生物工藝學 培養(yǎng)基及制備

1、第三章 培養(yǎng)基及制備第一節(jié) 培養(yǎng)基選擇和配制的原則培養(yǎng)基定義：是提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的、按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。適宜大規(guī)模發(fā)酵的培養(yǎng)基應(yīng)該具備的共同特點：培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的含量和組成能夠滿足菌體生長和產(chǎn)物合成的需求發(fā)酵副產(chǎn)物盡可能地少培養(yǎng)基原料價格低廉，性能穩(wěn)定，資源豐富，便于運輸和采購培養(yǎng)基的選擇應(yīng)能滿足總體工業(yè)的要求一、培養(yǎng)基的類型和用途1根據(jù)來源，可分為天然、合成和半合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基是采用化學成分不清楚或化學成分不恒定的各種植物、動物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)（例扣牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨等）制成的。合成培養(yǎng)基是使用化學成分和數(shù)

2、量完全了解的物質(zhì)配制而成的，成分精確，重復(fù)性強，可以減少不能控制因素。半合成培養(yǎng)基（semidefined medium）為既含有天然成分又含有純化學試劑的培養(yǎng)基。從物理形狀培養(yǎng)基又可分為液體、固體和半固體培養(yǎng)基。2根據(jù)主要成分或使用目的可分為基礎(chǔ)、增殖、鑒別和選擇培養(yǎng)鑒別培養(yǎng)基（differential medium）是培養(yǎng)基中加有能與某一菌的無色代謝物發(fā)生顯然反應(yīng)的指示劑，從而用肉眼區(qū)別于該菌與其他菌。選擇培養(yǎng)基（selected medium）是根據(jù)某種生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學、物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。3根據(jù)生產(chǎn)工藝的要求可分為孢子、種子和發(fā)酵培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基（spore m

3、edium）是供制備孢子用的培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基是滿足菌種生長的培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基是滿足大生產(chǎn)中大量菌體生長和繁殖以及代謝產(chǎn)物積累的營養(yǎng)基質(zhì)。二、培養(yǎng)基的選擇發(fā)酵培養(yǎng)基選擇的依據(jù)：不同的微生物對培養(yǎng)基的需求是不同的，因此，不同微生物培養(yǎng)過程對原料的要求也是不一樣的。1根據(jù)微生物的特點選擇培養(yǎng)基要依據(jù)微生物的不同特性，來考慮培養(yǎng)基的組成，對典型的培養(yǎng)基配方需作必要的調(diào)整。2根據(jù)發(fā)酵方式選擇培養(yǎng)基工業(yè)上，利用液體培養(yǎng)基進行的深層發(fā)酵具有發(fā)酵效率高，操作方便，便于機械化、自動化，降低勞動強度，占地面積小，產(chǎn)量高等優(yōu)點。而固體培養(yǎng)基則常用于微生物菌種的保藏、分離、菌落特征鑒定、活細胞數(shù)測定等方面。3從生

4、產(chǎn)實踐和科學試驗的不同要求選擇種子培養(yǎng)基主要是供微生物菌體的生長和大量增殖。要求營養(yǎng)豐富、完全，氮源、維生素的比例應(yīng)較高，所用的原料也應(yīng)是易于被微生物菌體吸收利用。常用葡萄糖、硫酸銨、尿素、玉米漿、酵母膏、麥芽汁、米曲汁等作為原料配制培養(yǎng)基。而發(fā)酵培養(yǎng)基除需要維持微生物菌體的正常生長外，主要是要求合成預(yù)定的發(fā)酵產(chǎn)物，碳源物質(zhì)的含量往往要高于種子培養(yǎng)基。如果產(chǎn)物是含氮物質(zhì)，應(yīng)相應(yīng)地增加氮源的供應(yīng)量。4從經(jīng)濟效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料必須以價廉、來源豐富、運輸方便、就地取材以及沒有毒性等為原則選擇原料。三、培養(yǎng)基的配制原則1根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基根據(jù)不同生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件、生物合成

5、的代謝途徑、代謝產(chǎn)物的化學性質(zhì)等確定培養(yǎng)基。2營養(yǎng)成分的恰當配比微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)之間應(yīng)有適當?shù)谋壤囵B(yǎng)基中的碳氮的比例（C/N）的積累；氮源不足，則微生物菌體生長過于緩慢。碳源供應(yīng)不足時，容易引起微生物菌體的衰老和自溶。不同的微生物菌種、不同的發(fā)酵產(chǎn)物所要求的碳氮比是不同的。3滲透壓營養(yǎng)物質(zhì)的濃度太低，不僅不能滿足微生物生長對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，而且也不利于提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，濃度過高時，培養(yǎng)基溶液的滲透壓太大，會抑制微生物的生長。培養(yǎng)基中各種離子的比例需求要平衡。在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，在不影響微生物的生理特性和代謝轉(zhuǎn)化率的情況下，通常趨向在較高濃度下進行發(fā)酵，以提高產(chǎn)物產(chǎn)量，并盡可能選育高滲透

6、壓的生產(chǎn)菌株。4pH值一般霉菌和酵母菌比較適于微酸性環(huán)境，放線菌和細菌適于中性或微堿性環(huán)境。當培養(yǎng)基配制好后，若pH值不合適，必須加以調(diào)節(jié)。同時加入緩沖劑，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值。5氧化還原電位對于厭氧菌，由于氧的存在對其有毒害作用，因而往往在培養(yǎng)基中加入還原劑以降低氧化還原電位。除應(yīng)注意以上幾條原則外，還要考慮到營養(yǎng)成分的加入順序，為了避免生成沉淀而造成營養(yǎng)成分的損失，加入的順序一般為先加入緩沖化合物，溶解后加入主要物質(zhì)，然后加入維生素、氨基酸等生長素類的物質(zhì)。4、 培養(yǎng)基成分配比的選擇1.菌體的同化能力 2.代謝物的阻礙與誘導(dǎo)作用 3.合適的碳氮比由于碳既做碳架又作能源，所以用量要比氮多。從

7、元素分析來看，酵母細胞中碳氮比約為100:20，霉菌約為100:10。一般發(fā)酵工業(yè)中碳氮比約為100: (0.22.0)，但在氨基酸發(fā)酵中，碳氮比就相對高一些。如谷氨酸發(fā)酵的C:N = 100: (1521)。培養(yǎng)基各成分用量的多少，大部分是根據(jù)經(jīng)驗而來。但有些主要代謝產(chǎn)物因為它們的代謝途徑較清楚，所以根據(jù)物料平衡計算來加以確定。如酒精發(fā)酵100kg淀粉理論上可以產(chǎn)酒精(kg)第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵工業(yè)中，必須使用廉價的原料來配制培養(yǎng)基，使之盡可能地滿足下列條件：消耗每克底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率；能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體的濃度；能得到產(chǎn)物的最大速率；副產(chǎn)品的得率最??；價廉并具有穩(wěn)

8、定的質(zhì)量；來源豐富且供應(yīng)充足；通氣和攪拌、提取、純化、廢物處理等生產(chǎn)工藝過程都比較容易。用甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、谷物淀粉等作為碳源，用銨鹽、尿素、硝酸鹽、玉米漿及發(fā)酵的殘余物作為氮源。除了能滿足生長和產(chǎn)品形成的要求外，培養(yǎng)基也會影響到pH值的變化、泡沫的形成、氧化還原電位和微生物的形態(tài)。在培養(yǎng)基中，有時也需要添加前體物質(zhì)或代謝的抑制劑，有時需加促進劑，以促進產(chǎn)物的形成。一、工業(yè)上常用的碳源普遍以碳水化合物作為碳源。玉米淀粉，馬鈴薯、木薯淀粉。淀粉可用酸法或酶法水解產(chǎn)生葡萄糖，滿足生產(chǎn)使用。表3-2 工業(yè)上常用的碳源及來源碳 源來 源葡萄糖乳 糖淀 粉蔗 糖純葡萄糖、水解淀粉純?nèi)樘?、乳清粉大麥、?/p>

9、生粉、燕麥粉、黑麥粉、大豆粉等甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗紅糖、精白糖等大麥經(jīng)發(fā)芽制成麥芽，除了淀粉外，麥芽還含有許多糖分。麥芽是啤酒生產(chǎn)的主要原料。蔗糖一般來自甘蔗或甜菜，在發(fā)酵培養(yǎng)基中常用的甜菜或甘蔗糖蜜是在糖精制作過程中留下的殘液。用于生產(chǎn)疫苗的培養(yǎng)基，通常是用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白質(zhì)作為碳源。酒精、簡單的有機酸、烷烴等含碳物質(zhì)在發(fā)酵過程中作為碳源，雖然它們的價格比相等數(shù)量的粗碳水化合物要昂貴很多，但由于純度較高，便于發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物的回收和精制。甲烷、甲醇和烷徑已經(jīng)用于微生物菌體的生產(chǎn)，例如將甲醇作為底物生產(chǎn)單細胞蛋白，用烷徑進行有機酸、維生素等的生產(chǎn)。二、工業(yè)上常用的氮源工業(yè)生產(chǎn)上所用的微

10、生物都能利用無機或有機氮源，無機氮源包括氨水、銨鹽或硝酸鹽等；有機氮源包括玉米漿（corn steep liquor, CSL）、豆餅粉、花生餅粉、棉籽粉、魚粉、酵母浸出液等。其功能是構(gòu)成菌體成分，作為酶的組成分或維持酶的活性，調(diào)節(jié)滲透壓、pH值、氧化還原電位等。表3-4 工業(yè)上常用的氮源及含氮量（質(zhì)量分數(shù)）/%氮 源含氮量氮 源含氮量大 麥甜菜糖蜜甘蔗糖蜜玉 米 漿1.52.01.52.01.52.04.5花生粉燕麥粉大豆粉乳清粉8.01.52.08.04.5三、無機鹽無機鹽是微生物生命活動所不可缺少的物質(zhì)。其主要功能是構(gòu)成菌體成分、作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓、調(diào)

11、節(jié)pH值和氧化還原電位等。微生物對無機鹽的需要量很少。但無機鹽含量對菌體生長和產(chǎn)物的生成影響很大。1磷酸鹽磷是某些蛋白質(zhì)和核酸的組成成分。腺二磷（ADP）、腺三磷（ATP）是重要的能量傳遞者，參與一系列的代謝反應(yīng)。磷酸鹽在培養(yǎng)基中還具有緩沖作用。微生物對磷的需要量一般為0.0050.01mol/L。工業(yè)生產(chǎn)上常用K3PO4·3H2O、K3PO4和Na2HPO4·12H2O、Na2HPO4·2H2O等磷酸鹽，也可用磷酸。K3PO4·3H2O含磷13.55%，當培養(yǎng)基中配用11.5g/L時，磷濃度為0.00440.0066mol/L。2硫酸鎂鎂是某些細菌的葉

12、綠素的組成分。是許多重要的酶（如己糖磷酸化酶、異檸檬酸脫氫酶、羧化酶等）的激活劑。革蘭陽性菌對Mg2+的最低要求量是25mg/L。革蘭陰性菌為45mg/L。硫存在于細胞的蛋白質(zhì)中，是含硫氨基酸的組成分。硫是構(gòu)成一些酶的活性基。培養(yǎng)基中的硫已在硫酸鎂中供給。3鉀鹽鉀是許多酶的激活劑。菌體生長需鉀量約為0.1g/L，谷氨酸生成需鉀量為0.21.0g/L。鉀對谷氨酸發(fā)酵有影響，鉀鹽少長菌體，鉀鹽足夠產(chǎn)谷氨酸。4微量元素微生物需要量十分微小，但又是不可缺少的，例如錳是某些酶的激活劑，鐵是細胞色素氧化酶、過氧化氫酶的成分，又是若干酶的激活劑。一般作為碳、氮源的農(nóng)副產(chǎn)物天然原料中，本身就含有某些微量元素，

13、不必另加。汞和銅離子，具有明顯的毒性，必須避免有害離子加入培養(yǎng)基中。四、生長因子通常指微生物生長不可缺少的而且需要量很小微，但微生物自身不能合成或合成不足以滿足機體生長需要的有機化合物。生長因子不是所有微生物都必需的，它只是對于某些自己不能合成這些成分的微生物才是必不可少的營養(yǎng)物。1生物素生物素的作用主要影響谷氨酸產(chǎn)生菌細胞的通透性，同時也影響菌體的代謝途徑。大量合成谷氨酸所需要的生物素濃度比菌體生長的需要量低，即為菌體生長需要的“亞適量”。一般為5g/L左右。2維生素B1（硫胺素）維生素B1對某些谷氨酸菌種的發(fā)酵有促進作用。3提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料(1)玉米漿 玉米漿是用亞硫酸浸泡玉米而

14、得的浸泡液的濃縮物，也是玉米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)品。一般用量為0.4%0.8%。玉米漿主要用作氮源，但它含有乳酸、少量還原糖和多糖，含有豐富的氨基酸、核酸、維生素、無機鹽等，因此常用作為提供生長因子的物質(zhì)。(2)麩皮水解液 可以代替玉米漿，但蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分比玉米漿少。用量一般為1%（干麩皮計）左右。(3)糖蜜 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜均可代替玉米漿。但氨基酸等有機氮含量較低。甘蔗糖蜜用量為0.1%0.4%。(4)酵母 可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。五、前體物質(zhì)和促進劑為了進一步大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)率，還需要添加某些特殊功用的物質(zhì)。這些物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進微生物的

15、生長。例如某些氨基酸、抗生素、核苷酸和酶制劑的發(fā)酵需要添加前體物質(zhì)、促進劑、抑制劑及中間補料等。1前體物質(zhì)某些化合物加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但產(chǎn)物的量卻因加入而有較大的提高。在一定條件下前體物質(zhì)可控制生產(chǎn)菌的合成方向和增加抗生素的產(chǎn)量。表3-7 氨基酸發(fā)酵的前體物質(zhì)氨基酸菌 株前體物質(zhì)產(chǎn)率/%絲 氨 酸色 氨 酸色 氨 酸蛋 氨 酸異亮氨酸異亮氨酸蘇 氨 酸嗜甘油棒狀桿菌異常漢遜酵母麥角菌脫氮極毛桿菌粘質(zhì)賽桿菌阿氏棒狀桿菌(Corynamagasahi)谷氨酸小球菌甘氨酸氨茴酸吲 哚2-羥基4-甲基硫代丁酸-氨基丁酸D-蘇

16、氨酸高絲氨酸1.60.81.31.10.81.52.0但要注意這些前體加入過多對菌體會產(chǎn)生毒性。表3-8 抗生素發(fā)酵常用的前體物質(zhì)抗生素前體物質(zhì)抗生素前體物質(zhì)青霉素G青霉素O青霉素V鏈霉素苯乙酸或在發(fā)酵中能形成苯乙酸的物質(zhì)，如乙基酰胺等烯丙基-硫基乙酸苯氧乙酸肌醇、精氨酸、甲硫氨酸金霉素溴四環(huán)素紅霉素灰黃霉素放線菌素C3氯化物溴化物丙酸、丙醇、丙酸鹽、乙酸鹽氯化物肌氨酸前體物質(zhì)的利用往往與菌種的特性和菌齡有關(guān)。當前體物質(zhì)是合成過程中的限制因素時，前體物質(zhì)加入量越多，抗生素產(chǎn)量就越高。但前體物質(zhì)的濃度越大，利用率越低。故一次加入量不宜過大。一般采取間隙分批添加或連續(xù)滴加的方法加入。2發(fā)酵過程中的

17、促進劑和抑制劑在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入某些對發(fā)酵起一定促進作用的物質(zhì)，稱為促進劑或刺激劑。誘導(dǎo)物、表面活性劑及其他一些產(chǎn)酶促進劑，可以大大增加菌體的產(chǎn)酶量。誘導(dǎo)物，一般的誘導(dǎo)物是相應(yīng)酶的作用底物或一些底物類似物，“啟動”微生物內(nèi)的產(chǎn)酶機構(gòu)。促進劑可大大地增加某些微生物酶的產(chǎn)量。促進劑有各種表面活性劑（洗凈劑、吐溫80、植酸等）、二乙胺四乙酸、大豆油抽提物、黃血鹽、甲醇等。0.1%LS洗凈劑，蛋白酶0.02%1%的植酸鹽的產(chǎn)酶量。葡萄糖氧化酶（EDTA）大豆油抽提物，蛋白酶、脂肪酶，促進劑能促進產(chǎn)量增加的原因主要是改進了細胞的滲透性，同時增強了氧的傳遞速度，改善了菌體對氧的有效利用。在不同的情況下，不

18、同的促進劑所起的作用也各不相同。生長因素的作用推遲菌體的自溶，有的是抑制了某些合成其他產(chǎn)物的途徑而使之向所需產(chǎn)物的途徑轉(zhuǎn)化；降低了生產(chǎn)菌的呼吸，改善通氣效果，與抗生素形成復(fù)鹽。促進劑的專一性較強，往往不能相互套用。第三節(jié) 淀粉水解糖的制備大多數(shù)的微生物都不能直接利用淀粉，在氨基酸、抗生素、有機酸、有機溶劑等的生產(chǎn)中，都要求將淀粉進行糖化，制成淀粉水解糖使用。將淀粉水解為葡萄糖的過程稱為淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。在淀粉水解糖液中，葡萄糖、麥芽糖和蛋白質(zhì)、脂肪分解產(chǎn)物在發(fā)酵中易被各種菌利用；而一些低聚糖類、復(fù)合糖等雜質(zhì)則不能被利用。工業(yè)原料的水解糖液，必須具備以下條件：糖液中還原糖的含量

19、要達到發(fā)酵用糖濃度的要求。糖液潔凈，是杏黃色或黃綠色，有一定的透光度。糖液中不含糊精。糖液不能變質(zhì)。淀粉水解糖的意義：很多微生物都不能直接利用淀粉，因為它們不含淀粉酶和糖化酶，因此，在發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須將淀粉水解為葡萄糖，才能供發(fā)酵使用。淀粉水解：淀粉糊精低聚糖麥芽糖葡萄糖糖化過程：淀粉吸水溶脹糊化糖化一、淀粉水解糖的制備方法：酸解法、酸酸法、酸酶法、雙酶法淀粉水解糖的原料很多，主要有薯類、玉米、小麥、大米等含淀粉原料。水解淀粉為葡萄糖的方法有下列三種。1酸解法它是以酸（無機酸或有機酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。具有生產(chǎn)方便、設(shè)備要求簡單、水解時間短、設(shè)備生產(chǎn)能力大等

20、優(yōu)點。要求有耐腐蝕、耐高溫、耐高壓的設(shè)備。尚有副反應(yīng)的發(fā)生，這將造成葡萄糖的損失而使淀粉的轉(zhuǎn)化率降低。淀粉顆粒不宜過大，大小要均勻。顆粒大，易造成水解不透徹；淀粉乳濃度也不宜過高，濃度高，淀粉轉(zhuǎn)化率低。2酶解法是用專一性很強的淀粉酶及糖化酶將淀粉水解為葡萄糖的工藝。利用-淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)化為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個過程稱為液化。利用糖化酶將糊精及低聚糖進一步水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖，這個過程在生產(chǎn)中稱為糖化。優(yōu)點如下：酶解反應(yīng)條件較溫和。不需耐高溫、高壓、耐酸的設(shè)備。微生物酶作用的專一性強，淀粉水解的副反應(yīng)少，因而水解糖液的純度高，淀粉轉(zhuǎn)化率（出糖率）高?？稍谳^高淀粉乳濃度下水解，而且

21、可采用粗原料。用酶解法制得的糖液顏色淺，較純凈，無異味，質(zhì)量高，有利于糖液的充分利用。但酶解反應(yīng)時間較長（48h），需要的設(shè)備較多，需要具有專門培養(yǎng)酶的條件。3酸酶結(jié)合法酸酶結(jié)合水解法是集中酸法和酶解法制糖的優(yōu)點而采用的結(jié)合生產(chǎn)工藝。(1)酸酶法 是先將淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶將其水解成葡萄糖的工藝。此法的優(yōu)點是酸液化速度快，糖化時可采用較高的淀粉乳濃度，提高生產(chǎn)效率。酸用量少，產(chǎn)品顏色淺，糖液質(zhì)量高。DE值表示淀粉水解的程度，指的是葡萄糖（所測的還原糖都以葡萄糖計算）占干物質(zhì)的百分比。(2)酶酸法 將淀粉乳先用-淀粉酶液化到一定的程度，然后用酸水解成葡萄糖的工藝?？刹捎么衷?/p>

22、淀粉，淀粉濃度較酸法要高，生產(chǎn)易控制，時間短，而且酸水解時pH值可稍高些，以減輕淀粉水解副反應(yīng)的發(fā)生。從水解糖液的質(zhì)量和降低糖耗、提高原料利用率方面來考慮，酶解法最好，其次是酸酶法，酸法最差。時間來看，酸法最短，酶解法最長。二、淀粉酸水解原理1淀粉水解過程中的變化(C6H10O5)n(C6H10O5)sC12H22O11C6H12O6 淀粉 各種糊精麥芽糖 葡萄糖2淀粉水解反應(yīng)動力學于是水解的速率只決定于淀粉的濃度，反應(yīng)則屬于單分子反應(yīng)的一級化學反應(yīng)類型。其反應(yīng)速率常數(shù)k可由下式推算式中c0 水解開始的濃度；ct 經(jīng)過t時間后反應(yīng)的濃度； (c0 ct ) 經(jīng)過t時間后，所剩下的未起反應(yīng)的濃度

23、；t 時間。k愈高，則反應(yīng)速度愈快。水解速度等于反應(yīng)速率常數(shù)k與濃度(c0 ct )的乘積。式中a催化劑的活性常數(shù)cN酸性物質(zhì)的摩爾濃度（當量濃度）多糖的水解性常數(shù)溫度對水解速率影響的常數(shù)淀粉水解所用的催化劑的種類、濃度、反應(yīng)溫度均對水解反應(yīng)速度有很大的影響。3葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)在淀粉的酸水解過程中，水解生成的葡萄糖受到酸和熱的催化影響，能通過糖苷鍵相聚合，失掉水分，生成二糖、三糖和其他低聚糖，這種反應(yīng)稱為復(fù)合反應(yīng)。復(fù)合反應(yīng)相聚合，并不是經(jīng)過a-1，4鍵聚合成麥芽糖，而是經(jīng)過a-1，6鍵聚合成異麥芽糖和經(jīng)過-1，6鍵聚合成龍膽二糖。復(fù)合反應(yīng)是有害的，它降低葡萄糖的收率，而且水解液中多數(shù)復(fù)合糖并不

24、能被微生物利用。4葡萄糖的分解反應(yīng)葡萄糖受到酸和熱的影響發(fā)生分解反應(yīng)，生成5-羥甲基糠醛。5-羥甲基糠醛是產(chǎn)生色素的根源，有色物質(zhì)的存在，將增加糖化液精制的困難。三、淀粉酸水解工藝1淀粉酸水解的工藝流程淀粉原料水調(diào)漿糖化冷卻中和、脫色過濾除雜糖液鹽酸2淀粉酸水解條件的控制及對糖液質(zhì)量的影響(1)淀粉乳濃度的選擇 淀粉乳的濃度越低，水解液的葡萄糖值越高，色澤越淡。(2)酸的種類和用量 許多酸對淀粉的水解反應(yīng)均有催化作用，但工業(yè)上普遍使用的是催化效率較高的鹽酸、硫酸及草酸。一般用鹽酸量占干淀粉的0.6%0.7%，pH值調(diào)至1.5左右。(3)糖化的壓力和時間 淀粉水解是用蒸汽直接進行加熱的，溫度與壓

25、力為相同的指標，溫度隨壓力升高而升高。壓力與水解反應(yīng)速率成正比，壓力升高，水解反應(yīng)速度加快。為要加快水解速度，可采用增大水解反應(yīng)壓力的方法。當糖液的葡萄糖值達到最高點后既不再上升，相反會隨著糖化時間的延長而稍有下降。如果不及時放料，勢必事倍功半。圖3-1 酸糖化曲線3糖化設(shè)備結(jié)構(gòu)對糖液質(zhì)量的影響糖化鍋的容量一般不宜過大。不宜鍋體太高，不宜鍋體太矮。糖化鍋徑高比1:1.5左右。糖化鍋的附屬管道應(yīng)保證進出料迅速，物料受熱均勻，有利于升壓，有利于消滅死角，盡量縮短加料、放料、升溫、升壓等輔助時間。4水解糖液的中和脫色除雜(1)中和 需經(jīng)冷卻才能進行中和。調(diào)節(jié)pH值，使糖液中膠體物質(zhì)析出，便于過濾除去

26、。生產(chǎn)中使用的中和劑有純堿和燒堿。純堿（Na2CO3）溫和，糖液質(zhì)量好，但產(chǎn)生的泡沫多，使用燒堿，濃度過高易造成局部過堿，葡萄糖焦化而產(chǎn)生焦糖。保持pH值在4.65.0之間。中和溫度為6070。(2)脫色、除雜 方法有活性炭吸附法、離子交換法、新型磺化煤脫色。a.活性炭表面積大，有無數(shù)微小的孔隙，它可將雜質(zhì)、塵埃、色素吸附掉；同時，活性炭也有過濾作用?；钚蕴课焦に嚭唵?，脫色效果好，操作容易。一般活性炭用量相當干淀粉量的0.6%0.8%。脫色溫度一般為65。b.離子交換樹脂，具有選擇性強，脫色效果較好，便于管道化、連續(xù)化及自動化操作，減輕勞動強度的優(yōu)點。c.新型磺化煤不同于一般的磺化煤，它具有

27、粒度細（40120目）、脫色力強的特點。這種磺化煤尚可直接用于淀粉糖化。在淀粉加酸糖化時，加入淀粉量1.8%的磺化煤粉一起糖化。濾液透光率達97%98%。(3)壓濾 壓濾溫度不宜過高，蛋白質(zhì)等膠體物質(zhì)沉淀不完全。而采用低溫過濾，由于糖液黏度增大，又會發(fā)生過濾困難。一般采用6070溫度壓濾為適宜。四、雙酶水解法制糖酶法制糖以作用專一性的酶制劑作為催化劑將淀粉轉(zhuǎn)化為糖的工藝。反應(yīng)條件溫和、復(fù)合和分解反應(yīng)減少，不僅可以提高淀粉的轉(zhuǎn)化率及糖液的濃度，而且還可大幅度地改善糖液的質(zhì)量。主要包括液化和糖化兩個步驟。雙酶法制糖的工藝流程：淀粉乳 一次液化 二次液化 糖化 一次脫色 一次過濾 二次脫色二次過濾

28、低糖 陽離子 交換柱 三次濃縮蒸發(fā) 高糖(1) 液化液化原因：淀粉晶體結(jié)構(gòu)對酶作用的抵抗力很強，故需先破壞其晶體結(jié)構(gòu)。1淀粉酶的水解作用淀粉雙酶水解法包括液化和糖化兩個步驟，均是在酶的作用下完成的。淀粉的液化是在a-淀粉酶的作用下完成的。水解中間地段的a-1，4鍵，斷裂發(fā)生在C1O之間。直鏈淀粉分子水解產(chǎn)物為葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖。枝鏈淀粉還有異麥芽糖及含有a-1，6糖苷鍵的低聚糖。2淀粉液化的條件及液化程度的控制(1)淀粉的糊化與老化淀粉的老化實際上是分子間氫鍵已斷裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氫鍵的過程，也就是復(fù)結(jié)晶過程。淀粉酶很難進入老化淀粉的結(jié)晶區(qū)起作用，必須采用相應(yīng)的措施控制糊化淀

29、粉的老化。(2)液化的方法與選擇液化的分類方法很多，分為酸法、酸酶法、酶法，間歇式、半連續(xù)式和連續(xù)式，管式、罐式、噴射式。糖液，其黏度的高低會直接影響或決定后道發(fā)酵、提取工藝的難易，因此這種糖液的過濾速度一定要求特別快。通常選用一次加酶或兩次加酶的蒸汽噴射液化法較為合適。3蒸汽噴射液化工藝及條件(1)工藝流程調(diào)漿配料一次噴射液化液化保溫二次噴射高溫維持二次液化 9597 145 9597 酶解 滅酶 酶解冷卻（糖化）特點：利用噴色器將蒸汽噴入淀粉乳的薄膜，在短時間內(nèi)通過噴色器快速升溫至145完成糊化、液化，使形成的不溶性淀粉顆粒在高溫下分散，從而使所得的液化液既透明又易于過濾，淀粉的出糖率也高

30、，同時采用真空閃急冷卻，提高了液化液的第濃度。(2)淀粉液化條件每種酶都有最適的作用溫度和pH值范圍，而且pH和溫度是互相依賴的，一定溫度下有較適宜的pH值。圖3-3 a-淀粉酶活力與pH值的關(guān)系圖3-4 a-淀粉酶活力與溫度的關(guān)系酶活力的穩(wěn)定性還與保護劑有關(guān)，一般控制鈣離子濃度0.01mol/L。鈉離子為了加速淀粉液化速度，多采用較高溫度液化，8590或者更高，但是溫度升高時，酶活力損失加快。(3)液化程度控制液化程度太低，液化液的黏度就大，難于操作。淀粉易老化，不利于糖化，過濾性相對較差。液化程度也不能太高，不利于糖化酶與液化淀粉生成絡(luò)合結(jié)構(gòu)，使糖化液的最終DE值偏低。底物分子過大或過小都

31、會妨礙酶的結(jié)合和水解速度?？刂频矸鬯獬潭仍谄咸烟侵禐?020之間為好（即此時保持較多量的糊精及低聚糖，較少量的葡萄糖）。為避免液化酶對糖化酶的影響，一般液化結(jié)束，升溫到100保持10min即可完成，然后降低溫度。(二)糖化1糖化酶的水解作用 糖化酶對底物的作用是從非還原性末端開始，屬于外酶，產(chǎn)生葡萄糖。糖化酶對-1，4和-1，6糖苷鍵都能進行水解。糖化酶制劑用量決定于酶活力高低。酶活力高，則用量少；液化液濃度高，加酶量要多。生產(chǎn)上采用30%淀粉時，用酶量按80100U/g淀粉計。當葡萄糖值達到最高時，應(yīng)當停止酶反應(yīng)（可加熱至80，20min滅酶），否則葡萄糖值將由于葡萄糖經(jīng)-1，6糖苷鍵起復(fù)

32、合反應(yīng)而降低。復(fù)合反應(yīng)發(fā)生的程度與酶的濃度及底物濃度有關(guān)。酶濃度過高反而能促使復(fù)合反應(yīng)的發(fā)生，底物濃度（既液化液濃度）大，也使復(fù)合反應(yīng)增強。必須控制糖化酶的用量及糖化底物的性質(zhì)。糖化的溫度和pH值決定于所用糖化劑的性質(zhì)。曲霉糖化酶，溫度為60，pH值4.05.0；根霉糖化酶一般在55，pH值5.0。根據(jù)酶的特性，盡量選用較高的溫度糖化，這樣糖化速度快些，也可減少雜菌污染的可能性。采用較低的pH值可使糖化液顏色淺，便于脫色。黑曲霉3912-12的酶制劑，糖化在5064，pH值4.34.5下進行；根霉3092糖化酶，糖化在5458，pH值4.35.0下進行，UV-11糖化酶，在pH值3.54.2，

33、5560溫度下糖化。在糖化過程中加入能水解1,6糖苷鍵的葡萄糖苷酶，并選用較高的糖化pH值（6.06.2），抑制糖化酶催化復(fù)合反應(yīng)的作用，可提高葡萄糖的產(chǎn)率。2糖化工藝條件及控制其工藝過程如下：液化糖化滅酶過濾貯糖計量發(fā)酵酸調(diào)pH值至4.24.5，降溫至60，加入糖化酶，60保溫數(shù)小時后。用無水酒精檢驗無糊精存在時，pH值調(diào)至4.85.0，同時加熱到90，保溫30min，溫度較低到6070時開始過濾，濾液進入貯罐備用。五、水解糖液的質(zhì)量要求現(xiàn)用現(xiàn)制備，以保證水解糖液的新鮮、純凈。糖液貯桶一定要保持清潔，防止酵母菌等浸入滋生。貯糖桶內(nèi)設(shè)置加熱管加熱，使水解糖液保持5060，防止酵母菌等的滋生。1

34、 淀粉水解糖的質(zhì)量對發(fā)酵的影響淀粉水解不完全，有糊精存在，不僅造成浪費，發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫，甚至引起染菌的危險。若淀粉水解過度，葡萄糖發(fā)生復(fù)合反應(yīng)生成龍膽二糖、異麥芽糖，葡萄糖分解反應(yīng)生成羥甲基糠醛，與氨基酸作用生成類黑素。不僅造成浪費，而且還抑制菌體生長。當糖液中和、過濾時除去不徹底，培養(yǎng)基中含有蛋白質(zhì)及水解產(chǎn)物時，會使發(fā)酵液產(chǎn)生大量泡沫，造成逃液和染菌。水解糖液中含生物素量不同會影響發(fā)酵過程中生物素量的控制。2淀粉制糖過程考察指標(1)葡萄糖的理論收率淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的理論收率為(2)實際收率葡萄糖的實際收率不能達到理論收率，而僅有100%左右。(3)淀粉轉(zhuǎn)化率(4)葡萄糖值DE值 表

35、示淀粉糖的含糖量(5)DX值 糖化液中葡萄糖含量占干物質(zhì)的百分率為DX值。第四節(jié) 糖蜜原料一、糖蜜原料的分類指制糖工業(yè)上的廢糖蜜，它是甘蔗糖廠或甜菜糖廠的一種副產(chǎn)品。糖蜜是一非結(jié)晶糖分，本身含有相當數(shù)量的發(fā)酵性糖，因此是生物工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的良好原料。糖蜜分為甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜和高級糖蜜等。甘蔗糖蜜中含有30%36%的蔗糖和20%轉(zhuǎn)化糖。甜菜糖蜜含蔗糖5%，轉(zhuǎn)化糖1%。高級糖蜜，硫酸或酵母轉(zhuǎn)化酶處理，可使糖濃度提高70%85%。粗糖蜜；葡萄糖蜜。二、糖蜜原料的性質(zhì)和組成糖蜜的外觀是一種黏稠、黑褐色、呈半流動狀的物體，pH值5.5左右，相對密度1.43。除含有發(fā)酵性的糖分外，還含有膠體物質(zhì)、灰分、維生素、氨基酸。甘蔗糖蜜中的生物素較甜菜糖蜜中高。（見表3-16）三、糖蜜的預(yù)處理預(yù)處理是指澄清處理和脫鈣處理。1糖蜜澄清處理的目的糖蜜中由于含有大量的灰分和膠體，不但影響菌體生長，也影響產(chǎn)品的純度，致使發(fā)酵中產(chǎn)生大量的泡沫。一般有加酸法、加熱加酸法和添加絮凝劑澄清處理法幾種。2谷氨酸發(fā)酵中糖蜜的預(yù)處理谷氨酸發(fā)酵中，使用生物素缺陷型菌株，發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物素為5g/L左右，而糖蜜中特別是甘蔗糖蜜中的生物素含量為110g/g，必須想方設(shè)法降低糖蜜中生物素含量。一般有活性炭處