dòng)的遺傳成分的遺傳成分, ,是基因組中一段特異的具有轉(zhuǎn)位特性是基因組中一段特異的具有轉(zhuǎn)位特性的獨(dú)立的的獨(dú)立的DNADNA序列。序列。以以pEG922pEG922為例，其可用于革

29、蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌插入突變體庫(kù)為例，其可用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌插入突變體庫(kù)的構(gòu)建。的構(gòu)建。該載體上含有在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中復(fù)制和選擇的復(fù)制區(qū)該載體上含有在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中復(fù)制和選擇的復(fù)制區(qū)（該復(fù)制區(qū)是溫度敏感型的，在（該復(fù)制區(qū)是溫度敏感型的，在4242下不能復(fù)制）和氯下不能復(fù)制）和氯霉素抗性基因。霉素抗性基因。38插入突變體庫(kù)的構(gòu)建插入突變體庫(kù)的構(gòu)建將裝載了一個(gè)將裝載了一個(gè)四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因的的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子Tn5401Tn5401插入到插入到載體載體pEG922pEG922中中將該載體轉(zhuǎn)化到革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌將該載體轉(zhuǎn)化到革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌轉(zhuǎn)座子發(fā)生一定頻率的轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子發(fā)生一定頻率的轉(zhuǎn)座在在4242下篩

30、選僅有下篩選僅有四環(huán)素抗性的菌落四環(huán)素抗性的菌落得到的菌落就是發(fā)生轉(zhuǎn)座的突變子（由于在高溫下得到的菌落就是發(fā)生轉(zhuǎn)座的突變子（由于在高溫下載體不能復(fù)制，隨著細(xì)胞的分裂，載體就會(huì)丟失，只有載體不能復(fù)制，隨著細(xì)胞的分裂，載體就會(huì)丟失，只有發(fā)生轉(zhuǎn)座事件的菌體才能表現(xiàn)出四環(huán)素抗性的表型。）發(fā)生轉(zhuǎn)座事件的菌體才能表現(xiàn)出四環(huán)素抗性的表型。）392 2、構(gòu)建植物突變體庫(kù)所用的載體、構(gòu)建植物突變體庫(kù)所用的載體 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNAT-DNA插入插入或或植物轉(zhuǎn)座子植物轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽標(biāo)簽是植物基因功能研究中常用的產(chǎn)生突變體的是植物基因功能研究中常用的產(chǎn)生突變體的方法。方法。 （1 1）T-DNAT-DNA插入突變體插入突變體 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNAT-DNA插入到植物基因組插入到植物基因組時(shí)往往會(huì)導(dǎo)致插入位點(diǎn)的基因遭到破壞，從而可時(shí)往往會(huì)導(dǎo)致插入位點(diǎn)的基因遭到破壞，從而可構(gòu)建用于基因功能分析的突變體。構(gòu)建用于基因功能分析的突變體。 40（2 2）植物）植物Ac-DsAc-Ds轉(zhuǎn)座子雙因子插入突變轉(zhuǎn)座子雙因子插入突變這套系統(tǒng)利用玉米的