生化反應(yīng)曲線

1、 1 生化生化反應(yīng)曲線反應(yīng)曲線 2生化分析基本原理生化分析基本原理 生化反應(yīng)曲線生化反應(yīng)曲線內(nèi)容概況內(nèi)容概況 3羅氏生化分析系統(tǒng)產(chǎn)品線羅氏生化分析系統(tǒng)產(chǎn)品線Cobas 6000 (c501) 600T/HModular D 2400T/HModular P 800T/HCobas c311300T/HCobas c111180T/HCobas 8000 2000T/H 4cobascobas 8000 8000 模塊化組合分析系統(tǒng)模塊化組合分析系統(tǒng) 智能、高效、智能、高效、強(qiáng)勁強(qiáng)勁 5物質(zhì)對(duì)光吸收的基本定律物質(zhì)對(duì)光吸收的基本定律 Lambert- Beer定律 LambertBeer定律表達(dá)為

2、: 當(dāng)一束平行的單色光通過(guò)含有均勻吸光物質(zhì)的溶液時(shí),溶液的吸光度(A)與溶液的濃度(C)和光透過(guò)液層厚度(L)的乘積成正比。物質(zhì)對(duì)光吸收的吸光系數(shù)（e）為常數(shù)。 其數(shù)學(xué)表達(dá)式：A = e*C*L I入射光透射光I0= = =-光吸收的基本定律光吸收的基本定律= =light detector 6根據(jù)根據(jù)Lambert- BeerLambert- Beer定律來(lái)計(jì)算待測(cè)物濃度定律來(lái)計(jì)算待測(cè)物濃度如若吸光系數(shù) ( )未知，我們就需要采用定標(biāo)曲線 來(lái)計(jì)算待測(cè)物的濃度。 濃度 (amount of substance)吸光度 (amount of color)40123456706050302010C

3、alibrator/standard 標(biāo)準(zhǔn)品 (cfas)待測(cè)樣本Concx =Concx = Abs Absx x x x ConcsConcs AbssAbssConcxConcx = 待測(cè)樣本濃度ConcConcs s = 標(biāo)準(zhǔn)品濃度 AbsxAbsx = 樣本吸光度AbssAbss = 標(biāo)準(zhǔn)品吸光度此值為定值 7 Lambert-Beer 定律 適合于任何均勻非散射的介質(zhì) 生化比色分析特定蛋白透射比濁分析Lambert-Beer 定律分光光度法定量分析的依據(jù)分光光度法定量分析的依據(jù) 8Roche Hitachi PhotometerRoche Hitachi Photometer 9

4、當(dāng)相應(yīng)的比色杯每一次通過(guò)光路系統(tǒng)時(shí)，光路系統(tǒng)會(huì)測(cè)量并記錄下相應(yīng)的吸光度 光路系統(tǒng)可以測(cè)量后分光后12個(gè)波長(zhǎng)的相應(yīng)吸光度。12 有效波長(zhǎng): 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm 多數(shù)檢測(cè)項(xiàng)目都使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)方法。（可去除干擾物對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響）Reaction sequenceReaction sequence 10 11 12儀器讀數(shù)的原理不同儀器每個(gè)循環(huán)周期的時(shí)間間隔Modular P 1818秒秒Cobas c702 1616秒秒Cobas C501 8 8秒秒Modular D 1212秒秒C311 12

5、 12秒秒反應(yīng)轉(zhuǎn)盤(pán)不停的周期旋轉(zhuǎn)當(dāng)相應(yīng)的比色杯通過(guò)光路系統(tǒng)時(shí)，光路系統(tǒng)會(huì)測(cè)量并記錄下相應(yīng)的吸光度在不同的時(shí)間點(diǎn)加入相應(yīng)的反應(yīng)試劑 13Reaction sequenceReaction sequence 14Instrument cycleInstrument cycle 15Endpoint and rate (kinetic) assaysEndpoint and rate (kinetic) assays自動(dòng)生化分析常用的方法有自動(dòng)生化分析常用的方法有: : 終點(diǎn)法（終點(diǎn)法（End Point AssaysEnd Point Assays）：一般在整個(gè)反應(yīng)完成后再來(lái)檢測(cè)吸光度 速率法（速

6、率法（Rate assaysRate assays） ：一般在反應(yīng)的過(guò)程中監(jiān)測(cè)吸光度的變化情況 16終點(diǎn)分析法終點(diǎn)分析法時(shí)間吸光度A 1tS+R1 基于基于 被測(cè)物質(zhì)在反應(yīng)過(guò)程中被測(cè)物質(zhì)在反應(yīng)過(guò)程中到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)，根據(jù)該點(diǎn)吸光度的大小求出被測(cè)物濃度，稱(chēng)為終點(diǎn)法根據(jù)該點(diǎn)吸光度的大小求出被測(cè)物濃度，稱(chēng)為終點(diǎn)法。 終點(diǎn)法的計(jì)算：終點(diǎn)法的計(jì)算： 從從時(shí)間時(shí)間- -吸光度曲線吸光度曲線來(lái)看，到達(dá)反來(lái)看，到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，吸光度將不再變化應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，吸光度將不再變化。在達(dá)。在達(dá)到終點(diǎn)時(shí)任取一點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)底到終點(diǎn)時(shí)任取一點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)底物和產(chǎn)物的量都不再變化。物和產(chǎn)物的量都不再變

7、化。吸光度A 1S+R1吸光度 17 兩點(diǎn)終點(diǎn)法（兩點(diǎn)終點(diǎn)法（2-point end2-point end） 一點(diǎn)終點(diǎn)法一點(diǎn)終點(diǎn)法 （1-point end1-point end）一點(diǎn)終點(diǎn)單試劑（一點(diǎn)終點(diǎn)單試劑（1-point endpoint assay one reagent1-point endpoint assay one reagent）一點(diǎn)終點(diǎn)雙試劑（一點(diǎn)終點(diǎn)雙試劑（1-point endpoint assay two reagents1-point endpoint assay two reagents） 三點(diǎn)終點(diǎn)法（三點(diǎn)終點(diǎn)法（3 3- -point endpoint end）

8、終點(diǎn)分析法（終點(diǎn)分析法（Endpoint assaysEndpoint assays） 18兩點(diǎn)終點(diǎn)法兩點(diǎn)終點(diǎn)法 在被測(cè)物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開(kāi)始時(shí)，選擇第一在被測(cè)物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開(kāi)始時(shí)，選擇第一個(gè)吸光度，在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)或平衡時(shí)選擇第二個(gè)吸光度，個(gè)吸光度，在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)或平衡時(shí)選擇第二個(gè)吸光度，此兩點(diǎn)吸光度之差用于計(jì)算結(jié)果。此兩點(diǎn)吸光度之差用于計(jì)算結(jié)果。 19去除了樣本的本底采用兩個(gè)測(cè)量點(diǎn) 針對(duì)兩個(gè)或多個(gè)試劑的項(xiàng)目第一個(gè)讀數(shù)點(diǎn)一般選在添加最后一個(gè)試劑之前第二個(gè)讀數(shù)點(diǎn)一般選在加入最后一個(gè)試劑之后且已經(jīng)達(dá)到了反應(yīng)終點(diǎn)兩點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)兩點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)C + D (顯色產(chǎn)物)+ B1 (試劑1) +

9、 B2 (試劑 2)A A (樣本)Endpoint assaysEndpoint assays 20兩點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線兩點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線Cobas c702Cobas c702Endpoint assaysEndpoint assaysSample+R1Mp1 abs before addition of R3Mp2 abs at reaction end 21兩點(diǎn)讀數(shù)的時(shí)間點(diǎn):第19點(diǎn)測(cè)量包含了樣本和試劑1的本底 sample + reagent 1 第 38點(diǎn)在加入所有試劑后，反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn) sample + reagent 1+ reagent 2兩點(diǎn)終點(diǎn)法的應(yīng)用參數(shù)兩點(diǎn)終點(diǎn)法的應(yīng)用

10、參數(shù) Cobas c702 Cobas c702測(cè)量的兩個(gè)讀數(shù)點(diǎn)方法類(lèi)型總反應(yīng)時(shí)間（min）2Point Endpoint assay application settings2Point Endpoint assay application settings 22RF-II C4 C3 ASL CRPL IGG IGA IGM兩點(diǎn)終點(diǎn)法分析項(xiàng)目舉例兩點(diǎn)終點(diǎn)法分析項(xiàng)目舉例Endpoint assaysEndpoint assays 23一點(diǎn)終點(diǎn)法一點(diǎn)終點(diǎn)法A單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法例如:CHOL/TG. 在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)，即在時(shí)間在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)，即在時(shí)間- -吸光度曲線上吸光度不再吸光度曲線上吸光度不再

11、改變時(shí)選擇一個(gè)終點(diǎn)吸光度值，用于計(jì)算結(jié)果。改變時(shí)選擇一個(gè)終點(diǎn)吸光度值，用于計(jì)算結(jié)果。B雙試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法Mg(雙試劑) 24單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)（單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)（1-point endpoint assay one reagent1-point endpoint assay one reagent） 不包含樣本的本底 僅進(jìn)行一個(gè)點(diǎn)的測(cè)量檢測(cè)項(xiàng)目舉例：甘油三酯（TG）Endpoint assaysEndpoint assaysA (樣本) C + D (顯色產(chǎn)物)+ B (試劑) 25單單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線1-point endpoint assay 1-p

12、oint endpoint assay oneone reagents reagentsEndpoint assaysEndpoint assays 26 不包含樣本的本底 僅進(jìn)行一點(diǎn)測(cè)量應(yīng)用項(xiàng)目舉例： Magnesium不采用兩點(diǎn)終點(diǎn)法主要是樣本和R1體積相加仍180uL(最小反應(yīng)體積，無(wú)法測(cè)量）雙試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)（雙試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)（1-point endpoint assay two reagents1-point endpoint assay two reagents）C + D (product)+ B1 (reagent 1) + B2 (reagent 2)A A (sa

13、mple) 27 1st entry: 方法類(lèi)型 2nd entry:總分析時(shí)間 3rd - 6th entry:測(cè)量點(diǎn) 一點(diǎn)終點(diǎn)法應(yīng)用參數(shù)（一點(diǎn)終點(diǎn)法應(yīng)用參數(shù)（1 Point Endpoint assay1 Point Endpoint assay）Utility - Application - AnalyzeUtility - Application - Analyze 28 TRIGL CHO 一一點(diǎn)終點(diǎn)法分析項(xiàng)目舉例點(diǎn)終點(diǎn)法分析項(xiàng)目舉例Endpoint assaysEndpoint assays 29例如例如, ,多項(xiàng)同測(cè)組合試劑盒多項(xiàng)同測(cè)組合試劑盒,CHO,CHO與與TGTG同一測(cè)定

14、同一測(cè)定 即雙終點(diǎn)法即雙終點(diǎn)法, ,在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)的終點(diǎn)法測(cè)定的終點(diǎn)法測(cè)定. .三點(diǎn)終點(diǎn)法三點(diǎn)終點(diǎn)法 30上升 increasing 或 下降decreasing終點(diǎn)法反應(yīng)的方向（終點(diǎn)法反應(yīng)的方向（Reaction DirectionReaction Direction） 31 速率法速率法 吸光度tt2t1t3t4A1A2A3S+R時(shí)間A 1 利用線性反應(yīng)期，計(jì)算出單位時(shí)間的吸光度變化A/min，來(lái)計(jì)算酶的活性。單位時(shí)間的吸光度變化量是一致的 在酶促反應(yīng)過(guò)程中在酶促反應(yīng)過(guò)程中, ,在反應(yīng)速度恒定期在反應(yīng)速度恒定期( (線性反應(yīng)期線性反應(yīng)期)

15、)來(lái)連續(xù)觀察和記錄一定來(lái)連續(xù)觀察和記錄一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)底物或代謝產(chǎn)物變化速度的化學(xué)方法反應(yīng)時(shí)間內(nèi)底物或代謝產(chǎn)物變化速度的化學(xué)方法. . 32速率速率A A法法 （Rate ARate A）兩點(diǎn)速率法（兩點(diǎn)速率法（2-point Rate2-point Rate）速率法（速率法（Endpoint assaysEndpoint assays） 33 速率速率A A法法A 單試劑速率法例如:ACPAFUB 雙試劑速率法 例如:ALTASTCK 在較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi),每隔一定時(shí)間讀取一次吸光度值,至少讀取4點(diǎn),得到3個(gè)A,求出單位時(shí)間的反應(yīng)速率 A/min . .通過(guò)最小二乘法（least squar

16、es method） 34Rate A assay Modular PRate A assay Modular PReag. at R3 timingLast mp1st. mpSample Reag. at R1 timingRate assaysRate assays 35GOT/ASTGGTGPT/ ALT LipaseALPGLDHAmylaseLDHCHECKMB 速率速率A A 法法- -分析項(xiàng)目舉例分析項(xiàng)目舉例EnzymesRate assaysRate assays 36 2 2點(diǎn)速率法點(diǎn)速率法 2點(diǎn)速率法尿素氮 指在時(shí)間指在時(shí)間- -吸光度曲線上選擇兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)，此兩點(diǎn)既非反應(yīng)

17、初始吸光吸光度曲線上選擇兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)，此兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度亦度亦非終點(diǎn)吸光度，這兩點(diǎn)的單位時(shí)間吸光度差值用于結(jié)果計(jì)算。非終點(diǎn)吸光度，這兩點(diǎn)的單位時(shí)間吸光度差值用于結(jié)果計(jì)算。 372-point Rate assay2-point Rate assayRate assaysRate assaysC + D (product)+ B1 (reagent 1) + B2 (reagent 2)A A (sample)Enzyme 38采用一種或多種試劑檢測(cè)兩個(gè)測(cè)量點(diǎn)檢測(cè)固定的間隔時(shí)間內(nèi)兩點(diǎn)的吸光度變化。 換算成 Abs/min參與計(jì)算在加入最后最后一個(gè)試劑之后進(jìn)行吸光度檢測(cè)。兩點(diǎn)速率法的特點(diǎn)兩點(diǎn)速

18、率法的特點(diǎn)2-point Rate assay2-point Rate assayRate assaysRate assays 392-point Rate assay Modular P2-point Rate assay Modular PRate assaysRate assays 40AmmoniaAcid phosphataseNon-prostatic phosphataseUrinary/CSF protein BicarbonateUreaRate assaysRate assays2 2點(diǎn)速率點(diǎn)速率 法法- -分析項(xiàng)目舉例分析項(xiàng)目舉例 41Reaction DirectionReaction Direction上升decreasing 或 下降increasing 生化反應(yīng)曲線生化反應(yīng)曲線 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57Thank you for your attentio