液相增加柱效提高靈敏的小訣竅學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)1液相增加液相增加(zngji)柱效提高靈敏的小訣柱效提高靈敏的小訣竅竅第一頁，共15頁。環(huán)保環(huán)保(hunbo)樣品樣品: 除草劑除草劑流動相流動相: 52/48 0.1 M乙酸鈉乙酸鈉/甲甲醇醇, pH 6流速流速: 0.45 mL/min溫度溫度(wnd): 40, 90檢測檢測: UV除草劑除草劑: 柱溫的影響柱溫的影響(yngxing)Herbicides: Effect of Column Temperature1. 西瑪津西瑪津2. 敵草隆敵草隆3. 撲滅津撲滅津4. 撲滅凈撲滅凈5. 異丙甲草胺異丙甲草胺1. Simazine2. Diuron3. Propazine4.

2、Prometryn5. etolachlor液相色譜柱液相色譜柱: Zorbax StableBond-C18色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m4090提高柱溫，可增加柱效提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）第1頁/共15頁第二頁，共15頁。生物制藥生物制藥液相色譜液相色譜(s p)柱柱: Zorbax 300 StableBond-C3色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m 肽類肽類/蛋白質(zhì)蛋白質(zhì): 升溫對分離升溫對分離(fnl)的影響的影響Peptides/Proteins: Effect of Elevated Tempera

3、ture樣品樣品: 多肽多肽 流動相流動相: A = 5: 95, 乙腈乙腈 : 水水, 0.10%三氟乙酸三氟乙酸 (V/V%)B = 95: 5, 乙腈乙腈 : 水水, 0.085%三氟乙酸三氟乙酸 (V/V%)梯度梯度: 在在 20 min內(nèi)內(nèi) 15-53%, 后運(yùn)行時間后運(yùn)行時間(shjin) 12 min流速流速: l.0 mL/min 溫度溫度: 室溫室溫 -60檢測檢測: UV 215 nm1. 亮氨酸腦啡呔亮氨酸腦啡呔 2. 血管緊張素血管緊張素II 3. 核糖核酸酶核糖核酸酶A 4. 牛胰島素牛胰島素 5. 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C 6. 溶菌酶溶菌酶 7. 肌紅蛋白肌紅蛋白 8.

4、 碳酸酐酶碳酸酐酶1.Leucine Enkephalin2. Angiotensin II3. Rnase A4. Insulin(BOV)5. Cytochrome C6. Lysozyme7. Myoglobin8. Carbonic anhydrase提高柱溫，提高柱溫，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）第2頁/共15頁第三頁，共15頁。生物制藥生物制藥液相色譜液相色譜(s p)柱柱: Zorbax StableBond-C8色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 150 mm, 5m減小毛細(xì)管內(nèi)徑來提高減小毛細(xì)管內(nèi)徑來提高(t go)低濃度樣品的檢測靈敏度低濃度樣品的檢測靈敏

5、度Reducing Capillary ID to Improve Sensitivityfor Concentration-Limited Samples流動相流動相: 60%乙腈乙腈/40%水水流速流速: 內(nèi)徑內(nèi)徑 0.3 mm-4 uL/min內(nèi)徑內(nèi)徑 0.5 mm-10 uL/min內(nèi)徑內(nèi)徑 1.0 mm-50 uL/min內(nèi)徑內(nèi)徑 4.6 mm-1.0 uL/min溫度溫度(wnd): 室溫室溫檢測器檢測器: UV 254 nm樣品樣品: 200 ng聯(lián)二苯聯(lián)二苯 (100 nl) 減小柱徑，可增減小柱徑，可增加柱效（提高靈加柱效（提高靈敏度）敏度）第3頁/共15頁第四頁，共15頁。

6、色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù)(jsh) 5988-6454EN使用小體積色譜柱對于檢測器響應(yīng)使用小體積色譜柱對于檢測器響應(yīng)時間的重要性時間的重要性 (TE32)液相色譜液相色譜(s p)柱柱: ZORBAX StableBond-C18色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 15 mm 3.5m流動相流動相: 乙腈乙腈: 1%甲酸甲酸(ji sun)=32: 68UV: 254 nm流速流速: 1.0 mL / min. 30C進(jìn)樣量進(jìn)樣量: 5 L響應(yīng)時間響應(yīng)時間: 4.0秒秒響應(yīng)時間響應(yīng)時間: 2.0秒秒響應(yīng)時間響應(yīng)時間: 1.0秒秒響應(yīng)時間響應(yīng)時間: 0.5秒秒響應(yīng)時間響應(yīng)時間: 0.1秒

7、秒1.尿嘧啶尿嘧啶2.乙酰水楊酸乙酰水楊酸3.N-乙酰苯胺乙酰苯胺1.Uracil2.Acetylsalicylic acid3.Acetanilide縮短檢測器響應(yīng)時間縮短檢測器響應(yīng)時間，可增加柱效，可增加柱效 （提（提高靈敏度）高靈敏度）第4頁/共15頁第五頁，共15頁。色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù) ：不同硅膠類型：不同硅膠類型(lixng)比較比較 (TE1)流動流動(lidng)相相: 含含0.05%甲醇的二氯甲烷甲醇的二氯甲烷 液相色譜液相色譜(s p)柱柱1.toluene2.benzanilide3.phenol4.benzyl alcoholZorbax SilSpherisorbZo

8、rbax Rx-Sil1.甲苯甲苯2.N-苯甲酰苯胺苯甲酰苯胺3.苯酚苯酚4.苯甲醇苯甲醇使用高純硅膠，使用高純硅膠，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）第5頁/共15頁第六頁，共15頁。有機(jī)化學(xué)有機(jī)化學(xué) 5988-6366ENpH對苯胺取代物分析對苯胺取代物分析(fnx)的影響的影響 (ORCH1)流動相流動相25mM磷酸磷酸: 甲醇甲醇(ji chn)=58: 42 流速流速: 1 mL/min 22C液相色譜液相色譜(s p)柱柱: ZORBAX StableBond-C18色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m1.對位甲氧基苯胺對位甲氧基苯胺2.間

9、位苯甲胺間位苯甲胺3.3-氨基氨基-苯甲腈苯甲腈4.對位氯苯胺對位氯苯胺5.間位氯苯胺間位氯苯胺6.鄰位氯苯胺鄰位氯苯胺pH: 2.5pH: 7.0改變流動相改變流動相pH，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）第6頁/共15頁第七頁，共15頁。生化生化 肽肽 5988-6293EN三氟乙酸濃度對于三氟乙酸濃度對于(duy)反相肽的分離的影響反相肽的分離的影響 (B10)Peptide流動相流動相: A: 水和三氟乙酸水和三氟乙酸B: 乙腈和三氟乙酸乙腈和三氟乙酸0 - 30% B （30 min.內(nèi)）內(nèi)）流速流速: 1 mL/minUV: 254 nm進(jìn)樣量進(jìn)樣量: 6uL十肽菌素

10、標(biāo)樣十肽菌素標(biāo)樣S1-S5（疏水性有略微（疏水性有略微(lwi)差差異）異）40C液相色譜液相色譜(s p)柱柱: ZORBAX 300 SB-C8色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m1.0%三氟乙酸三氟乙酸0.05%三氟乙酸三氟乙酸0.25%三氟乙酸三氟乙酸改變流動相改變流動相pH，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）第7頁/共15頁第八頁，共15頁。食品分析食品分析 5988-6360EN流動相強(qiáng)度對單糖和二糖分離流動相強(qiáng)度對單糖和二糖分離(fnl)的影響的影響 (FD4)流動流動(lidng)相相: 乙腈乙腈/水如圖水如圖流速流速: 1 mL/mi

11、n示差折光檢測器示差折光檢測器液相色譜液相色譜(s p)柱柱: ZORBAX NH2 色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m1.果糖果糖2.葡糖葡糖3.蔗糖蔗糖4.Palatinose5.海藻糖海藻糖6.異麥芽糖異麥芽糖乙腈乙腈/水水70/30乙腈乙腈/水水75/25 改變有機(jī)相改變有機(jī)相%，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）第8頁/共15頁第九頁，共15頁。色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù) 5988-6468EN有機(jī)有機(jī)(yuj)改性劑和改性劑和pH對于選擇性的影對于選擇性的影響響 (TE5)流動流動(lidng)相相: 25 mM磷酸緩沖液磷酸緩沖液流速流速:

12、1.0 mL/min.22C液相色譜液相色譜(s p)柱柱: ZORBAX StableBond-CN色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m1.anisidine2.m-toluidine3.4-cl-aniline4.3-aminobenzonitrile5.3-cl-aniline6.2-cl-aniline1.甲氧基苯胺甲氧基苯胺2.間位苯甲胺間位苯甲胺3.4-氯氯-苯胺苯胺4.3-氨基苯甲腈氨基苯甲腈5.3-氯氯-苯胺苯胺6.2-氯氯-苯胺苯胺42%甲醇甲醇 ：58%緩沖液緩沖液 30%甲醇甲醇 ：70%緩沖液緩沖液pH 2.6pH 3.0改變有機(jī)相改變有機(jī)相

13、%，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）第9頁/共15頁第十頁，共15頁。色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù)(jsh) 5988-6453ENZORBAX Eclipse系列色譜柱的選系列色譜柱的選擇性擇性 (TE31)液相色譜液相色譜(s p)柱柱: ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m流動流動(lidng)相相: 甲醇甲醇 : 水水=70: 30UV: 254 nm流速流速: 1.0 mL / min.室溫室溫Zorbax Eclipse XDB-苯基苯基Zorbax Eclipse XDB-C8Zorbax Ec

14、lipse XDB-C181.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.4-氯氯-硝基苯硝基苯4.甲苯甲苯5.萘萘1.Uracil2.Phenol3.4-Cl-nitrobenzene4.Toluene5.Naphthalene改變鍵合相，改變鍵合相，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）第10頁/共15頁第十一頁，共15頁。生物制藥生物制藥液相色譜液相色譜(s p)柱柱: Zorbax Extend-C18色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 2.1 x 150 mm, 5um三氟乙酸和氫氧化銨用于肽類三氟乙酸和氫氧化銨用于肽類RP-HPLCESI-MS分離分離(fnl)的選擇性比較的選擇性比較Se

15、lectivity Comparison of TFA and NH4OH for Peptide RP-HPLCESI-MS Analysis流速流速: 0.25 mL/min. 溫度溫度(wnd): 25 梯度梯度: 5-60% B in 20 min.LC/MS: 正離子正離子, ESI- Vf 70V, Vcap 4.5 kV, N2- 35 psi, 12 L/min., 300樣品樣品: 4L (各各50 ng)三氟乙酸條件三氟乙酸條件: A- 0.1%三氟乙酸水溶液三氟乙酸水溶液B-0.085%三氟乙酸三氟乙酸 80%的乙腈溶液的乙腈溶液NH4OH條件條件: A- 20 mM N

16、H4OH水溶液水溶液B- 20 mM NH4OH 80%的乙腈溶的乙腈溶液液改變有機(jī)添加劑，改變有機(jī)添加劑，可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）第11頁/共15頁第十二頁，共15頁。生化生化 肽肽 十肽菌素十肽菌素 5988-6299EN酸對于酸對于(duy)反相肽的分離的影響反相肽的分離的影響(B16)decapeptide液相色譜液相色譜(s p)柱柱: ZORBAX 300 SB-C8 色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m1.十肽菌素十肽菌素 S12.十肽菌素十肽菌素 S23.十肽菌素十肽菌素 S34.十肽菌素十肽菌素 S45.十肽菌素十肽菌素 S

17、51.decapeptide S1 2.decapeptide S2 3.decapeptide S3 4.decapeptide S4 5.decapeptide S50.1% 三氟乙酸三氟乙酸0.025 M H3PO4改變有機(jī)改變有機(jī)(yuj)添加添加劑劑可增加柱效可增加柱效（提高靈敏度）（提高靈敏度）流動相流動相: A: 含相應(yīng)的酸的水相含相應(yīng)的酸的水相 B: 含相應(yīng)的酸的乙腈含相應(yīng)的酸的乙腈 0%-30% B（30 min.內(nèi)）內(nèi)）進(jìn)樣量進(jìn)樣量: 6L肽標(biāo)樣肽標(biāo)樣UV: 254 nm流速流速: 1 mL/min40C第12頁/共15頁第十三頁，共15頁。色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù)(jsh)

18、流動相對色譜的影響流動相對色譜的影響(TE40)液相色譜液相色譜(s p)柱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8色譜色譜(s p)柱尺寸柱尺寸: 4.6 x 50 mm 3.5mUV: 254 nm流速流速(li s): 1 mL/ min.室溫室溫1.Uracil2.Butylparaben3.Naphthalene4.Dipropylphthalate5.Acenaphthene1.尿嘧啶尿嘧啶2.尼帕爾金丁酯尼帕爾金丁酯3.萘萘4.二丙基鄰苯二甲酸酯二丙基鄰苯二甲酸酯5.苊苊刻度混合刻度混合: Dial-a-Mix A: 水水 B: 甲醇甲醇, 用泵抽取用泵抽取50% B體積比混合體積比混合: Vol